CN113789290B - 一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌bcn019及其菌剂和应用 - Google Patents

一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌bcn019及其菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019及其菌剂和应用，凝结芽孢杆菌BCN019的分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，已于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.22764。凝结芽孢杆菌BCN019可用于制备抗疲劳的菌剂和/或修复肌肉损伤的菌剂。本发明提供的凝结芽孢杆菌，有较强的胃肠道存活率和肠道定植能力，能够通过增强乳酸代谢以及降低血尿素含量来实现抗疲劳效果，同时增强受损肌肉的恢复能力。

Description

一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019及其菌剂和应用
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019及其菌剂和应用。
背景技术
人在高强度训练或体力劳动后容易疲劳，过度疲劳还可能导致肌肉损伤及肌肉恢复、修复能力差的问题。目前，多采用睡眠休息、药物治疗、服用功能性饮料、服用代餐粉或服用益生菌发酵中药饮品的方法缓解疲劳。（1）睡眠休息：睡眠是最普通、广泛的缓解疲劳的重要形式，但往往很难在短时间内恢复正常体能，而且对于长期连续性运动人员并不适用。（2）药物治疗：化学类药物治疗虽然可以快速缓解疲劳，但对于部分人存在药物不适影响，如肠胃不适，恶心、嗜睡等不良反应，且化学合成药物长时间服用容易产生药物依赖，对肝脏、肾脏伤害较大。（3）服用功能性饮料：目前市场上的抗疲劳功能性饮料产品主要含有维生素、咖啡因等兴奋性物质，其原理在于短时间内提高机体神经兴奋度，对人产生一种刺激性感觉，从而觉得疲劳感降低。这种运动性功能饮料只是从刺激神经兴奋入手，不能从根本上改善疲劳状态。（4）服用代餐粉：通过食入大量蛋白与营养物质修复疲劳程度。大量营养消化与吸收固然可以强化体制，降低疲劳度，增加抗逆性。但高蛋白饮食在人体疲劳状态下会降低其消化吸收速率，大量使用甚至造成肠胃负担，增加肾脏负担，难以快速减缓疲劳，只能作为营养补充来增强体质，此方法成效缓慢，且费用高昂。（5）服用益生菌发酵中药饮品：中国专利申请CN108850758A公开一种具有抗疲劳功能的枸杞酵素饮料的制备方法、CN108159185A公开一种具有抗疲劳抗氧化菌药口服液，其均是通过添加益生菌发酵特定中药得到抗疲劳产品。由于发酵产物种类多，成分复杂，并不是所有发酵产物对人体都为有益，且不同体质对中药需求并不一样，因此发酵产品固然有用，但存在一定使用风险及人群针对性。
综上所述，有必要提供一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌及其菌剂和应用。
发明内容
针对现有抗疲劳益生菌发酵中药饮品存在一定的使用风险和人群针对性的问题，本发明提供一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019及其菌剂和应用，该菌株可有效解决人群疲劳，同时提高肌肉损伤后的恢复能力。
第一方面，本发明提供一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019，分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，已于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNO.22764；所述凝结芽孢杆菌BCN019的16S rRNA序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明提供一种上述凝结芽孢杆菌BCN019在制备抗疲劳的菌剂和/或修复肌肉损伤的菌剂中的应用。
进一步的，所述抗疲劳的菌剂为增强乳酸代谢的菌剂和/或降低血尿素含量的菌剂。
进一步的，所述修复肌肉损伤的菌剂为促进局部钙离子吸收的菌剂。
第三方面，本发明提供一种以上述凝结芽孢杆菌BCN019制备的菌剂。
进一步的，所述菌剂的凝结芽孢杆菌BCN019菌体数量为1~100亿/g。
进一步的，所述菌剂含有上述凝结芽孢杆菌BCN019的菌粉。
进一步的，所述菌剂包括菌粉和低聚异麦芽糖。
进一步的，所述菌粉的制备方法包括如下步骤：
（1）活化凝结芽孢杆菌BCN019，将活化后的菌株接种于MRS液体培养基中培养，获得菌液；
（2）离心菌液，收集菌体并使用无菌生理盐水洗涤，然后将菌体重悬于15wt%复原脱脂乳中，获得悬浊液；
（3）调整悬浊液的浓度为1.0~2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液；
（4）将菌悬液冷冻干燥，获得菌粉。
进一步的，所述步骤（1）的培养条件为37℃培养24h。
进一步的，所述步骤（1）的MRS液体培养基的原料包括：10g蛋白胨、5g牛肉粉、5g三水醋酸钠、2g七水磷酸氢二钾、1mL吐温80、0.05g四水硫酸锰、2g柠檬酸三铵、20g葡萄糖、0.2g七水硫酸镁、1000mL蒸馏水；
将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即得MRS液体培养基。
本发明的有益效果在于，
本发明提供的凝结芽孢杆菌BCN019，有较强的胃肠道存活率和肠道定植能力，能够通过增强乳酸代谢以及降低血尿素含量来实现抗疲劳效果，同时凝结芽孢杆菌在肠道中产生的短链脂肪酸，短链脂肪酸有助于将化合态钙元素分解为游离态，有利于人体吸收，增强受损肌肉的恢复能力，而没有任何副作用，避免化学药物治疗产生的不良反应及对人体伤害。动物及人群试验结果验证了该菌株抗疲劳、修复肌肉损伤的效果。
本发明提供的菌剂仅使用该凝结芽孢杆菌作为单一菌种，成本更低、针对性更强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4正常组小白兔股四头肌的纵切面照片。
图2为实施例4自然恢复组小白兔股四头肌的纵切面照片。
图3为实施例4凝结芽孢杆菌恢复组小白兔股四头肌的纵切面照片。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
凝结芽孢杆菌BCN019按如下方法筛选、纯化获得：
（1）取样：2019年5月，取广西巴马农民自制发酵泡菜液1mL，备用；
（2）制备样品：
①取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的样品加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用；
（3）制备MRS平板培养基：
MRS平板培养基的原料包括：10g蛋白胨、5g牛肉粉、5g三水醋酸钠、2g七水磷酸氢二钾、1mL吐温80、0.05g四水硫酸锰、2g柠檬酸三铵、20g葡萄糖、0.2g七水硫酸镁、15g琼脂、1000mL蒸馏水；
将上述原料混合后，自然pH，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可；
将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用；
（4）培养：使用涂布器将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别涂布在步骤（3）的平皿中，于37℃、厌氧条件下培养48h；
（5）按照以下菌落特征挑选菌落：
菌落特征：直径1-2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起；
（6）分离纯化
根据步骤（5）的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至步骤（3）的培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
将分离纯化后单菌落送去鉴定，鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司。鉴定结果：该菌株被鉴定为Weizmannia（芽孢杆菌属），推测为Weizmannia coagulans（凝结芽孢杆菌）。
引物：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'（SEQ ID NO.1）；
1492R：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（SEQ ID NO.2）。
将鉴定后的菌株命名为凝结芽孢杆菌BCN019，并送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
该凝结芽孢杆菌BCN019的16S rRNA序列如SEQ ID NO.3所示：
CGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGCCGGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCCGGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGCGGCTCAACCGCAAGCGGTCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCTCCCTGGAGACAGGGCCTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCAGAAAACCATTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTACGGA。
实施例2
凝结芽孢杆菌BCN019的菌剂，该菌剂可用于抗疲劳和/或修复肌肉损伤，含有凝结芽孢杆菌BCN019的菌粉，菌粉的制备方法包括如下步骤：
（1）活化凝结芽孢杆菌BCN019，将活化后的菌株按1%接种量接种于MRS液体培养基中37℃培养24h，获得菌液；
MRS液体培养基的原料包括：10g蛋白胨、5g牛肉粉、5g三水醋酸钠、2g七水磷酸氢二钾、1mL吐温80、0.05g四水硫酸锰、2g柠檬酸三铵、20g葡萄糖、0.2g七水硫酸镁、1000mL蒸馏水；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即得MRS液体培养基。
（2）离心菌液，收集菌体并使用无菌生理盐水洗涤，然后将菌体重悬于15wt%复原脱脂乳中，获得悬浊液；
（3）调整悬浊液的浓度为1.0~2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液；
（4）将菌悬液冷冻干燥，获得菌粉。
菌剂还包括低聚异麦芽糖，根据需要加入低聚异麦芽糖，调节菌剂中菌体数量为1~100亿/g。
实施例3
随机挑选青年受试者20人（男10，女10），分成实验组和对照组，每组10人（男5人，女5人），其中实验组为综合体能略低于对照组，实验组和对照组的基本信息如表1所示。
表1 对照组、实验组基本信息
组别 年龄/a 身高/cm 体重/kg 血压/mmHg 脉搏/次/min
对照组 20.2±2.1 175.0±5.8 57.6±1.3 115.7±8.4 73.5±8.1 56±8
实验组 19.1±1.7 174.1±4.6 56.4±1.1 114.4±8.2 72.8±7.6 54±6
实验组每天早、午、晚餐前服用按实施例2方法制备的菌剂，每次服用2g，每g菌剂含有100亿凝结芽孢杆菌BCN019菌体，连续服用4周，对照组不服用菌剂。由专业人员制定训练方案，两组进行相同体能训练，观测运动员完成疲劳运动后生理生化指标及抗疲劳程度。
具体实验方法为：受试者在运动前，先测试安静时（早6点起床时）各项生理指标。然后吃早餐，休息。上午8点开始准备活动，进行10~20km疲劳运动。由专业人员控制跑圈速度。完成训练后进入体检室进行各项指标检测。疲劳运动前后的检测结果如表2、表3所示。
表2 疲劳运动前后血乳酸浓度（mmol/L）变化
Figure 374641DEST_PATH_IMAGE001
注：＊＊实验组服用益生菌一周与二、三周相比P<0.05，表明具有显著性差异。
表2结果表明：服用本发明菌剂后，安静时，血乳酸浓度1周与2、3周自身相比，血乳酸浓度降低具有显著性差异（P<0.05），表明凝结芽孢杆菌BCN019对降低体内乳酸有促进作用。人体内乳酸的产生是由人体在剧烈活动下，体内细胞进行无氧呼吸而产生，肌肉中乳酸含量是引起肌肉机能下降的重要因素。乳酸增多表现在人体中的现象为肌肉酸痛，身体疲乏。
表3 疲劳运动前后血尿素浓度（mmol/L）变化
Figure 154378DEST_PATH_IMAGE002
注：＊＊实验组服用前与服用后各周相比P<0.05，表明结果具有显著性差异。
人体对运动负荷的适应性越差，运动后体内产生的尿素越多。所以，运动后24小时血液中尿素浓度，可反应疲劳恢复情况。表3结果表明：服用本发明菌剂的运动员体内血液中尿素的浓度降低具有显著性P<0.05。由此可见凝结芽孢杆菌对人体的抗疲劳作用具有促进作用。
实施例4
取23只小白兔正常饲养，25℃下自由摄食、饮水，适应性喂养一周，并观察小白兔进食、活动、粪便是否正常。随后动物被随机分为正常组（3只）、自然恢复组（10只）及凝结芽孢杆菌恢复组（10只）。正常组的小白兔不做任何处理，自然恢复组和凝结芽孢杆菌恢复组小白兔需要建立股四头肌损伤模型。具体采用自制重力铅锤打击小兔右后肢股四头肌肌腹中段的方法建模。首先，将小白兔处仰位平置，露出股四头肌及相邻肌肉部位；选定右后肢内侧股四头肌肌腹中段为打击中心，先垫一层纱布防止皮肤损伤；用自制重力铅锤（锤长10cm，重0.5kg，底面平滑，直径2.5cm），沿PVC硬塑料导向管（长80cm，直径3.0cm）自由下落（自由落高60cm），同一部位连续打击3次。此时肉眼可见受打击的部位出现肿胀和淤血，类似肌肉受撞击损伤，表明模型建立成功。
造模后，三组小白兔统一正常饲养。凝结芽孢杆菌恢复组每日以给水形式喂养凝结芽孢杆菌BCN019的菌粉，每日三次，每次1克（1亿菌体）。自然恢复组不予服用凝结芽孢杆菌治疗。在实验期间每天上午8:00、下午5:00观察实验动物存活、饮食、粪便及右后肢活动情况。四天后观察正常组股四头肌，及自然恢复组和凝结芽孢杆菌恢复组小白兔股四头肌的恢复情况。
正常组股四头肌纵切，正常肌肉病理表现肌细胞呈多角形，排列规则、整齐，细胞形态结构完整。肌细胞着色为明快的鲜红色，整个切片无变性坏死及炎细胞浸润现象（图1）。自然恢复组中，纵切面上，受损部位肌细胞明显萎缩与固缩，填充有大量形状不规则的结缔样组织，有一定数量的炎症细胞、淋巴细胞等（图2）；而凝结芽孢杆菌恢复组，与自然恢复组相对比，纵切面（图3）上新生或自然恢复的肌细胞比例明显增多，肌细胞较大，排列较紧密，结缔组织顺着肌细胞增生的前沿更有规律地排列，新生血管更丰富，组织病理结构恢复得更接近正常组织。这一结果表明，在相同条件下，服用本发明凝结芽孢杆菌BCN019有利于肌肉损伤的快速修复。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019及其菌剂和应用
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<210> 3
<211> 1196
<212> DNA
<213> 凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）
<400> 3
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agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 120
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tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc 600
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg 660
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 720
accaggtctt gacatcctct gacctccctg gagacagggc cttccccttc gggggacaga 780
gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 840
aacgagcgca acccttgacc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc 900
cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 960
gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa agggctgcga gaccgcgagg ttaagccaat 1020
cccagaaaac cattcccagt tcggattgca ggctgcaacc cgcctgcatg aagccggaat 1080
cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1140
cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tacgga 1196

Claims (10)

1.一种具有抗疲劳作用的凝结芽孢杆菌BCN019，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌BCN019的分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，已于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.22764；所述凝结芽孢杆菌BCN019的16S rRNA序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌BCN019在制备抗疲劳的菌剂和/或修复肌肉损伤的菌剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗疲劳的菌剂为增强乳酸代谢的菌剂和/或降低血尿素含量的菌剂。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述修复肌肉损伤的菌剂为促进局部钙离子吸收的菌剂。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂采用如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌BCN019制备。
6.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的凝结芽孢杆菌BCN019菌体数量为1~100亿/g。
7.如权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有上述凝结芽孢杆菌BCN019的菌粉。
8.如权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述菌粉的制备方法包括如下步骤：
（1）活化凝结芽孢杆菌BCN019，将活化后的菌株接种于MRS液体培养基中培养，获得菌液；
（2）离心菌液，收集菌体并使用无菌生理盐水洗涤，然后将菌体重悬于15wt%复原脱脂乳中，获得悬浊液；
（3）调整悬浊液的浓度为1.0~2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液；
（4）将菌悬液冷冻干燥，获得菌粉。
9.如权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述步骤（1）的培养条件为37℃培养24h。
10.如权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述步骤（1）的MRS液体培养基的原料包括：10g蛋白胨、5g牛肉粉、5g三水醋酸钠、2g七水磷酸氢二钾、1mL吐温80、0.05g四水硫酸锰、2g柠檬酸三铵、20g葡萄糖、0.2g七水硫酸镁、1000mL蒸馏水。
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