CN117778278B - 一种复合乳酸菌青贮添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种复合乳酸菌青贮添加剂及其制备方法和应用。所述复合乳酸菌青贮添加剂包括1重量份植物乳杆菌JYLP‑376菌粉、0.5~2重量份副干酪乳杆菌JLPF‑176菌粉、0.5~2重量份布氏乳杆菌JYLE‑202菌粉、0.5~2重量份凝结芽孢杆菌BCN019菌粉。复合乳酸菌青贮添加剂中的各菌种高度协同，能够显著提高苜蓿青贮的乳酸、乙酸含量，增加乳酸菌数量，同时抑制霉菌、酵母菌和大肠杆菌的繁殖。此外，使用该复合乳酸菌青贮添加剂，能够减少苜蓿青贮饲料中的纤维素含量，同时减少干物质损失，保留更多的营养物质，增加适口性，提高苜蓿青贮饲料的品质。

Description

一种复合乳酸菌青贮添加剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种复合乳酸菌青贮添加剂及其制备方法和应用。

背景技术

苜蓿作为一种多年生的豆科牧草，适应性强，产量高，蛋白质含量丰富，具有大量的维生素和多种矿物质成分，而且适口性较好，是畜牧业发展过程中不可缺少、不可替代的优质牧草。苜蓿青贮起源于18世纪，目前在国外，很多国家都以40%的苜蓿调制干草，60%的苜蓿以青贮的方式收获保存。国内来讲，长期以来苜蓿的利用方式主要以晒制青干草为主，随着畜牧业的发展和农业结构的调整，苜蓿种植面积逐年扩大，作为苜蓿收储加工的重要方式，青贮技术已经完善，并且得到了很大程度的推广，让优质牧草资源得到了有效利用。

苜蓿青贮是指将含水率为60%~65%的青绿苜蓿经粉碎后，在密闭缺氧的条件下，使苜蓿草上附着的乳酸菌产生发酵作用得到的一种粗饲料。如果在收获作物后粉碎直接压实密封进行青贮，不添加任何菌剂，会导致青贮发酵进程缓慢，而且青贮产物纤维素含量过高，操作不当容易造成氧气残留导致青贮饲料发生霉变。因为苜蓿本身含水量和粗蛋白含量高、含糖较少、具有较高的缓冲能等特点，很难实现青贮。因此，在青贮苜蓿时，往往额外加入乳酸菌菌种，可以促进乳酸菌尽快繁衍，改善青贮饲料品质。但是，目前市面上的青贮添加剂多由单一菌种制成，对发酵过程的促进效果不显著，生长条件苛刻，稳定性较差，最终得到的青贮产物纤维素含量过高。

发明内容

针对现有的苜蓿青贮添加菌剂菌种单一导致发酵过程缓慢、青贮产物纤维素含量过高的问题，本发明提供一种复合乳酸菌青贮添加剂及其制备方法和应用，能够合成更多的乳酸和乙酸，抑制霉菌、酵母菌和大肠杆菌的繁殖，保留更多的营养物质，减少纤维素含量。

第一方面，本发明提供一种复合乳酸菌青贮添加剂，包括1重量份植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JYLP-376菌粉、0.5~2重量份副干酪乳杆菌（Lactiparacaseibacillus paracasei）JLPF-176菌粉、0.5~2重量份布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）JYLE-202菌粉、0.5~2重量份凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BCN019菌粉；植物乳杆菌JYLP-376的保藏日期为2019年7月8日，保藏编号为CGMCC No.18099；副干酪乳杆菌JLPF-176的保藏日期为2019年6月27日，保藏编号为CGMCCNo.18043；布氏乳杆菌JYLE-202的保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCCNo.27224；凝结芽孢杆菌BCN019的保藏日期为2021年6月23日，保藏编号为CGMCCNo.22764。

进一步的，包括1重量份植物乳杆菌JYLP-376菌粉、1重量份副干酪乳杆菌JLPF-176菌粉、1重量份布氏乳杆菌JYLE-202菌粉、1重量份凝结芽孢杆菌BCN019菌粉。

进一步的，复合乳酸菌青贮添加剂还包括脱脂奶粉。

进一步的，复合乳酸菌青贮添加剂中的菌体数量为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/g。

第二方面，本发明提供一种上述复合乳酸菌青贮添加剂的制备方法，包括：

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；

（2）分别在MRS平板培养基上活化植物乳杆菌JYLP-376、副干酪乳杆菌JLPF-176、布氏乳杆菌JYLE-202和凝结芽孢杆菌BCN019，挑取活化后的单菌落接种到MRS液体培养基中，培养分别获得植物乳杆菌JYLP-376菌液、副干酪乳杆菌JLPF-176菌液、布氏乳杆菌JYLE-202菌液和凝结芽孢杆菌BCN019菌液；

（3）分别将上述菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度，冷冻干燥后得到植物乳杆菌JYLP-376菌粉、副干酪乳杆菌JLPF-176菌粉、布氏乳杆菌JYLE-202菌粉和凝结芽孢杆菌BCN019菌粉；

（4）将上述菌粉按比例进行混合，制成复合乳酸菌青贮添加剂。

进一步的，步骤（2）中，培养温度为37℃，培养时间为24h。

进一步的，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL。

第三方面，本发明提供还一种上述复合乳酸菌青贮添加剂在苜蓿青贮方面的应用。

进一步的，使用方法为：取复合乳酸菌青贮添加剂按照10⁶cfu/mL加水制成菌液，以20mL/kg的量均匀喷洒在苜蓿秸秆碎料上，然后将苜蓿秸秆碎料装入青贮发酵袋中，真空处理后立即密封常温发酵。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的复合乳酸菌青贮添加剂中，植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌均属于同型发酵乳酸菌，能够产生乳酸，降低青贮饲料的pH值，但是在有氧暴露阶段乳酸容易被酵母等有害微生物利用，存在有氧腐败的可能性；而布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，可以利用乳酸产生乙酸，抑制酵母等有氧菌的繁殖，增加有氧稳定性。

2、本发明提供的复合乳酸菌青贮添加剂中，各复配菌种高度协同，能够显著提高苜蓿青贮的乳酸、乙酸含量，增加乳酸菌数量，同时抑制霉菌、酵母菌和大肠杆菌的繁殖。此外，使用该复合乳酸菌青贮添加剂，能够减少苜蓿青贮饲料中的纤维素含量，同时减少干物质损失，保留更多的营养物质，增加适口性，提高苜蓿青贮饲料的品质。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 菌种的分离鉴定

1、菌株来源

（1）菌株JYLP-376来源：2018年7月于新疆伊犁州取牧草堆料，放入样品转运箱中低温保存运送至实验室中，作为样品备用；

（2）菌株JYLE-202来源：2019年7月于中国山东省滨州市取发酵饲料，放入样品转运箱中低温保存运送至实验室中，作为样品备用。

2、菌株筛选、分离

（1）制备样品溶液

将样品分别取1g加入到含有99mL无菌生理盐水的锥形瓶中，置于4℃恒温振荡器中120rpm振荡30min，制得样品溶液；取样品溶液1mL依次稀释制成浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的溶液，备用。

（2）制备含0.5%CaCO₃的MRS固体培养基

MRS固体培养基的各组分含量如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸粉10g/L、无水乙酸钠5g/L、K₂HPO₄·7H₂O 2g/L、柠檬酸三铵2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、MnSO₄·4H₂O 0.05g/L、琼脂15g/L、CaCO₃5g/L。

按照上述配比，将原料混合后溶于1000mL蒸馏水中，用HCl调pH至6.2±0.2，加热混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中，放凉后备用。

（3）分离纯化

①分别取不同稀释浓度的样品溶液100µL分别使用涂布棒在固体培养基上进行涂布，于37℃、厌氧条件下培养48h；

②按照以下特征挑选菌落：菌落直径1~2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起，溶钙圈较大；

③根据步骤②的菌落特征分别挑取单菌落，采用划线法接种至步骤（3）的MRS固体培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，重复上述操作2~3次，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。

3、菌株鉴定

将分离纯化后的单菌落送去鉴定，鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司，鉴定过程中，使用的引物序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；

1492R：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

鉴定得到的16S rDNA序列和鉴定结果如下：

①菌株JYLP-376的基因序列如下：

AGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTA；

菌株JYLP-376被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

因此，将菌株JYLP-376命名为植物乳杆菌JYLP-376，于2019年7月8日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.18099，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

②菌株JYLE-202的基因序列如下：

TCTGTCACCTTAGACGGCTGGTCCCCGAAGGTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAAGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGACAGCCGAAGCCGTCTTTTAAACCAAAACCAGGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTCTCAATGTTAAATCTTTCAAGTGCAAGCACCTAAAATCATTAACGGAGACGCGTTCGACTTGCATCTATAGCACA；

菌株JYLE-202被鉴定为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）。

因此，将菌株JYLE-202命名为布氏乳杆菌JYLE-202，于2023年4月27日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri，保藏编号为CGMCC No.27224，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

实施例2 制备复合乳酸菌青贮添加剂

本实施例中使用的副干酪乳杆菌JLPF-176、凝结芽孢杆菌BCN019均为自行采集所得。其中，副干酪乳杆菌JLPF-176于2019年6月27日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，保藏编号为CGMCC No.18043，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其它相关信息已公开于专利CN112386615B；凝结芽孢杆菌BCN019于2021年6月23日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏编号为CGMCC No.22764，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其它相关信息已公开于专利CN113789290B。

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基

取葡萄糖20g、酵母浸粉5g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、无水乙酸钠5g、K₂HPO₄·7H₂O2g、柠檬酸三铵2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·4H₂O 0.05g、琼脂15g，将上述原料混合后溶于1000mL蒸馏水，用HCl调pH至6.2，加热混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，制得MRS液体培养基；将灭菌后的MRS液体培养基倒入无菌培养皿中，放凉后制得MRS平板培养基。

（2）取保藏的植物乳杆菌JYLP-376、副干酪乳杆菌JLPF-176、布氏乳杆菌JYLE-202和凝结芽孢杆菌BCN019，分别在MRS平板培养基上活化，挑取活化后的单菌落接种到MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，分别获得JYLP-376菌液、JLPF-176菌液、JYLE-202菌液和BCN019菌液。

（3）分别将上述菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，分别获得JYLP-376菌粉、JLPF-176菌粉、JYLE-202菌粉和BCN019菌粉。

（4）取1重量份JYLP-376菌粉、2重量份JLPF-176菌粉、2重量份JYLE-202菌粉和2重量份的BCN019菌粉进行混合，再与脱脂奶粉（购自新西兰恒天然集团）混合均匀后，制成复合乳酸菌青贮添加剂。

在本实施例中，制备的复合乳酸菌青贮添加剂中菌体数量为2×10¹⁰cfu/g。

实施例3 制备复合乳酸菌青贮添加剂

与实施例2的不同之处在于，步骤（3）中调整悬浊液的浓度为1.5×10¹⁰cfu/mL；步骤（4）取中，取1重量份JYLP-376菌粉、1重量份JLPF-176菌粉、1重量份JYLE-202菌粉和1重量份的BCN019菌粉进行混合，再与脱脂奶粉混合均匀后，制成复合乳酸菌青贮添加剂。

在本实施例中，制备的复合乳酸菌青贮添加剂中菌体数量为1.5×10¹⁰cfu/g。

实施例4 制备复合乳酸菌青贮添加剂

与实施例2的不同之处在于，步骤（3）中调整悬浊液的浓度为2.0×10¹⁰cfu/mL；步骤（4）取中，取1重量份JYLP-376菌粉、0.5重量份JLPF-176菌粉、0.5重量份JYLE-202菌粉和0.5重量份的BCN019菌粉进行混合，再与脱脂奶粉混合均匀后，制成复合乳酸菌青贮添加剂。

在本实施例中，制备的复合乳酸菌青贮添加剂中菌体数量为1×10¹⁰cfu/g。

实施例5 使用不同菌剂制备青贮饲料及效果比较

1、制备青贮饲料

在苜蓿始花期使用青贮机进行收割，收割后运回至公司，将苜蓿秸秆碎料混合均匀后按照每组50kg的量进行均分，分为8组，分别为对照组、实验1组、实验2组、实验3组、对比1组、对比2组、对比3组和对比4组。然后分别取不同青贮添加剂或菌粉按照10⁶cfu/mL加水制成菌液，以20mL/kg的量均匀喷洒在各组苜蓿秸秆碎料上；然后将苜蓿秸秆碎料装入青贮发酵袋（70cm×130cm）中，用真空泵进行真空处理，立即密封常温发酵60天。各组处理具体如下：

对照组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL水；

实验1组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL实施例2制备的复合乳酸菌青贮添加剂菌液；

实验2组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL实施例3制备的复合乳酸菌青贮添加剂菌液；

实验3组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL实施例4制备的复合乳酸菌青贮添加剂菌液；

对比1组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL副干酪乳杆菌JLPF-176菌液；

对比2组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL植物乳杆菌JYLP-376菌液；

对比3组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL布氏乳杆菌JYLE-202菌液；

对比4组：50kg苜蓿秸秆碎料+1000mL凝结芽孢杆菌BCN019菌液。

2、效果比较

（1）感官评价：各组青贮60d后，开袋取样，通过外观颜色、气味等方面对苜蓿青贮饲料进行评价，结果如表1所示。

表1苜蓿青贮饲料感官评价结果

与对照组相比，添加乳酸菌的实验1-3组和对比1-4组能够改善苜蓿青贮饲料的感官评价，用手拿起时松散柔软，略湿润，不粘手，茎叶保持原状，具有很高的辨识度。与对比1-4组相比，实验1-3组添加了复合乳酸菌青贮添加剂，得到的苜蓿青贮饲料酸香味更加浓厚，肉眼可见为黄绿色，质地柔软，茎叶组织保持度高，无粘性或者干硬处，无霉斑。

（2）发酵品质检测

各组苜蓿青贮饲料分别取样20g，溶于180mL无菌蒸馏水中，4℃振荡24h，过滤，对各组滤液中的pH（测定方法参见GB10468-1989）、有机酸（包括乳酸、乙酸、丁酸）和氨态氮含量测定（测定方法参见DB15/T 1455-2018），实验结果如表2所示。

表2 苜蓿青贮饲料发酵品质

注：同列数据后小写字母不同表示差异显著（p<0.05），ND表示未检测到。

由表2数据可知，与对照组相比，实验1-3组和对比1-4组均能显著降低苜蓿青贮饲料的pH和氨态氮含量，显著增加乳酸和乙酸的含量（p<0.05），其中实验1-3组的发酵效果显著优于对比1-4组，可以看出，使用植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、布氏乳杆菌和凝结芽孢杆菌复配得到的复合乳酸菌青贮添加剂中，各青贮效果明显优于单菌剂。

（3）营养成分测定

各组苜蓿青贮饲料分别取样100g，放置于105℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过筛，对营养成分进行测定，干物质含量测定方法参见GB/T 6435-2006，粗蛋白含量测定方法参见GB/T 6432-1994，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量测定采用范式纤维素分析法，可溶性碳水化合物含量测定方法采用蒽酮试剂法，实验结果如表3所示。

表3 苜蓿青贮饲料营养成分

注：同列数据后小写字母不同表示差异显著（p<0.05）。

由表3可知，与对照组相比，实验1-3组和对比1-4组添加了乳酸菌，对苜蓿青贮饲料的干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和可溶性碳水化合物含量影响显著（p<0.05），能够保留更多的干物质和粗蛋白含量，减少中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量，可溶性碳水化合物的含量由于乳酸菌的消耗而减少。其中，实验1-3组添加的复合乳酸菌青贮添加剂对苜蓿青贮饲料中各种营养成分含量的改善效果要显著优于对比1-4组使用的单菌剂。

（4）微生物数量测定

各组苜蓿青贮饲料分别取样10g，溶于90mL无菌生理盐水中，4℃振荡30min后取上清液，检测乳酸菌、酵母菌、霉菌、大肠杆菌的数量，检测结果如表4所示。

表4 苜蓿青贮饲料微生物含量

注：同列数据后小写字母不同表示差异显著（p<0.05），ND表示未检测到。

如表4所示，在苜蓿青贮发酵60天后，对照组的苜蓿青贮饲料检测出1.08Log cfu/g的霉菌，实验1-3组和对比1-4组均未检测出酵母菌、霉菌和大肠杆菌，可以看出添加乳酸菌对酵母菌、霉菌和大肠杆菌的繁殖具有抑制效果。此外，根据各组乳酸菌数量检测结果，可以看出添加不同的乳酸菌对青贮发酵结束后的乳酸菌数量有显著影响，实验1-3组的乳酸菌数量显著高于对照组和对比1-4组（p<0.05）。

尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1. 一种复合乳酸菌青贮添加剂，其特征在于，包括1重量份植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JYLP-376菌粉、0.5~2重量份副干酪乳杆菌（Lactiparacaseibacillus paracasei）JLPF-176菌粉、0.5~2重量份布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）JYLE-202菌粉、0.5~2重量份凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BCN019菌粉；植物乳杆菌JYLP-376的保藏日期为2019年7月8日，保藏编号为CGMCC No.18099；副干酪乳杆菌JLPF-176的保藏日期为2019年6月27日，保藏编号为CGMCCNo.18043；布氏乳杆菌JYLE-202的保藏日期为2023年4月27日，保藏编号为CGMCCNo.27224；凝结芽孢杆菌BCN019的保藏日期为2021年6月23日，保藏编号为CGMCCNo.22764。

2.如权利要求1所述的复合乳酸菌青贮添加剂，其特征在于，包括1重量份植物乳杆菌JYLP-376菌粉、1重量份副干酪乳杆菌JLPF-176菌粉、1重量份布氏乳杆菌JYLE-202菌粉、1重量份凝结芽孢杆菌BCN019菌粉。

3.如权利要求1或2所述的复合乳酸菌青贮添加剂，其特征在于，还包括脱脂奶粉。

4.如权利要求1所述的复合乳酸菌青贮添加剂，其特征在于，复合乳酸菌青贮添加剂中的菌体数量为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/g。

5.一种如权利要求1所述的复合乳酸菌青贮添加剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；

（2）分别在MRS平板培养基上活化植物乳杆菌JYLP-376、副干酪乳杆菌JLPF-176、布氏乳杆菌JYLE-202和凝结芽孢杆菌BCN019，挑取活化后的单菌落接种到MRS液体培养基中，培养分别获得植物乳杆菌JYLP-376菌液、副干酪乳杆菌JLPF-176菌液、布氏乳杆菌JYLE-202菌液和凝结芽孢杆菌BCN019菌液；

（3）分别将上述菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度，冷冻干燥后得到植物乳杆菌JYLP-376菌粉、副干酪乳杆菌JLPF-176菌粉、布氏乳杆菌JYLE-202菌粉和凝结芽孢杆菌BCN019菌粉；

（4）将上述菌粉按比例进行混合，制成复合乳酸菌青贮添加剂。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，培养温度为37℃，培养时间为24h。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×10¹⁰~2.0×10¹⁰cfu/mL。

8.一种如权利要求1所述复合乳酸菌青贮添加剂在苜蓿青贮方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，使用方法为：取复合乳酸菌青贮添加剂按照10⁶cfu/mL加水制成菌液，以20mL/kg的量均匀喷洒在苜蓿秸秆碎料上，然后将苜蓿秸秆碎料装入青贮发酵袋中，真空处理后立即密封常温发酵。