CN115786216B

CN115786216B - 一种酸鱼乳杆菌zjuf yj5及其应用

Info

Publication number: CN115786216B
Application number: CN202211677300.4A
Authority: CN
Inventors: 冯凤琴; 沈飞; 王倩倩
Original assignee: Hangzhou Kangyuan Food Science And Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Hangzhou Kangyuan Food Science And Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2042-12-26
Also published as: CN115786216A

Abstract

本发明公开了一种酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5及其应用，属于微生物技术领域。本发明从自然发酵果蔬中分离得到一株酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)ZJUF YJ5，保藏号为CCTCC NO:M 2022661。本发明提供了酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5在制备缓解便秘和抑制胃肠道致病菌的药物中的应用。通过体外益生性能、斑马鱼模型、小鼠模型验证均表明其能够有效缓解便秘。本发明提供的酸鱼乳杆菌在便秘缓解中的应用是便秘治疗的新方法思路，对便秘治疗具有重要意义。

Description

一种酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及酸鱼乳杆菌(Lactobacillusacidipiscis)ZJUF YJ5及其应用。

背景技术

近年来，随着生活方式的改变和饮食结构的变化，便秘的发病率逐年升高，尤以老年及经产女性居多，全世界约15％的人受到便秘的困扰。根据疾病形成原因，便秘可分为器质性便秘和功能性便秘，其中功能性便秘(Functional Constipation)是一种常见的消化系统功能性肠病，根据罗马III功能性便秘的诊断标准，其症状特征是一星期中排便次数少于3次，或3天以上才排便，并伴有大便形态异常，排便紧张或便不尽，且不符合肠应激综合征的诊断标准。虽然便秘这种疾病本身的危害看似较小，但是便秘可能会引起腹胀、呕吐、肠梗阻和穿孔等身体不适，还会增加焦虑和易怒的风险，降低食欲，从而影响个人的生活质量，造成不同程度的心理障碍。长期便秘还可能会增加患肾病、帕金森病和结肠直肠癌等许多相关疾病的风险。

治疗便秘的目的在于缓解症状，恢复正常肠道动力和排便生理功能。由于便秘的病因复杂，临床上常常会尝试不同的方法来治疗便秘，包括饮食和生活方式的干预，泻药，甚至手术。在临床上，使用聚乙二醇和增加膳食纤维摄入是治疗慢性功能性便秘的基本方法之一。但是，最常用的治疗主要还是依靠药物治疗，主要药物包括渗透性泻药(乳果糖和聚乙二醇等)、刺激性泻药(双氯联苯和塞纳等)、粪便软化剂(矿物油等)。然而，药物治疗存在疗效不一致、反复发作、药物安全性、不良反应、口味、方便性和成本等问题，一半的患者不满意这样的治疗方法。因此，寻找安全、高效的方法来防治慢性功能性便秘具有重要的意义。

口服微生态制剂是目前临床上治疗便秘的方法之一，活菌制剂无需通过全身吸收，不易引起不良反应。体外补充益生菌可以调节由于便秘所引起的肠道微生态紊乱，而改善的肠道菌群则会增加粪便的含水量、代谢产生更多的短链脂肪酸(short chain fattyacids，SCFAs)，一方面抑制病原菌生长，另一方面通过降低肠道pH而促进肠道的蠕动，另外，肠道菌群可通过模式识别受体(如Toll样受体)介导的肠道免疫反应间接影响肠道运动。目前，市面上也诞生出不少微生物制剂，但是其功效不一，究其原因可能在于不同微生物对于便秘缓解的机理不一，不同种类微生物在缓解便秘过程中发挥着不一样的作用，因此寻找不同类别的缓解便秘的微生物意义重大。

目前，关于酸鱼乳杆菌的研究还尚浅，关于酸鱼乳杆菌改善便秘的研究未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效治疗功能性便秘的益生菌，将其应用于开发缓解便秘的药物或保健食品中。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明从自然发酵果蔬里通过过氧化氢酶试验分离出潜在益生菌菌株，将筛选得到的潜在益生菌菌株分别与便秘患者粪便体外共发酵培养实验，筛得一株能显著降低共培养液pH值的新的菌株。通过形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性以及16SrRNA基因比对分析，鉴定该菌株为乳杆菌目(Lactobacillales)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、酸鱼乳杆菌种(Lactobacillusacidipiscis)，因此将其命名为酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5(Lactobacillus acidipiscisstrain ZJUF YJ5)。

酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 2022661。

通过体外模拟胃肠环境抗性研究发现，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5在pH为2.5的酸性环境中3小时后活菌计数存活率为91.11％，在含有1.8％胆盐的模拟肠液中8h后存活率达76.28％，表明本发明提供的酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5在胃肠环境中有较好的耐受性，能到达肠道发挥功效。

酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的自凝集实验结果显示，到22h时，ZJUF YJ5菌株的自凝集率高达94％，显著性高于模式菌株LGG，表明与肠道的黏附能力越强，容易形成益生生物膜，进而保护机体。

酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5与病原菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌)进行交互凝集实验，发现随着时间的延长，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5与病原菌凝集率上升，在8h时，该益生菌与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的凝集率显著性高于LGG与这两种病原菌的凝集率，表明酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5能在肠道中与致病菌较好的凝集，并顺利排出体外，有利于肠道健康。

因此，本发明提供了酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5在制备抑制胃肠道致病菌的药物中应用。

进一步的，所述酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5通过与胃肠道致病菌凝集抑制胃肠道致病菌在胃肠道内定殖。

进一步的，所述胃肠道致病菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。

本发明进一步通过斑马鱼便秘模型和小鼠便秘模型验证酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5具有较强的缓解便秘能力。

具体的，利用斑马鱼便秘模型评价酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5缓解便秘的能力的研究表明，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的干预可以显著性加速肠道蠕动，缓解造模的影响，其蠕动速度接近正常组，反之模式菌鼠李糖乳杆菌(LGG)则未表现出该作用，说明酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5具有较好的便秘缓解作用。

在小鼠便秘模型中，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5干预后，显著性加快了便秘小鼠的肠蠕动，主要表现在显著性缩短首颗黑便排出时间，显著性增加小鼠肠转运率甚至与正常组无显著性区别，显著性提升粪便颗粒数至正常水平。除促进肠蠕动外，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的干预使便秘小鼠的粪便含水量恢复至正常水平，而且能够上调结肠组织中黏蛋白Muc2\Muc3的表达，增强粘液屏障，润滑粪便，使粪便更容易排出。

因此，本发明提供了酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5在制备缓解便秘的药物或功能食品中的应用。

进一步的，所述酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5通过促进肠蠕动、提高粪便含水量、提高肠道黏蛋白表达润滑粪便进而促进排便达到缓解便秘效果。

进一步的，所述便秘为功能性便秘。根据罗马III功能性便秘的诊断标准判断疾病类型。

利用本发明的酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5可以制备成药物组合物。该药物组合物含有药学有效剂量的酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的活菌形式。此外，所述药物组合物还可以含有合适的药物载体。本发明的药物组合物可以为胶囊、溶液或可饮用悬浮液、袋装粉剂等形式，每一单一剂量一般含有酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5菌株约为10⁶～10¹⁰CFU。本发明的药物组合物可用于防治便秘相关性疾病。

具体的，本发明提供了一种预防或治疗便秘的药物组合物，包括有效剂量的酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5和药学上可接受的载体。

优选的，所述药物组合物中含有活性酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的有效剂量为10⁶～10¹⁰CFU。

将酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5菌体重悬于含有5％的脱脂奶粉和5％的乳糖的灭菌混合液中，通过冷冻干燥制得粉剂。

利用本发明的酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5还可以制备成食品、保健品或食品配料等形式，这些食品、保健品或食品配料可用于防治便秘，提高使用者的健康水平。

具体的，本发明提供了一种缓解便秘的功能食品或食品配料，包括酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5活菌和食品学上可接受的辅料。

本发明的食品可以是含有本发明酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5活菌的饮料的形式。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一株新的菌株酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5，通过体外益生性能、斑马鱼模型、小鼠模型验证均表明其能够有效缓解便秘。酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5在胃肠环境中有较好的耐受性，能到达肠道发挥功效。该菌株对肠道粘附能力较强，容易形成益生生物膜，进而保护机体；并且能粘附病原菌使其排出体外，有利于肠道健康。酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5可降低肠道pH值促进肠蠕动，通过斑马鱼便秘模型发现酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5可将便秘斑马鱼肠道蠕动恢复至正常值；通过小鼠便秘模型发现酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5可将小鼠小肠推进率与粪便含水量缓解至与正常组无显著性区别；酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5能够上调结肠组织中黏蛋白Muc2\Muc3的表达，增强粘液屏障，润滑粪便，使粪便更容易排出。本发明提供的酸鱼乳杆菌在便秘缓解中的应用是便秘治疗的新方法思路，对便秘治疗具有重要意义。

附图说明

图1为益生菌对便秘患者粪菌体外发酵pH值影响，其中a，b，c等不同字母表示组间的显著性差异(p＜0.05)。

图2为本发明提供的酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)ZJUF YJ5的系统进化发育树图，其中lcl/Query 62125为酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)ZJUFYJ5。

图3为益生菌自凝集性及其与病原菌的交互凝集性，其中A为益生菌的自凝集率，B为益生菌与大肠杆菌的交互凝集率，C为益生菌与鼠伤寒沙门氏菌的交互凝集率，D为益生菌与金黄色葡萄球菌的交互凝集率，图中*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。

图4为益生菌对斑马鱼肠道蠕动的影响，其中A表示斑马鱼肠道蠕动峰首个出现时间，B表示斑马鱼在对应时间肠道蠕动峰出现以及蠕动情况，图中a，b等不同字母表示组间的显著性差异(p＜0.05)。

图5为小鼠实验各组别小鼠能量摄入与体重增长情况，其中A为能量摄入，B为体重增长，图中a，b等不同字母表示组间的显著性差异(p＜0.05)。

图6为小鼠排便与小肠推进情况，其中A为首颗黑便排出时间，B为小肠推进率，C为5h内排便颗粒数，D为粪便水分含量，E为5h内粪便干重，F为5h内粪便湿重，图中a，b等不同字母表示组间的显著性差异(p＜0.05)。

图7为小鼠结肠Muc2与Muc3基因表达情况，其中A为Muc2基因表达，B为Muc3基因表达，图中a，b等不同字母表示组间的显著性差异(p＜0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的筛选分离与鉴定

(1)菌株的筛选与分离：

取5g自然发酵果蔬加入到45ml 0.85％的灭菌生理盐水中摇匀，使用生理盐水梯度稀释至10^-5、10^-6、10^-7，分别涂布于MRS培养基上，每个梯度做3个平行。将涂布后的平板置于厌氧箱内，37℃培养24～48h。挑选差异明显的菌落在MRS固体培养基上划线分离，37℃厌氧培养24～48h，连续划线3～5次后，挑取单菌落进行过氧化氢滴定实验，挑取的单菌落在滴有5％过氧化氢液的载玻片上产生气泡则为过氧化氢酶试验阳性，未产生气泡的则为过氧化氢酶试验阴性，试验阴性菌株为疑似益生菌株。

将筛选得到的疑似益生菌的菌株分别与便秘患者粪便体外共发酵培养实验。于无菌条件下取出1g便秘患者的粪便装入预先灭菌的50mL带盖离心管中，称重，鼓入高纯CO₂气体5min，盖上盖子待用。用9倍(V:m)无菌生理盐水稀释便秘患者的粪便，涡旋震荡5min混匀，取10mL高温灭菌后的离心管，每根离心管中加入100uL便秘患者粪便稀释液和5mL灭菌基础培养液(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，定容至1000mL)，每根离心管中加入100uL的益生菌(10⁹CFU/ml)，以等量生理盐水替代益生菌作为对照组(CON组)，随后鼓入高纯CO₂气体20min，盖好橡胶塞后蜡封。在60～80r/min转速的恒温培养振荡器上37℃摇床培养10h，终止发酵，取发酵液样品5mL于4000r/min下离心5min，吸取上清液2mL，检测发酵液的pH。筛选得到能显著降低便秘患者粪便pH的菌株，取名ZJUF YJ5。

酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5与便秘患者粪便体外共发酵液pH结果如图1所示，其中CON组的pH值为6.35；酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5添加便秘患者粪便体外共发酵后，pH值显著性降至5.99；模式菌鼠李糖乳杆菌LGG添加便秘患者粪便体外共发酵后pH值为6.15。

pH值的显著性降低是体外共发酵直观快速筛选促进肠道蠕动的指标。pH值的降低反映了肠道中短链脂肪酸的提升，短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)，一方面抑制病原菌生长，另一方面通过降低肠道pH而促进肠道的蠕动。

(2)菌株鉴定：

将ZJUF YJ5进行革兰氏染色，并进行16S rRNA基因菌种鉴定，由上海派森诺生物有限公司完成鉴定，ZJUF YJ5的16S rRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果输入GeneBank数据库进行BLAST比对分析，然后利用neighbor-joining算法构建NJ系统发育树，结果如图2所示。结果表明，与ZJUF YJ5同源性最高的菌株是Ligilactobacillusacidipiscis strain HBUAS58240，同源性为99.86％。经过16S rRNA基因比对，确认ZJUFYJ5为一株酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)，命名为酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5(Lactobacillus acidipiscis strain ZJUF YJ5)。

将酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)ZJUF YJ5于2022年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO:M 2022661，并于2022年5月25日鉴定存活。

实施例2：酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5体外益生性能试验

1、模拟人工胃肠耐受性

模拟胃液(GJ)：胃蛋白酶(1:10000)加入PBS(pH2.5)中，浓度为3.5g/L。

模拟肠液(IJ)：NaHCO₃ 11g/L，NaCl 2g/L，胰蛋白酶1g/L，猪胆盐18g/L，调整pH值为8.0，0.22μm膜过滤除菌备用。

经冷冻离心后得到活菌体，PBS(pH7.4)洗两次，调整活菌浓度约为10⁹CFU/mL，将0.5mL菌悬液加入4.5mL模拟胃液中，同时采用MRS琼脂倾注平板法计数，置于厌氧培养箱中37℃培养。待3h后，取样分别采用MRS琼脂倾注平板计数法计数。待GJ处理3h后，取0.5mL的GJ培养液加入4.5mL的IJ中，8h后采用MRS琼脂倾注平板法计数，置于厌氧培养箱中37℃下培养24-48h后计数。每个菌株做三个平行。

存活率(％)＝logα/logβ×100％

注：α＝经过模拟胃肠液处理之后的乳酸菌活菌数，β＝未处理前的活菌数。

结果如表1所示，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的胃肠转运能力较好，经过胃液(pH2.5)消化下存活率高达91.11％，模拟肠液则显著降低酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的存活率，其肠模拟液中的存活率为76.28％，在整个胃肠过程的存活率为69.50％，与模式菌鼠李糖乳杆菌(LGG)接近。

表1

2、自凝集性与交互凝集性

使用PBS制备浓度为10⁸CFU/mL的菌液，取10⁸CFU/mL的菌悬液4ml加入无菌离心管中，在0、2、4、8、12、22h静置状态下取上层清液200uL加入到96孔板中，在600nm下测定吸光值。按照公式计算自凝集率。

自凝集率(％)＝(A₀-A_t)/A₀*100％

A₀：0h时样品的OD值；A_t：不同时间段样品的OD值。

将测试益生菌菌株与病原菌(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌)分别活化培养，培养18h，分别将培养物经5000rpm离心5min，并用无菌PBS缓冲液洗涤菌体细胞沉淀，调节OD₆₀₀为0.50±0.05，将等量(500uL)的测试益生菌菌株分别和3种致病性菌细胞悬液混合均匀，充分振荡5min，37℃静置培养。在2h、4h、8h静置状态下取上层清液200uL加入到96孔板中，在600nm下测定吸光值。按照公式计算交互凝集率。

交互凝集率(％)＝[(A_pat+A_lac)-2*A_mix]/(A_pat+A_lac)*100％

A_pat和A_lac：病原菌及乳杆菌0h的OD值；A_mix：混匀液不同时间段OD值。

自凝集结果如图3A所示，凝集作用是细胞之间的黏附作用，同一菌株细胞之间的自凝集力(Autoaggregation)是其与肠道黏附能力和其在肠道中形成有益生物膜能力相关的一个生物学性质。自凝集力强的乳杆菌，与肠道的黏附能力越强，容易形成益生生物膜，进而保护机体。通过自凝集实验结果发现，随着时间的延长，菌株间会自我凝集沉淀，到22h时，ZJUF YJ5菌株的自凝集率高达94％，显著性高于模式菌株LGG。

益生菌与病原菌的交互凝集结果如图3B～3D所示，随着时间的延长，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5与病原菌凝集率上升，在8h时，该益生菌与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的凝集率显著性高于LGG与这两种病原菌的凝集率。益生菌的交互凝集作用能使其在肠道中与致病菌较好的凝集，并顺利排出体外，有利于肠道健康。

实施例3：斑马鱼便秘模型评价酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的便秘缓解作用

本实施例采用便秘斑马鱼模型评价酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5缓解便秘的能力。斑马鱼与人的基因相似率高达87％，肠道与人也很相似。实验使用盐酸洛哌丁胺造模。

将发育12h后的斑马鱼胚胎用吸管移取到6孔板上，每孔加入20个斑马鱼胚胎以及6mL含有苯硫脲的胚胎培养液(每1mL胚胎培养液中含有苯硫脲母液10μL)，隔日更换3mL新配制的苯硫脲和胚胎培养液混合液，连续培养2d。斑马鱼发育至第5d后，移去每孔中的苯硫脲和胚胎培养液的混合液，各实验组分别加入不同浓度的受试样品6mL，其中对照组(CON)为空白对照，加入E3斑马鱼培养用系统水，模型组(LOP)加入10ug/mL盐酸洛哌丁胺(Lop)，实验组LOP-YJ5为10ug/mL Lop与10⁸CFU/mL ZJUF YJ5，实验组LOP-LGG为10ug/mL Lop与10⁸CFU/mL LGG。每组平行3份，药物处理24h后，利用显微镜录像记录斑马鱼肠蠕动情况。

在显微镜下记录观察，记录斑马鱼鱼泡后第四节鱼骨所对应的蠕动峰两次之间所需的时间(称为首个蠕动峰出现时间)，利用Image-Pro-Plus软件进行图片分析，比较不同药物处理组与空白对照组、造模组之间的斑马鱼肠道蠕动速度差异。

实验结果如图4所示，斑马鱼模型结果显示，使用Lop造模后，与空白对照相比，斑马鱼肠道首个蠕动峰显著性变慢，而酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的干预可以显著性加速肠道蠕动，其蠕动速度接近正常组，而模式菌LGG则未表现出该作用。

实施例4：小鼠便秘模型评价益生菌便秘缓解作用

(1)菌粉制备

将活化好的酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5按照1％的接种量接种到无菌的MRS液体培养基中，37℃培养24h，5000rpm离心得到菌体，用含有5％的脱脂奶粉和5％的乳糖的灭菌混合液作为冻干保护剂重悬菌体，放入冷冻干燥机中冻干。最后，采用倾注平板法计数冻干后得到的菌粉。

(2)实验喂养及分组情况

将6周龄健康雄性BALB/C小鼠36只放入动物房内饲喂普通饲料平衡7d，使其适应实验环境(12h白天/黑夜)。平衡期结束后，随机分成3组，分别为正常组(CON，灌胃无菌生理盐水16天，2次/天，每日10:00开始灌胃无菌生理盐水10mg/kg.bw，半小时后灌胃无菌生理盐水，0.20mL/次)，模型组(LOP，每日10:00开始灌胃盐酸洛哌丁胺10mg/kg.bw，1次/天，半小时后灌胃无菌生理盐水0.20mL/次)，干预组(LOP-YJ5，每日10:00开始灌胃盐酸洛哌丁胺10mg/kg.bw，1次/天，半小时后灌胃酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5，5*10¹⁰CFU/mL，0.20mL/次)。小鼠每组12只，分为3笼，每笼4只，环境(22±2℃)，湿度30-70％，小鼠自由摄食和饮水，每4天记录1次体重、采食量。第14天进行首粒黑便实验与5h内排便颗粒数实验，第17天进行小肠推进实验后颈椎处死小鼠。本动物实验中所用的方法均经过浙江中医药大学伦理委员会审阅并批准(No20211206-06)。

(3)小鼠排便实验

小鼠灌胃第14天进行小鼠排便实验。检测方法如下：实验第13天晚上给予小鼠禁食不禁水16h，实验第14天，各组均灌胃盐酸洛哌丁胺10mg/kg.bw，空白对照组灌胃同等体积的蒸馏水。0.5h后，空白组和模型对照组用墨汁灌胃，样品组灌胃含有对应内容物的墨汁溶液，并开始计时。将小鼠放置代谢笼中，立即恢复正常饮食。观察并记录每只小鼠首粒排黑便时间，以模型组最后一只小鼠的首粒黑便时间为终止时间，超过模型组首粒黑便时间的处理组则说明无效。搜集5h内粪便并分析排便粒数、5h内粪便总重量(湿重)和粪便含水量。

(4)小肠运动实验

实验第16天晚上开始禁食，不禁水16h，以排空肠道。禁食16h后各组均灌胃盐酸洛哌丁胺胶囊7.5mg/kg.bw，空白对照组灌胃同等体积的蒸馏水。30min后，空白组和模型对照组用墨汁灌胃，样品组灌胃含有对应内容物的墨汁溶液，并开始计时。30min后颈椎脱臼处死小鼠，摘取眼球取血，分离出血清。然后将小鼠脱颈处死并打开腹腔，剪取完整的胃肠(上端自幽门，下端至回盲肠的肠管)，并将小肠系膜剪断，使小肠慢慢伸直，在撒有生理盐水的玻璃板上，拉直小肠，经自然回缩后，用尺子测量从幽门到墨汁前沿的距离(墨汁糊推进长度)和从幽门到回盲肠起始处的距离(小肠总长度)，计算小肠推进率。

小肠推进率(％)＝(墨汁在肠内的推进长度/小肠总长度)*100％

体重和能量摄入结果如图5所示，体重和能量摄入是研究小鼠生长情况的重要指标，以第16天进行数据统计，图5A和5B分别为小鼠的平均每日能量摄入量和体重增重值，在实验期内，各组别小鼠的能量摄入量无显著性区别，而体重增长则模型组显著性低于正常对照组，而酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5干预后，其体重增长与正常组无显著性差异。

首颗黑便时间、小肠推进率、5h排便颗粒数、干湿重、粪便水分含量指标是评价小鼠便秘最直观的指标，实验结果如图6所示。LOP造模后小鼠对比正常对照组的首颗黑便时间显著性延长、小肠推进率显著性变慢、5h内粪便颗粒数显著性降低，粪便含水量显著性降低，粪便湿重显著性降低，说明LOP成功将小鼠造成便秘模型。使用酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5干预后，显著性加快了便秘小鼠的肠蠕动，主要表现在显著性缩短首颗黑便时间，显著性加快小鼠肠转运率甚至与正常组无显著性区别，显著性提升粪便颗粒数至正常水平。除促进肠蠕动外，酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的干预使便秘小鼠的粪便含水量恢复至正常水平。

实施例5：酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5上调结肠组织Muc2\Muc3基因表达促进排便

(1)提取实施例4中CON组、LOP组、LOP-YJ5组结肠组织总RNA：参照天根总RNA提取试剂盒操作说明，具体操作步骤如下：

取结肠组织50-100mg，加入1mL裂解液后匀浆仪进行匀浆处理，将匀浆样品在室温放置5min使核酸蛋白复合物完全分离，4℃12000rpm离心5min，去上清，转入一个新的无RNase的离心管中，加入氯仿200uL，剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃、12000rpm离心10min，样品会分成黄色有机相、中间层和无色水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入0.5倍体积无水乙醇后混匀，将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱，4℃、12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入500uL去蛋白液后4℃、12000rpm离心30sec，弃废液，向吸附柱中加入500uL漂洗液后室温静置2min，4℃、12000rpm离心30sec，弃废液，漂洗2次，充分晾干，加入50uL RNase-Free ddH₂O，室温放置2min后4℃、12000rpm离心2min收集。提取完成后利用Nanodrop测定RNA样品的浓度和纯度，迅速进行cDNA的合成或于-80℃暂存。

(2)逆转录合成cDNA：参照Vazyme HiScript II Q-RT SuperMix试剂盒操作说明书，具体操作步骤如下：

基因组DNA的去除：在Rnase free的离心管中按下表2添加反应体系，用移液枪轻轻吹打混匀，42℃保温2min。然后进行转录反应：在第一步的反应管中直接加入2μL的5×HiScript II qRT SuperMix II。逆转录反应程序为25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min；产物-80℃下冻存。

表2基因组DNA去除反应体系

(3)SYBR荧光定量PCR：在384孔板中按如表3体系配置反应液，按照表4设置的程序进行qPCR反应。反应程序结束后，根据2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，内参基因的GAPDH的Ct值。

表3荧光定量PCR反应体系

表4qPCR反应程序

表5小鼠引物列表

黏液层能够保护肠道上皮细胞免受病原微生物的侵袭，同时是肠道蠕动的润滑剂，MUC2与MUC3是主要的黏蛋白，因此该实验对Muc2/Muc3基因表达进行测定，结果如图7所示。LOP造模后，Muc2/Muc3的基因表达量显著性降低，通过酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5的干预后，Muc2/Muc3的基因表达量显著性提高，这表明酸鱼乳杆菌ZJUF YJ5可以逆转盐酸洛哌丁胺造模后的黏蛋白下降，通过上调大肠黏蛋白表达，增强粘液屏障，润滑粪便，使粪便更容易排出。

Claims

1.一种酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis) ZJUF YJ5，其特征在于，该酸鱼乳杆菌的保藏号为CCTCC NO:M 2022661。

2.如权利要求1所述的酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis) ZJUF YJ5在制备缓解功能性便秘的药物或功能食品中的应用。

3.如权利要求1所述的酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis) ZJUF YJ5在制备抑制胃肠道致病菌的药物中的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌中的一种或多种。

4.一种预防或治疗便秘的药物组合物，其特征在于，包括有效剂量的如权利要求1所述的酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis) ZJUF YJ5和药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有活性酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis) ZJUF YJ5的有效剂量为10⁶~10¹⁰CFU。

6.一种缓解便秘的功能食品或食品配料，其特征在于，包括如权利要求1所述的酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis) ZJUF YJ5活菌和食品学上可接受的辅料。