CN114540234B - 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用 - Google Patents

一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114540234B
CN114540234B CN202210204293.XA CN202210204293A CN114540234B CN 114540234 B CN114540234 B CN 114540234B CN 202210204293 A CN202210204293 A CN 202210204293A CN 114540234 B CN114540234 B CN 114540234B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silage
lactobacillus pentosus
lactobacillus
pentosus
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210204293.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114540234A (zh
Inventor
关皓
李海萍
周青平
刘文辉
贾志锋
马祥
刘勇
汪辉
陈仕勇
魏小星
鲍根生
梁国玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest Minzu University
Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine
Original Assignee
Southwest Minzu University
Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest Minzu University, Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine filed Critical Southwest Minzu University
Priority to CN202210204293.XA priority Critical patent/CN114540234B/zh
Publication of CN114540234A publication Critical patent/CN114540234A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114540234B publication Critical patent/CN114540234B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/167—Pentosus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Abstract

本发明公开一种戊糖乳杆菌，具体为戊糖乳杆菌260(Lactiplantibacilluspentosus 260)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23168，所述戊糖乳杆菌260的16S rDNA如SEQ ID NO.3所示。所述戊糖乳杆菌260具有良好的抗冻融性，耐酸性、耐盐性佳。用戊糖乳杆菌260处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH和干物质损失，对环境的适应性佳。

Description

一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用。
背景技术
青贮是将青饲料压实密封，通过饲草附生微生物乳酸菌进行厌氧发酵，将水溶性碳水化合物转变成有机酸，从而减少养分流失又有利于动物消化吸收的一种技术。
燕麦具有较高的粗蛋白含量、营养成分高、缓冲能低，青贮后的营养品质要高于青干草，但是附生乳酸菌的数量较少，低于5log10cfu/gFM。加之，青藏高原地区冷季昼夜温差大，燕麦青贮存在反复冻融现象，容易出现以下结果：一、发酵不足，附生乳酸菌量较少，在发酵初期难以成为优势菌群、底物竞争力差；二、发酵不稳定，由于附生乳酸菌数量少，难以迅速形成酸性环境，无法有效抑制霉菌和腐败菌的大量繁殖，容易出现霉变，营养品质层次不齐；三、二次发酵，青贮开窖后真菌、霉菌大量滋生，容易发生二次发酵，进而导致短时间内有氧变败，难以储存。所以附生乳酸菌的种类和数量以及环境温差是影响青藏高原地区燕麦青贮的主要难题，且目前未见对于抗冻融乳酸菌的报道。
发明内容
在上述背景基础上，本发明提供了一种戊糖乳杆菌260，所述戊糖乳杆菌260可提高青贮饲料的质量，用戊糖乳杆菌260处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH和干物质损失，耐冻融性和耐酸性佳，对环境的适应性佳，冻融条件培养下，戊糖乳杆菌260生长和产酸无明显的迟缓期，能达到快速产酸以实现较低pH的效果。
第一方面，本发明提供一种戊糖乳杆菌，所述戊糖乳杆菌具体为戊糖乳杆菌260(Lactiplantibacillus pentosus 260)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.23168，保藏日期为2021年08月20日。
所述戊糖乳杆菌260的16S rDNA如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本发明提供一种抑菌剂，所述抑菌剂的活性成分为戊糖乳杆菌260(Lactiplantibacillus pentosus 260)。
优选的，所述抑菌剂中还包括本领域技术人员知晓的辅料，所述抑菌剂可为混悬剂、分散剂、溶液剂。
第三方面，本发明提供一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂中的活性成分为戊糖乳杆菌260(Lactiplantibacillus pentosus 260)。
第四方面，本发明提供一种青贮饲料，所述青贮饲料中含有戊糖乳杆菌260(Lactiplantibacillus pentosus 260)。
第五方面，本发明提供一种戊糖乳杆菌的应用，包括如下任意一种中的应用：
(a1)制备抑菌剂；
(a2)制备青贮饲料添加剂；
(a3)制备青贮饲料中的应用。
优选的，所述抑菌剂为可抑制酵母菌、霉菌和肠道菌的生物制剂。
优选的，所述戊糖乳杆菌的应用是在-5℃至20℃反复冻融条件下进行。
所述青贮饲料添加剂在制备所述青贮饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明提供一种制备青贮饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与戊糖乳杆菌260混合，进行固体厌氧发酵，得到的发酵产物即青贮饲料。
所述青贮原料为燕麦全株，具体为乳熟期燕麦全株。
所述青贮原料与戊糖乳杆菌260的配比为100g:(106-107)cfu，优选的，所述青贮原料与戊糖乳杆菌260的配比为100g:(3×106-5×106)cfu。
本发明提供的戊糖乳杆菌260具有耐盐、耐酸，繁殖并且产生乳酸等活性酸物质，能有效降低青贮饲料的pH，有效抑制青贮饲料中酵母菌、霉菌和一些肠道菌的生长。戊糖乳杆菌260菌株可有效保持燕麦青贮的营养品质，减缓青贮过程中饲料腐败变质，是一种良好的青贮饲料添加剂。
保藏说明
菌种名称：戊糖乳杆菌
拉丁名：Lactiplantibacillus pentosus 260
保藏编号：CGMCCNo.23168
本发明中所述的20/-5℃、-5/20℃表示温度交替变化，例如20/-5℃是指20℃处理12小时，-5℃处理12小时，以此为一个循环，交替进行。
附图说明
图1 37℃条件下乳酸菌生长曲线
图2 20/-5℃条件下乳酸菌生长曲线
图3 37℃条件下乳酸菌产酸曲线
图4 20/-5℃条件下乳酸菌产酸曲线
图5乳酸菌系统发育树
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1戊糖乳杆菌260的分离与筛选过程
于2021年1月到4月底在青海省海北、海东、海南和西宁地区采集，共从19个采样地采取了57份青贮样品和1份牧民自制酸奶样品(样品采集地信息如表1所示)。采样后，从青贮样品中分别称取20g于180mL无菌蒸馏水中在4℃下震荡1h，再在无菌蒸馏水中连续稀释10-1至10-5，分别取原液，10-3、10-5倍样品稀释液涂布在固体MRS培养基(陆桥科技有限公司，北京，中国)上培养48h。挑选出生长速度快的乳酸菌将其接种到液体MRS培养基中37℃培养48h后，进行不断划线纯化，对乳酸菌进行分离。
为了确保更真实的反应原料和青贮中乳酸菌群落结构，从每种样品固体MRS培养基中随机抽取10株左右菌株，共收集437株菌，通过革兰氏染色试验确定其中437株为乳酸菌，将437株乳酸菌放入加有甘油的保藏管中-20℃保存。
对挑选出的437株乳酸菌进行初次筛选，分别在0℃24h、先-5℃12h后20℃12h、先20℃12h后-5℃12h培养，然后测其pH值和OD值，从中筛选出生长效率最高、产酸能力最强(pH值小且OD大)的菌株作为候选菌株，共挑选出15株菌，编号分别为9、10、67、74、103、117、157、160、248、260、270、286、365、376、407。
乳杆菌16S rRNA测序分析
对筛选出的15株菌进行基因组提取。将15株乳酸菌置于37℃中过夜培养，10,000g离心5min，用TE缓冲液在15mL离心管中洗涤2次后再离心。DNA提取采用TIANamp细菌DNA试剂盒(DP302-02，天根，北京，中国)。DNA使用前保存在-20℃，对15株乳酸菌16S rRNA序列进行PCR扩增。1μL DNA作为模板，PCR引物为27f(SEQ ID NO.1)和1492r(SEQ ID NO.2)，反应体系为20μL体系。PCR程序：95℃下处理5min，94°C变性30s，在55℃下退火1min，循环30次，72℃延伸15min，最后72℃保温10min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳在1×TBE缓冲液中检测PCR产物质量，合格的PCR产物送上海生工公司进行序列分析。利用BLAST分析方法，将测得的16S rDNA序列与GenBank的16S rRNA序列进行比对，相似度高于99％的序列被认为是同一株菌。分析得到戊糖乳杆菌的16s rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
CGCCGTGCGGGGTGCTATACATGCAAGTCGTACGAACTGCTGTGTATTG
ATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTGTGAGTGAGTGGCGAACTGGTG
AGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAA
ACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTG
AAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCT
AGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTG
AGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGA
GCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTG
TTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTT
AACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT
AGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGC
GGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCA
TCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATG
TGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGG
CGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGC
AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCT
AAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGC
ATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGA
CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACG
CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTA
GACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG
CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA
TTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGA
CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATG
ACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAAC
TCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAG
GCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA
GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC
ACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGA
ACCAGCCGCCTAAGTGACAGAGGG
SEQ ID NO.1 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
SEQ ID NO.2 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3'
对筛选出的15株菌分别进行糖发酵试验、耐温试验、耐酸试验、耐盐试验、绿汁发酵实验。方法及结果如下所述：
(1)糖发酵试验
采用试剂盒方法进行，试剂盒购自陆桥科技有限公司，北京，中国，结果如下表所示：
表1乳酸菌糖发酵特性
Figure GDA0004182382260000061
Figure GDA0004182382260000071
表中+，90％及以上菌株可发酵该物质；-，90％及以上菌株不可发酵该物质；W.可发酵少量该物质
(2)耐温试验
将筛选的15株菌接种至MRS液体培养基中，分别置于5、10、15、20、30、50℃培养箱中，培养2d后于600nm处测定培养基OD值，每个处理重复3次，结果如下表所示：
表2乳酸菌耐温特性
处理 9 10 67 74 103 117 157 160 248 260 270 286 365 376 407
5℃ + + + + + + + + + + + + + ++ +
10℃ + + + + ++ + ++ ++ ++ + + + + + +
15℃ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ + ++ + + + +
20℃ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
30℃ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
50℃ ++ + + + + + + + + + + + + + +
w,OD<0.3；+,0.3<OD<0.5；++,OD>0.5.
(3)耐酸试验
用经过无菌处理的HCl溶液和NaOH溶液调整MRS液体培养基pH，将筛选的15株菌分别接种至pH为3.0、3.5、4.0、5.0、6.0的MRS液体培养基中，分为两组，分别在37℃和10℃的培养箱中培养2d，于600nm处测定培养基OD值，结果如下表所示：
表3乳酸菌耐酸特性
Figure GDA0004182382260000081
w,OD<0.3；+,0.3<OD<0.5；++,OD>0.5.
(4)耐盐试验
将筛选的15株菌接入NaCl溶液体积分数为3.0％和6.5％的MRS液体培养基中，分为两组，分别在37℃和10℃的培养箱中培养2d，于600nm处测定培养基OD值，结果如下表所示：
表4乳酸菌耐盐特性
Figure GDA0004182382260000082
w,OD<0.3；+,0.3<OD<0.5；++,OD>0.5.
(5)绿汁发酵实验
每4个小时测其pH值，连续测60h后从中选出能快速降低pH的菌株，结果如下表所示：
表5乳酸菌绿汁发酵实验pH
Figure GDA0004182382260000091
结合糖发酵特性、生理生化特性、绿汁发酵实验和测序结果筛选出了160、248和260三株菌。接下来做三株菌的生长曲线和产酸曲线。如生长曲线(图1)和产酸曲线(图3)所示，在37℃生长条件下，筛选出的3株菌可以在14小时内迅速生长，且将pH降到4以下。20/-5℃条件下的生长曲线(图2)和产酸曲线(图4)所示，筛选出的3株菌也能在两天内生长到最大值，且将pH降到4以下。
通过利用MEGA7软件，以枯草芽孢杆菌NCDO1769为外群构建了筛选出的3株菌的系统发育树，如图5所示，160与植物乳杆菌亲缘关系最近，248与短乳杆菌亲缘关系最近，260与戊糖乳杆菌亲缘关系最近。结合生理、生化特征和16S rRNA测序分析，鉴定260为戊糖乳杆菌。
综合上述分析，本发明提供的戊糖乳杆菌260生长速度快，产酸能力强，对糖源利用范围广，对酸性环境有较好的适应性，可以作为冻融条件下燕麦青贮的候选菌株添加剂。
实施例2青贮饲料的制备
供试燕麦于乳熟期离地10cm收割，揉丝机切短揉丝后，经短暂晾晒后充分混合，选择前述筛选出的1株优质抗冻融戊糖乳酸菌260和商业菌作为接种剂，将菌株培养溶解稀释至106cfu/mL左右，每100g切碎的原料(1-2cm)中均匀喷洒3mL菌液，充分混合，对照喷洒量的灭菌蒸馏水。将处理好的700g燕麦装入聚乙烯塑料袋中压实后抽真空，每组处理3个重复，分别放置在20℃、20/-5℃(交替，各12h)培养箱中，于青贮60天开袋，所有样品进行微生物群落分析以及化学成分、发酵品质分析。
一、青贮饲料营养品质检验
将样品置于65℃的空气循环烘箱中72h后测定干物质(DM)，并将干燥的样品用研磨机研磨后过1mm筛子用于化学成分分析。使用Ankom 200系统(Ankom TechnologyCorporation，Fairport，纽约，美国)测试中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)。粗蛋白(CP)用凯氏定氮法测定，可溶性碳水化物(WSC)用蒽酮-硫酸法测定，结果如下表所示：
表6燕麦青贮60d的营养品质
Figure GDA0004182382260000101
同列数据后不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(*p<0.05,**p<0.01).NS,不显著；SEM,标准误；DM,干物质
根据上表检测结果可知，燕麦青贮60天后都会有干物质损失，其中戊糖乳杆菌260处理组的干物质损失较CK组有所降低。戊糖乳杆菌260处理组的中、酸洗含量与CK相比有所降低，但是不显著。在20℃或20/-5℃条件下，戊糖乳杆菌260处理组粗蛋白含量均有升高。通过双因素方差分析，灰分、干物质、干物质损失、中、酸洗和可溶性糖都与温度和菌剂的交互显著相关，戊糖乳杆菌260菌株有效保持了燕麦青贮的营养品质。
二、青贮饲料发酵特性检验
称取20g鲜样和180mL双蒸水置于搅拌机中搅拌1min后使用双层棉纱布过滤，滤液一部分用于测试pH((PHSJ-5；LEICI，上海，中国)，另取一部分用于测试有机酸和NH3-N。测有机酸部分用50％的H2SO4酸化，并12,000rpm，4℃离心15分钟(5810R，Eppendorf，汉堡，德国)，取上清液过0.22um滤膜过滤，滤液通过具有UV检测器(210nm)和色谱柱柱(KC-811，Shimadzu Co.Ltd.，京都，日本)的高效液相色谱(1100，Agilent Technologies Inc，加州，美国)测试乳酸、乙酸、丁酸和丙酸的含量。流动相为0.1％的H3PO4，柱温为50℃，流速为0.5mL/min。为测试NH3-N含量，将滤液与三氯乙酸以4:1的体积比混合，并放置在4℃的冰箱中过夜以沉积蛋白质，随后，12,000g离心15min，取上清液用于测定NH3-N，结果如下表所示：
表7燕麦青贮60d的发酵特性
Figure GDA0004182382260000121
同列数据后不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(*p<0.05,**p<0.01).NS：不显著；SEM：标准误；DM：干物质；TN：总氮；ND：没有检测到
从上表数据可以看到，青贮60d后，在20℃或20/-5℃条件下，戊糖乳杆菌260处理组的pH显著低于CK组和商业菌。戊糖乳杆菌260处理组氨态氮占总氮的比例显著低于CK组。戊糖乳杆菌260处理组的乳酸含量显著高于CK、商业菌组。戊糖乳杆菌260处理组的乙酸显著高于CK处理组，乳酸/乙酸显著低于对照。丙酸和丁酸在各个处理组中均未发现。通过双因素方差分析，氨态氮/总氮、乳酸、乙酸和乳酸/乙酸与温度、菌剂和两者交互都极显著相关，而pH只与菌剂显著相关。综上所述，戊糖乳杆菌260能够在青贮中产生更多乳酸以快速降低pH，减缓青贮过程中饲料腐败变质。
三、青贮饲料微生物检测
用平板计数法对青贮微生物进行计数，具体操作为：无菌环境中准确称取20g加入180mL灭菌生理盐水(0.85％)，4℃震荡1h，然后用无菌水进行10-1到10-7梯度稀释，选三个适宜稀释度，每个稀释度取0.l mL分别涂布计数培养基上。MRS培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基(VRBA)分别用于乳酸菌、酵母菌、霉菌、肠道菌的计数。MRS在30℃下厌氧培养48h对乳酸菌计数；PDA在30℃下有氧培养72h对酵母菌、霉菌计数；VRBA在37℃下有氧培养24h对肠道菌计数。酵母菌和霉菌的培养都在PDA培养基中，培养后根据菌落形态区分酵母菌和霉菌(霉菌要长毛)。待培养结束后，选取菌落数为30-300的平板培养基进行计数，计数后按照以下公式进行计算：cfu/g＝同一稀释度的重复平板上菌落平均数*稀释倍数/含菌样品克数，结果如下表所示：
表8燕麦青贮60d后微生物计数
Figure GDA0004182382260000131
根据上表数据可以看出，青贮60d后，在20/-5℃条件下，戊糖乳杆菌260处理组的大肠杆菌、酵母和霉菌数量与CK相比有显著下降，说明戊糖乳杆菌260在20/-5℃条件下有效抑制了大肠杆菌、酵母菌和霉菌的生长。同时，与CK组相比，在20℃或20/-5℃条件下，戊糖乳杆菌260处理组的乳酸菌数量均有所增加，说明戊糖乳杆菌260具有促进乳酸菌生长的作用。
四、青贮饲料有氧稳定性检测
青贮60d后打开青贮袋，均匀取800g的样品放入2L干净的无菌烧杯中压实，用两层粗棉布覆盖。将所有样品分别放置在室温和之前处理温度中5天。通过实时温度记录仪(MT-X；神华科技有限公司，中国深圳)每5分钟测量一次青贮核心区域(深度为10cm)的温度，持续5d。通过测量有氧暴露前后样品重量的差值来计算DM的损失。取有氧暴露5d后的样品，分析其发酵质量(20g)和微生物计数(20g)。有氧稳定性的计算基于暴露于空气中的青贮饲料的温度超过基准环境温度2℃所持续的时间。
表9燕麦青贮有氧暴露5d后的发酵特性
Figure GDA0004182382260000141
同列数据后不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(*p<0.05,**p<0.01).NS：不显著；SEM：标准误；DM：干物质；TN：总氮；ND：没有检测到
表10燕麦青贮有氧变败时长
Figure GDA0004182382260000142
从上表数据可知，有氧暴露5天后，在20/-5℃条件下，戊糖乳杆菌260处理组的pH显著低于CK组、商业菌处理组。戊糖乳杆菌260处理组的乳酸含量显著高于CK组，乙酸含量显著高于CK组，乳酸/乙酸比也显著高于CK组。表10中，戊糖乳杆菌260处理组的有氧变败时长明显高于CK组、商业菌处理组，说明戊糖乳杆菌260处理组通过产生大量乳酸和乙酸，形成酸性环境，有效抑制酵母菌、霉菌等的生长，从而提高了燕麦青贮的有氧稳定性。
综上所述，本发明提供的戊糖乳杆菌260具有高产乳酸、保持青贮牧草营养品质、延长有氧变败时间等优点，可以作为青贮饲料中的接种菌剂。
本发明涉及的数据分析，采用社会科学统计软件包(SPSS Version 19.0,SPSSInc.，Chicago,IL,USA)的GLM程序进行统计分析。采用单因素方差分析法(ANOVA)，对发酵过程中的化学成分、发酵特性、微生物计数、a-曲霉毒素b1和好氧稳定性进行了分析。采用Turkey诚实显著性差异(HSD)检验对不同的样本均值进行检验，p<0.05为显著。
以上具体实施方式只是对本发明内容的示意性说明，不代表本发明内容的限制。本领域技术人员可以想到的是本发明中具体结构可以有其它的变化形式。
序列表
<110> 西南民族大学
青海省畜牧兽医科学院
<120> 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac t 21
<210> 3
<211> 1474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgccgtgcgg ggtgctatac atgcaagtcg tacgaactgc tgtgtattga ttggtgcttg 60
catcatgatt tacattgtga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc 120
cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca 180
tggtccgagt ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag 240
ctagatggtg gggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggtaat 300
cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360
tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc 420
gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta 480
tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540
gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga 600
aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg 660
acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720
aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc 840
ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg 900
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc 1020
ccttcgggga catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt gccagcatta agttgggcac 1140
tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200
cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc 1260
gagagtaagc taatctctta aagccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta 1320
catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380
ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa 1440
ccttttagga accagccgcc taagtgacag aggg 1474

Claims (8)

1.一种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)，其特征在于，所述戊糖乳杆菌具体为戊糖乳杆菌260，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23168。
2.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂的活性成分为权利要求1中所述的戊糖乳杆菌260。
3.一种青贮饲料添加剂，其特征在于，所述青贮饲料添加剂中的活性成分为权利要求1中所述的戊糖乳杆菌260。
4.一种青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料中含有权利要求1中所述的戊糖乳杆菌260。
5.一种权利要求1所述的戊糖乳杆菌的应用，包括如下任意一种中的应用：
(a1)制备抑菌剂，所述抑菌剂为抑制酵母菌、霉菌和肠道菌的生物制剂；
(a2)制备青贮饲料添加剂；
(a3)制备青贮饲料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述戊糖乳杆菌的应用是在-5℃至20℃反复冻融条件下进行。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反复冻融条件为-5℃至20℃
8.一种制备青贮饲料的方法，所述方法包括：将青贮原料与权利要求1所述的戊糖乳杆菌260混合，进行固体厌氧发酵，得到的发酵产物即青贮饲料，所述青贮原料为燕麦全株，青贮原料与戊糖乳杆菌260的配比为100g:(106-107)cfu。
CN202210204293.XA 2022-03-02 2022-03-02 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用 Active CN114540234B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210204293.XA CN114540234B (zh) 2022-03-02 2022-03-02 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210204293.XA CN114540234B (zh) 2022-03-02 2022-03-02 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114540234A CN114540234A (zh) 2022-05-27
CN114540234B true CN114540234B (zh) 2023-05-16

Family

ID=81661512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210204293.XA Active CN114540234B (zh) 2022-03-02 2022-03-02 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540234B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891659B (zh) * 2022-03-02 2023-05-26 西南民族大学 一种短乳杆菌248及其应用
CN114854642B (zh) * 2022-05-30 2023-04-18 中国农业大学 一种苜蓿内生戊糖片球菌el5及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61209554A (ja) * 1985-03-14 1986-09-17 Oosakashi サイレ−ジの製造方法
WO2005103294A1 (en) * 2004-04-24 2005-11-03 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Genomic microarray for detecting lactic acid bacteria and method for diagnosing lactic acid bacteria using it
CN102286392A (zh) * 2011-03-01 2011-12-21 安徽农业大学 一种戊糖乳杆菌和该乳杆菌的发酵产物以及发酵产物的用途
CN106173246A (zh) * 2016-07-22 2016-12-07 陈日远 一种复合微生物青贮添加剂以及在制备籽粒苋青贮饲料中的应用
CN106418453A (zh) * 2016-10-17 2017-02-22 陈俊川 一种发酵工艺生产南瓜酱的方法
CN106591176A (zh) * 2016-11-24 2017-04-26 江苏绿科生物技术有限公司 一种戊糖乳杆菌及其应用
CN110024903A (zh) * 2019-04-26 2019-07-19 西南民族大学 复合菌固态耗氧发酵优化的蛋白质饲料及其制备方法
MY173974A (en) * 2011-11-02 2020-03-02 Univ Putra Malaysia A method for isolating potential lactic acid bacteria (lab) facilitating reduction of ruminal gas production per unit of volatile fatty acids (vfa) in a rumen of a ruminant
CN113604392A (zh) * 2021-08-17 2021-11-05 兰州大学 降解高效氯氰菊酯的戊糖乳杆菌及菌剂及用途及添加该菌的青贮饲料

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110189747A1 (en) * 2008-08-05 2011-08-04 Chr-Hansen A/S Process for producing silage for biogas production

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61209554A (ja) * 1985-03-14 1986-09-17 Oosakashi サイレ−ジの製造方法
WO2005103294A1 (en) * 2004-04-24 2005-11-03 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Genomic microarray for detecting lactic acid bacteria and method for diagnosing lactic acid bacteria using it
CN102286392A (zh) * 2011-03-01 2011-12-21 安徽农业大学 一种戊糖乳杆菌和该乳杆菌的发酵产物以及发酵产物的用途
MY173974A (en) * 2011-11-02 2020-03-02 Univ Putra Malaysia A method for isolating potential lactic acid bacteria (lab) facilitating reduction of ruminal gas production per unit of volatile fatty acids (vfa) in a rumen of a ruminant
CN106173246A (zh) * 2016-07-22 2016-12-07 陈日远 一种复合微生物青贮添加剂以及在制备籽粒苋青贮饲料中的应用
CN106418453A (zh) * 2016-10-17 2017-02-22 陈俊川 一种发酵工艺生产南瓜酱的方法
CN106591176A (zh) * 2016-11-24 2017-04-26 江苏绿科生物技术有限公司 一种戊糖乳杆菌及其应用
CN110024903A (zh) * 2019-04-26 2019-07-19 西南民族大学 复合菌固态耗氧发酵优化的蛋白质饲料及其制备方法
CN113604392A (zh) * 2021-08-17 2021-11-05 兰州大学 降解高效氯氰菊酯的戊糖乳杆菌及菌剂及用途及添加该菌的青贮饲料

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Impacts of low temperature and ensiling period on the bacterial community of oat silage by SMRT;Xiaomei Li等;Microorganisms;全文 *
戊糖乳杆菌发酵香蕉副产物的初步试验;谢瑞营等;广西农学报;全文 *
抗冻融乳酸菌的筛选及其对燕麦青贮品质和有氧稳定性的影响;李海萍等;草业学报;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114540234A (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114437991B (zh) 一种植物乳杆菌160及其应用
CN114540234B (zh) 一种戊糖乳杆菌及其在抗冻融青贮中的应用
CN110591988B (zh) 鼠李糖乳杆菌753及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料
CN110643544B (zh) 副干酪乳杆菌761及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料
CN110591987B (zh) 唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料
CN107974421B (zh) 一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂
CN114891660A (zh) 一种复合菌剂及其应用
CN110106102B (zh) 耐寒短杆菌zl-2及其堆肥低温启动菌剂的制备方法与应用
CN113736716B (zh) 一株副干酪乳杆菌及黄贮复合生物发酵剂和黄贮方法
CN108060104A (zh) 一种植物乳杆菌及其应用、筛选检定方法
WO2022207015A2 (zh) 一种香肠乳杆菌sr2及其应用
CN103525724A (zh) 一种棉粕微生物发酵剂及其制备方法
CN114891659B (zh) 一种短乳杆菌248及其应用
CN108060103B (zh) 一种戊糖片球菌及其应用、筛选检定方法
CN108265016A (zh) 一种乳酸菌添加剂及其应用、制备方法
CN114908018B (zh) 一种短乳杆菌及其在青贮中的应用
CN115011515B (zh) 一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用
CN106591176B (zh) 一种戊糖乳杆菌及其应用
Li et al. Effect of different dry matter content on fermentation characteristics and nutritional quality of Napier grass silage with novel lactic acid bacteria strains
CN113717887B (zh) 一种鹅源植物乳杆菌及其应用
CN106615609B (zh) 一种可提高饲料青贮品质的布氏乳杆菌及其应用
CN108179127B (zh) 一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法
CN115011497A (zh) 乳酸片球菌及其应用
CN110951654A (zh) 一种植物乳杆菌增殖剂及其应用
CN117778278B (zh) 一种复合乳酸菌青贮添加剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant