CN114196562B - 一株具有降低血糖功效的凝结芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株具有降低血糖功效的凝结芽孢杆菌，其保藏号为CCTCC NO：M2019738。本发明所提供的凝结芽孢杆菌在制备降血糖制品中的应用。本发明还提供一种降血糖制品，所述的制品中包含有凝结芽孢杆菌VHProbi C08株和/或凝结芽孢杆菌VHProbi C08的发酵产物。更进一步的，所述的凝结芽孢杆菌VHProbi C08株的培养基中所使用的碳源为低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉中的任一种或几种。本发明所提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08具有降血糖的功效，STZ小鼠诱导的高血糖模型小鼠使用本发明提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08菌株进行治疗，其高血糖症状较安慰剂组显著减轻，有效缓解高血糖症状。

Description

一株具有降低血糖功效的凝结芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有降低血糖功效的凝结芽孢杆菌及其应用。
背景技术
糖尿病(Diatetes)是一种由多种因素叠加引起的以慢性高血糖为主要特征的代谢紊乱性疾病。血液中血糖高位持续运行会给眼、心脏、血管等造成慢性损害和功能障碍，最终引起患者失明、尿毒症、脑中风和心梗等并发症，危及生命安全。根据世界卫生组织公布的数据显示，到2017年，中国的糖尿病患者已经位居世界首位，人数达到1.1亿，占到中国成年人总数的十分之一。
益生菌是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物，能够产生确切的健康功效从而改善宿主的微生态平衡，发挥有益作用。 2001年，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对益生菌做了如下定义：在摄入足够数量的情况下，对宿主产生健康益处的活性微生物。
越来越多的证据表明，益生菌对于人体的健康影响不仅局限于肠道，还有更广泛的作用范围，如内分泌平衡调节、免疫平衡调节、神经系统调节、呼吸系统调剂等。益生菌或可通过影响粘膜免疫机制、与共生菌或潜在致病性微生物相互作用、产生短链脂肪酸等代谢产物以及通过化学信号与宿主细胞相互作用等方式影响来改善宿主的血糖水平。
近年关于益生菌调节机体血糖的研究和报道有所出现，例如过公开号为CN104432001A的中国发明专利公开了一种可食用的益生菌培养物组合物，能调节肠道菌群降血糖等功效；公开号为CN105039217A的中国发明专利公开了一种益生菌降血糖制剂，由三种益生菌发酵制成，在动物试验中具有降血糖功效；公开号为CN106619743A的中国发明专利公开了一种具有降血糖作用的益生菌固体饮料及制备方法，由益生菌和益生元复配制成；公开号CN111084385A 的中国发明专利公开了一种具有降血糖功效的益生菌功能性食品，由4种乳酸菌及其辅料制备而成。因此，目前公开的益生菌降血糖都是不同菌属的多菌株按比例复配添加益生元制成的。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有降低血糖功效的凝结芽孢杆菌及其应用，所提供的凝结芽孢杆菌能有效缓解高血糖症状。
本发明一方面涉及一株凝结芽孢杆菌，命名为凝结芽孢杆菌VHProbi C08(Bacillus coagulans VHProbi C08)，已于2019年9月23日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019738。
本发明所提供的凝结芽孢杆菌在制备降血糖制品中的应用。
本发明还提供一种降血糖制品，所述的制品中包含有凝结芽孢杆菌VHProbi C08株和/或凝结芽孢杆菌VHProbi C08的发酵产物；
更进一步的，所述的凝结芽孢杆菌VHProbi C08株的培养基中所使用的碳源为低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、菊粉(Inulin)中的任一种或几种。
本发明所提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08具有降血糖的功效，STZ小鼠诱导的高血糖模型小鼠使用本发明提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08菌株进行治疗，其高血糖症状较安慰剂组显著减轻，有效缓解高血糖症状。
本发明所提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08自身即可达到降血糖功效，此外经碳源代谢试验和全基因组测序证实该菌株具备降血糖的潜在代谢途径。因此，由该菌株制成的降血糖益生菌制剂菌株功效明确，无需复配额外的益生菌。
本发明提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08，对机体无毒害作用，可添加食品中，制备成具有降血糖功效的功能性食品，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1凝结芽孢杆菌VHProbi C08不同益生元和葡萄糖下的生长速率图；
图2凝结芽孢杆菌VHProbi C08全蛋白质谱图；
图3凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因长度分布图；
图4凝结芽孢杆菌VHProbi C08 COG统计结果图；
图5凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组圈图；
图6凝结芽孢杆菌VHProbi C08与各菌株之间基因组Pan基因集venn图；
图7各菌株间基于CorePan1分析结果系统进化树图；
图8各菌株间基于Genefamily1分析结果系统进化树图；
图9小鼠空腹血糖水平变化图，其中*代表与阳性组相比P<0.05。
具体实施方式
本发明所述凝结芽孢杆菌VHProbi C08(Bacillus coagulans VHProbi C08) 筛选自酸白菜样品，已于2019年9月23日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019738。
凝结芽孢杆菌VHProbi C08不产生溶血素，不会溶解血细胞，对常见抗生素敏感，生物安全性良好；能够耐受较高的盐度，最大耐受盐浓度为7％；能在较广阔的温度范围内生长，并且能产生耐热性很强的孢子，方便该益生菌株后期工业化加工；体外细胞表面疏水性为8.58％，对肠道细胞具有粘附性。
凝结芽孢杆菌VHProbi C08具备较强的抗氧化功能，其中对DPPH自由基清除率为87.80％，HRS自由基清除率为47.79％；上清液抗脂质过氧化抑制率为84.46％，菌体抗脂质过氧化抑制率为44.88％。
凝结芽孢杆菌VHProbi C08具备较强的降解胆固醇能力，其中体外胆固醇降解率达到39.21％；在高血脂小鼠模型中，用本发明提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08喂食模型鼠30天后预处理组血液胆固醇水平降低了约34％，后处理组血液胆固醇水平降低了约10％；40天后，凝结芽孢杆菌VHProbi C08 预处理组血液胆固醇水平降低了约39％，后处理组血液胆固醇水平降低了约 30％，效果非常显著。
凝结芽孢杆菌VHProbi C08能有效预防和缓解腹泻，抑制肠蠕动。给大鼠连续服用凝结芽孢杆菌VHProbi C08 7天后，能有效延迟腹泻时间，减少粪便量。凝结芽孢杆菌VHProbi C08代谢产生的有机酸等代谢产物能够抑制有害菌的生长，促进肠道对营养物质的消化和吸收，恢复肠道的微生物屏障功能，刺激机体免疫功能，缩短疾病病程。
下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述。
实施例1凝结芽孢杆菌VHProbi C08利用3种不同益生元和葡萄糖的代谢试验
(一)生长速率试验
1.试验方法：
称取蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5mL；蒸馏水100mL，调pH7.4±0.2后121℃高压灭菌15min，作为基础培养基。分别配制10g/100mL的葡萄糖(Glucose)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)和菊粉(Inulin)溶液并用0.22μm的无菌过滤器进行过滤。在无菌条件下，向96 孔板中加入20μL除菌后的糖溶液，每种糖溶液4个平行，然后加入170μL灭菌后的基础培养基，再加入10μL接种液，不接菌反应孔作为对照。每孔加入 50μL液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。放入酶标仪中，40℃培养，测量吸光度OD600。
2.试验结果：
凝结芽孢杆菌VHProbi C08首先在含有FOS的培养基中OD600达到0.5，在含有葡萄糖的培养基中几乎同时达到该值，其次是在含有菊粉和GOS的培养基中。凝结芽孢杆菌VHProbi C08首先在含有FOS的培养基中出现平台期，其次是在含有葡萄糖、菊粉和GOS的培养基中，其中在含FOS和葡萄糖的培养基中出现平台期的时间非常接近，且明显早于另外两种培养基。因此，凝结芽孢杆菌VHProbi C08在含有FOS益生元和葡萄糖的培养基中生长速率相当。实验结果如附图1所示。
(二)MALDI-TOF-MS检测凝结芽孢杆菌VHProbi C08在3种不同益生元及葡萄糖的全蛋白表达
1.试验方法：
称取蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5mL；蒸馏水100mL，调pH7.4±0.2后121℃高压灭菌15min，作为基础培养基。分别配制10g/100mL的葡萄糖(Glucose)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)和菊粉(Inulin)并用0.22μm的无菌过滤器过滤后分别加入基础培养基中。
按照0.1％的接种量在培养基中接种新鲜菌液，40℃，150rpm培养24h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分，然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。利用Autofms 1000分析软件通过“谱图列表”和“列表标峰”将4 个谱图同时呈现在一个列表中。
2.试验结果：
结果如附图2所示，从上至下依次为凝结芽孢杆菌VHprobi C08在葡萄糖、 FOS、GOS和菊粉下的生长全蛋白图谱。从附图2可以看出，除葡萄糖以外，凝结芽孢杆菌VHprobiC08还能代谢利用FOS、GOS和菊粉三种益生元，其代谢产物中蛋白质的种类整体相近但又各有不同。相对于FOS，其它三种作为碳源时代谢产生的蛋白质种类更为接近。凝结芽孢杆菌VHProbi C08在以菊粉或 FOS为碳源的培养基中，代谢产物中蛋白质浓度比较接近，且明显高于其它两种碳源的培养基。凝结芽孢杆菌VHProbi C08在这四种培养基产生的代谢产物中，分子量5KD以下的小蛋白种类都比较多，在GOS和菊粉为碳源的代谢产物中，分子量在5KD～10KD的蛋白种类相对较多，在GOS培养基中，代谢产生分子量大于10KD的蛋白种类明显多于其他三种培养基。
分子量约为4830D的蛋白在以葡萄糖、GOS和菊粉为碳源的代谢产物中浓度相对较高，而在以FOS为碳源的代谢物中几乎没有；分子量约5300D的蛋白在以GOS为碳源的代谢物中浓度相对较低，而在其他三种代谢物中则相对较高；分子量约2738D的蛋白只在以葡萄糖为碳源的代谢物中有较少量的存在；另外，分子量约9670D、7480D和3955D的蛋白质在不同的代谢产物中浓度存在明显不同，推测编码这几种蛋白的基因与代谢有关。
以上结果说明，FOS、GOS和菊粉这三种不同类型的益生元都能够被凝结芽孢杆菌VHprobi C08利用，并能促进其增殖。这种益生菌和益生元的组合有利于凝结芽孢杆菌在肠道中的定植，从而为发挥益生功能奠定基础。在以FOS、GOS和菊粉这三种益生元为碳源时，凝结芽孢杆菌VHprobi C08能够代谢产生一些不同分子量的蛋白质，这些蛋白质或可在肠道内发挥抵抗病原体，调节免疫、增加矿物质吸收，改善肠道功能，影响代谢和饱腹感等功能，从而具有调节血糖功效的潜在益生作用。
实施例2凝结芽孢杆菌VHProbi C08的全基因组测序及比较基因组分析结果
1.测序方法：
1.1 BGISEQ测序平台
提取凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组DNA并随机打断，电泳回收所需长度的DNA片断，并加上接头进行cluster制备，最后上机测序。
1.2PacBio测序平台
凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组DNA首先被g-TUBE处理成适当大小的片段，然后片段进行损坏修复和末端修复，DNA片段两端都被接上发夹结构的接头从而形成一个哑铃结构，哑铃结构与聚合酶混合后用于测序。
2.测序数据分析方法
2.1测序数据：
对各测序平台的原始下机数据进行低质量过滤，从而获得可用数据用于后续分析。
2.2组装：
基于各测序平台可用数据，对测序样品进行基因组预估、序列组装、结果评价等分析，最终得到测序样品基因组序列；
2.3基因组组分分析：
获得样品组装序列后，对样品基因组中各功能元件进行预测，包括基因成分、重复序列、非编码RNA等；
2.4基因功能分析：
预测出基因后，需要对基因进行数据库比对注释，通过序列相似性给予各基因功能及描述信息。
2.5比较基因组学分析：
基于测序样品基因组序列、基因集序列同参考序列进行比较，从而展现测序样品与参考序列的差异及进化关系，此分析包括共有基因和特有基因、基因家族、物种进化。
3.测序结果及分析预测
3.1.基因组组装结果
基因组全长3,666,784bp，环状，GC含量为46.24％。
3.2.基因成分分析结果
对凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组进行基因预测，得到菌株基因组的开放阅读框及基因长度分布，具体统计结果见表1。
表1基因统计
Figure BDA0002707940250000081
基因长度分布图见图3，横坐标为基因长度，纵坐标为基因长度对应的基因数目。
3.3.非编码RNA分析结果
凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组上tRNA、rRNA、sRNA三种非编码RNA，预测结果见表2。
表2非编码RNA统计
Figure BDA0002707940250000091
3.4重复序列分析结果
凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组重复序列预测结果见表3。
表3重复序列统计
Figure BDA0002707940250000092
Figure BDA0002707940250000101
3.5 COG数据库注释
COG统计结果见图4。丰富的糖转运代谢相关蛋白及大量功能未知蛋白提示凝结芽孢杆菌VHProbi C08可能具有更出色的代谢多样性及环境适应性。
3.6基因组圈图
根据凝结芽孢杆菌VHProbi C08基因组序列，使用(G–C)/(G+C)计算方法进行GCskew分析，同时根据基因分布、非编码RNA分布、注释等数据结果在基因组上展示各元件分布情况，见图5。
4.比较基因组学
4.1共有基因和特有基因
分析比较B.coagulans VHProbi C08、B.coagulans DSM、B.coagulans GBI-30、B.coagulans HM-08之间的共有基因和特有基因，各菌株基因集情况及Core、Pan基因分析统计结果见表4、表5。各菌株之间基因组Pan基因集venn图见图6。
表4菌株基因统计表
Figure BDA0002707940250000102
Figure BDA0002707940250000111
表5 CorePan基因蛋白统计表
Figure BDA0002707940250000112
说明：CoreGene Num，共有基因数目；CoreGene Size，共有基因长度；PanGeneNum，所有非冗余基因数目；PanGene Size，所有非冗余基因长度； Dispensable Num，非必要基因数目；Dispensable Size，非必要基因长度。
凝结芽孢杆菌VHProbi C08的总基因数目及必要基因数目显著多于其它三种比较菌株，提示这些特有基因可能与该菌株的功能特性具有密切的关联。
4.2基因家族
分析比较凝结芽孢杆菌VHProbi C08、B.coagulans DSM、B.coagulans GBI-30、B.coagulans HM-08之间的基因家族，分析结果见表6。
表6基因家族统计表
Figure BDA0002707940250000113
Figure BDA0002707940250000121
说明：Gene Number，各菌株基因数目；Clustered Gene，能够聚类到基因家族的基因数目；UnClustered Gene，未被聚类到任何家族的基因；Family Num，菌株基因家族数目；Unique Family，菌株特有基因家族数目。
4.3物种进化
基于凝结芽孢杆菌VHProbi C08、B.coagulans DSM、B.coagulans GBI-30、B.coagulans HM-08菌株之间的CorePan1分析结果构建进化树，进化树结果见图7。
基于凝结芽孢杆菌VHProbi.C08、B.coagulans DSM、B.coagulans GBI-30、B.coagulans HM-08菌株之间的GeneFamily1分析结果构建进化树，进化树结果见图8。
通过全基因测序，我们在凝结芽孢杆菌VHProbi C08中发现一个功能未知蛋白(VHProbi C08GL003330)，与脂筏特征蛋白Flotillin具有相似的SPFH结构域，而后者与胰岛素信号传导中的CAP/CbⅠ通路关系密切，能参与调节胰岛素刺激的葡萄糖的转运与吸收。推测该蛋白或许凝结芽孢杆菌VHProbi C08 的降血糖功能具有关联性。
此外，我们还发现了一条完整的维生素K合成途径，其相关蛋白详见表7。维生素K被认为在控制血糖方面能起到积极的作用。
表7维生素K合成相关基因统计表
Figure BDA0002707940250000131
实施例3：凝结芽孢杆菌VHProbi C08对血糖水平的影响
1实验材料
1.1实验动物
雄性8周龄的BALB/c小鼠，SPF级，24只，体重150-200g。由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号SCXK(鲁)20190003。
动物检疫和标识：所有动物到达后，适应期至少一周，进行检疫观察，观察动物的活动、饮食等表现，动物在试验前需检查合格，合格的动物方可用于试验。动物检疫合格后，给每只动物指定一个单一的动物号，在动物尾部加以标记。检疫观察期笼卡上标明专题编号、动物号、笼号、性别、动物接收日期和专题负责人；分组后，笼卡上标明专题编号、动物号、笼号、性别、组别、试验起止日期和专题负责人。
实验动物饲养管理的环境条件：室温20～26℃，日温差≤4℃，相对湿度 40～70％，明暗交替时间为12/12h。动物饲养于标准大鼠笼具中，每笼6只。动物饲料、饮水：自由摄食、饮水。饲料为SPF级大小鼠生长繁育饲料，由济南朋悦实验动物繁育有限公司(批号：20190905)提供。饮用水是经过高温消毒的城市自来水。
1.2试剂耗材及仪器
链脲霉素(STZ)(批号：S0130-50MG)，SIGMA-Aldrich。柠檬酸(批号：T8060), 索莱宝；柠檬酸钠(批号：C1013)索莱宝；强生稳豪型血糖仪。
2实验方法
2.1溶液的配制
菌粉的配制：
将凝结芽孢杆菌VHProbi C08菌粉溶解于生理盐水中，配制浓度为0.1g/ml(109CFU/ml)菌粉溶液。
STZ溶剂——柠檬酸钠缓冲液的配制
A液和B液的配制：称取柠檬酸2.1g加入双蒸水100mL中配成A液；称取柠檬酸钠2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。将A、B液按一定比例混合 (1：1.32)，pH计测定pH值，调节pH值到4.2-4.5，得到柠檬酸钠缓冲液。称取适量STZ溶于0.1mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使STZ浓度为1％。现配现用，避光冰浴。
2.2造模、分组及给药
SPF级BALB/c小鼠，适应性饲养4天后开始分组、给药。选用合格小鼠随机分为4组，分别为空白组、阳性对照组、益生菌预处理组、益生菌后处理组，每组6只。分组后阳性对照组、益生菌预处理组和益生菌后处理组腹腔注射链脲霉素60mg/kg/d，连续12天进行造模。同时，益生菌预处理组开始按照 109CFU/只/天给予凝结芽孢杆菌VHProbi C08，持续至实验结束；益生菌后处理组在第12天造模结束后开始按照109CFU/只/天给予凝结芽孢杆菌VHProbi C08持续至6周结束；空白组和阴性对照组在第12天造模结束后给予同等体积的MRS培养基溶液持续至6周结束。
每天观察小鼠的进食量、饮水量、排尿量。从造模完成第0周开始每隔2 周所有小鼠尾部末梢取血，采用葡萄糖氧化酶法测定一次空腹血糖水平，连续 6周。
3数据统计处理方法
所有实验数据以均数±标准差
Figure BDA0002707940250000151
表示，用Microsoft EXCEL软件进行数据统计和作图，两组数据间比较采用t检验，以P<0.05判定为有显著性差异。
4实验结果
建模开始后，阳性对照组、益生菌预处理组和益生菌后处理组小鼠出现饮水量和采食量增加现象，同时小鼠的排尿量也出现增加，表现出高血糖饮食症状。在建模完成后与空白组相比，阳性对照组、益生菌预处理组和益生菌后处理组的小鼠血糖水平≥7mM，明显高于空白组，说明高血糖模型小鼠建模成功。
表8：各组小鼠空腹血糖水平
0周 2周 4周 6周
空白组 8.13±0.48 8.55±0.28 8.23±0.36 7.94±0.65
阳性组 17.52±0.77 16.73±0.32 16.08±0.76 16.11±0.52
预处理组 16.25±1.86 12.02±0.51 10.98±0.27 8.63±1.47
后处理组 17.19±1.04 15.27±1.85 13.08±1.63 11.66±1.26
建模完成后，益生菌预处理组小鼠空腹血糖水平略低于阳性对照组和益生菌后处理组；连续灌胃益生菌至第4周时，与阳性对照组相比，益生菌预处理组小鼠血糖水平下降较多且有显著性差异(P<0.05)，空腹血糖水平降低31.7％；连续灌胃益生菌至第6周时，与阳性对照组相比，益生菌预处理组小鼠和益生菌后处理组小鼠血糖水平均明显低于阳性对照组，且有显著性差异(P<0.05), 预处理组空腹血糖水平降低46.46％，后处理组小鼠空腹血糖水平降低27.6％，益生菌预处理组小鼠血糖水平恢复至空白组小鼠血糖水平，试验结果如图9所示。
综合以上指标，凝结芽孢杆菌VHPriobi C08预处理及后处理组与阳性对照组比较观察到小鼠空腹血糖水平降低，说明凝结芽孢杆菌VHPriobi C08具有降低血糖水平的潜在益生作用。近年来，随着生活水平的提高，糖尿病在全世界广泛流行，逐渐成为继心血管疾病及肿瘤之后危及人体健康的第三大疾病。因此，寻找有效的糖尿病治疗药物和保健食品成为该领域的研究热点。研究表明益生菌可以减轻高血糖症状。作为我国可食用菌种之一，凝结芽孢杆菌安全性已经得到了广泛的认可。本发明提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08符合法规要求，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。本发明提供的凝结芽孢杆菌VHProbi C08能够利用三种不同类型益生元和葡萄糖作为碳源，经全基因组测序分析表明具有与降血糖功效相关的蛋白及完整的维生素K合成通路，在STZ诱导的高血糖模型小鼠能够降低其空腹血糖水平，凝结芽孢杆菌VHProbi C08具有重要的潜在益生价值。凝结芽孢杆菌VHProbi C08所具有的耐热性特点及良好的成孢率使其可以添加在大多数种类的食品中，制备成有降血糖功能的功能性食品。具有降低血糖功能潜在益生特性的凝结芽孢杆菌VHProbi C08发酵条件简单、产业化成本低、市场前景广阔，是一株具有巨大经济价值的益生菌株。

Claims (2)

1.保藏编号为CCTCC NO：M2019738的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）在制备降血糖制品中的应用。
2.一种降血糖制品，其特征在于，所述的降血糖制品中包含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌。
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