CN115011515B - 一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用 - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
- A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
- A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
- A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract
一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用，它涉及农业领域，本发明要解决目前苜蓿青贮过程中功能性成分含量难以提高的问题，本发明的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AS98，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年12月20日，保藏号为CGMCCNo.24146。本发明基于苜蓿青贮过程中植物醇含量变化规律的研究，分离鉴定苜蓿青贮过程中减少植物醇损失的优势菌株，为生产富集植物醇的优质功能性苜蓿饲料提供科学的理论依据，对在动物养殖过程中减少药物的使用，生产功能性畜产品，保护人类的健康具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及农业领域，具体涉及一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是奶牛等草食家畜的重要粗饲料。我国苜蓿主生产区的收割季节，阴雨较多，且叶片易于脱落，造成养分损失，难以晒制优质干草。与之相比，苜蓿青贮调制受气候影响较小，能最大程度地保留营养成分，延长苜蓿供应周期，并且可以提高饲料的适口性和消化率，越来越得到生产者的青睐。
植物醇简称叶醇，亦称植物醇，分子式为C20H40O，其基本化学结构为3，7，11，15-四甲基己烯-1-醇，是植物叶绿素分子中的一种含有多支链的脂肪醇。叶绿素分子主要包括1个卟啉环和1个脂肪烃侧链两个部分，卟啉环为核心部分，中心含有1个镁离子，脂肪烃侧链称为叶绿醇基，其游离态分子即被称之为植物醇。植物醇具有良好的抗氧化作用，可作为饲料或食品的乳化剂、抗氧化剂、营养添加剂等，也是工业合成生产维生素E、维生素K1的基本原料之一。植物醇不仅具有良好的抗氧化作用，而且与其体内代谢产物植烷酸一样，在机体组织的糖脂代谢和脂肪细胞分化的调控过程中作为信号分子。对调节糖代谢及脂肪代谢具有重要作用，可极大地降低人或动物脂肪肝和糖尿病的发病率。
研究表明，牧草青贮可能减少植物醇在贮藏过程中的损失，或者可能促进植物醇生成，可能是保存或提高饲料中植物醇含量、提高牛奶及奶制品中植烷酸的行之有效的方法。在苜蓿青贮中含有某种特异性的优势菌群时，这种特异性的优势菌群可能可以吸收或吸附植物醇，或者与游离的植物醇结合，以此减少青贮中植物醇的损失。也是目前研究的趋势。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前苜蓿青贮过程中功能性成分含量难以提高的问题，而提供一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用。
本发明的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株，它为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS98，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年12月20日，保藏号为CGMCC No.24146。
本发明的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，是将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS98用于提高苜蓿青贮饲料的植物醇含量。
进一步地，所述的提高植物醇含量是提高常温下苜蓿青贮饲料植物醇含量。
本发明的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，是将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS98用于改善苜蓿青贮饲料品质。
进一步地，所述的改善苜蓿青贮品质是指通过加入植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)AS98提高苜蓿青贮饲料中乳酸和乙酸的含量，降低氨态氮/总氮的的含量。
本发明的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，是将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS98用于降低苜蓿青贮饲料中有害菌的数量。
进一步地，所述的有害菌的数量为好氧性细菌或酵母菌。
本发明包含以下有益效果：
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS98的添加能提高苜蓿青贮饲料的感官品质，显著降低pH值，显著提高LA、AA含量；添加AS98可以显著降低NH3-N/TN。 DM、OM、CP和WSC含量均显著高于其他处理组，NDF和ADF含量显著低于其他组。添加植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AS98的乳酸菌数量均显著高于无添加组，好氧性细菌、芽孢杆菌和酵母菌数量均显著低于无添加组，其中添加AS98组的乳酸菌数量最高，好氧性细菌和酵母菌数量最低；均未检测出大肠杆菌、霉菌和梭菌。添加植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)AS98可以提高植物醇的含量。
本发明基于苜蓿青贮过程中植物醇含量变化规律的研究，分离鉴定苜蓿青贮过程中减少植物醇损失的优势菌株，为生产富集植物醇的优质功能性苜蓿饲料提供科学的理论依据，对在动物养殖过程中减少药物的使用，生产功能性畜产品，保护人类的健康具有重大意义。
附图说明
图1为本发明的技术路线图；
图2为本发明部分革兰氏染色结果图；
图3为分离乳酸菌的16S rRNA序列扩增电泳图；其中，M：DL2000；—：阴性对照； 1-5分别为AS7、AS19、AS21、AS49、AS98菌株PCR产物；
图4为分离菌株AS7、AS19、AS21、AS49、AS98基于16S rRNA序列构建的系统进化树图；
图5为乳酸菌菌株产酸速率图；其中，A为AS21，B为AS49，C为AS98；
图6为乳酸菌菌株生长速率图；其中，A为AS98，B为AS49，C为AS21。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例的苜蓿青贮中减少植物醇损失的优势菌株分离鉴定如下：
1、材料与方法
1.1试验材料
供试苜蓿刈割于黑龙江省大庆市让胡路喇嘛甸镇红骥牧场，距离地面2～3cm刈割，时间为2019年9月25日。
采用单因素完全随机试验设计。紫花苜蓿于通风阴凉处将含水量晾晒至45％～50％，切碎至2～3cm作为青贮原料，其化学成分及微生物附着情况见表1。将调整好水分的苜蓿样品装袋(每袋约200g)真空密封，室内常温发酵0、1、3、5、7、15、30、60天开封，测定相关指标。
表1供试苜蓿一般化学成分
注：FM：鲜物。
1.2主要仪器设备
见表2。
表2主要仪器设备
1.3试验方法
1.3.1乳酸菌的分离与纯化
分别称取密封发酵30、60天的苜蓿青贮饲料10g，加入90mL无菌蒸馏水，于均质器拍打90s，取过滤浸提液即形成10-1稀释液，用无菌蒸馏水进行梯度稀释为10-2、10-3、10-4、10-5后进行涂板，选用MRS固体培养基进行乳酸菌的分离培养(30℃厌氧，48h)，挑取典型单个菌株，记录菌落形态后，于固体培养基中进行划线后培养(30℃厌氧，48h)，重复划线培养3次，得到纯化的单菌株，使用微生物冷冻保存培养液(使用Nutrient Broth营养肉汤和二甲基亚砜配制，二甲基亚砜终浓度为10％)于-80℃保存备用。
1.3.2乳酸菌的筛选
将上述挑取的乳酸菌进行初步筛选鉴定，进行二分划线、过氧化氢酶试验和革兰氏染色镜检试验。
二分划线法：使用MRS固体培养基，使用记号笔将培养基二等分，取上述挑取的不同菌株两两划线于二等分的培养基上，30℃厌氧培养48h，观察并筛选不同菌落形态的菌株进行下一步筛选试验。
过氧化氢酶试验：用接种环沾取单个菌株涂抹于过氧化氢酶溶液中，若产生气泡为阳性，未产生气泡为阴性。
革兰氏染色：根据上述筛选结果选取菌株进行革兰氏染色。凡是过氧化氢酶阴性和革兰氏染色阳性的菌株，均初步鉴定为乳酸菌，接着在MRS固体培养基上划线纯化两次后，使用微生物冷冻保存培养液于-80℃保存备用。
1.3.3乳酸菌的16S rRNA序列分析
将待测菌株接入MRS液体培养基中，30℃厌氧培养48h后，12 000rpm/min离心10min，弃上清液，沉淀用于DNA提取，具体操作严格按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行。根据参考文献选择细菌通用引物，27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)， 1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，目的片段约为1500bp，引物均由哈尔滨擎科生物技术有限公司合成。
取待测菌株样本DNA为模板DNA，采用50μL体系进行PCR扩增，所用试剂及加样用量为：2×Taq PCR Master Mix 2 5μL，引物(10pmol/μL)各2μL，ddH2O 19.6μL，模板1.4μL。加样后充分混匀，瞬时离心后放入基因扩增仪中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58.5℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃再延伸10min。
待PCR扩增程序结束后，进行100V稳压电泳，电泳结束后利用SDS-PAGE紫外凝胶成像分析系统检测其条带大小及亮度强弱，将符合预期结果PCR产物原液全部寄送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
测序后的结果经拼接后，在NCBI上进行Blast分析，从GenBank中检索并下载相关参考序列，利用MEGA 7.0进行序列的对齐和比较，用邻接法(NJ)构建系统发育树。基于1000次随机重复取样对序列数据进行bootstrap分析，评估树的拓扑结构。
1.3.4乳酸菌生理生化特性检测
不同温度水平生长试验：将MRS液体培养基以每管5mL分别分装到离心管中，以相同接种量(0.1mL)将待测菌株接入液体培养基中，密封摇匀，分别置于5℃、10℃、 45℃、50℃厌氧培养箱培养，其中5℃和10℃均培养10d，45℃和50℃均培养7d，观察菌株生长情况。
不同pH和盐浓度水平生长试验：使用HCl和NaOH将MRS液体培养基pH分别调至2.5、3.0、3.5、4.0、7.0、9.0，接入待测菌株，密封摇匀，30℃培养7d，观察菌株生长情况。同时，使用NaCl将培养基盐浓度分别调至3.0％和6.5％，接入待测菌株，密封摇匀，30℃厌氧培养2d，观察菌株生长情况。
糖酵解试验：使用API 50CH糖酵解试剂盒检测待测菌株利用碳水化合物的情况，观察并记录结果。
产酸速率和生长曲线：将待测菌株以3％的接种量接入MRS液体培养基中，30℃厌氧培养，每隔4h取一次培养液，测定pH值，同时以未接菌的培养液为空白，测定接菌培养液在波长600nm下的OD值，建立产酸速率曲线和生长曲线(培养时间为横坐标， pH值和OD值分别为纵坐标)。
2结果与分析
2.1乳酸菌菌株的分离筛选
利用MRS固体培养基从富集植物醇的苜蓿青贮饲料中，初步分离出158株乳酸菌进行二分划线法试验，经二分划线初步筛选获得56株不同菌落形态的菌株，经过氧化氢酶试验筛选得43株过氧化氢酶阴性菌株进行革兰氏染色镜检试验，经革兰氏染色镜检试验筛选得12株革兰氏染色阳性菌，分别命名为：AS5、AS7、AS14、AS19、AS21、AS27、 AS30、AS43、AS49、AS52、AS76、AS98，其菌落形态、过氧化氢酶和革兰氏染色镜检试验结果见表3。革兰氏染色镜检结果显示，AS21菌体为球状，AS43和AS76菌体均为链球状，其余菌株均为杆状。部分革兰氏染色结果见图2。
表3乳酸菌的初步分离筛选
表4乳酸菌的初步分离筛选
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性，“L”表示大，“M”表示，“S”表示。
2.2乳酸菌菌株的16S rRNA序列扩增结果
分离乳酸菌的16S rRNA序列的PCR扩增产物进行凝胶电泳，结果如图3所示，AS7菌株、AS19菌株、AS21菌株、AS49菌株、AS98菌株均出现与预期结果一致的条带。
2.3乳酸菌菌株的16S rRNA序列分析
以Bacillus subtilis(X60646)作为外群构建NJ树，结果如图4所示。AS98与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)位于同一进化支，进化亲缘度为91％，AS49与短乳杆菌(Lactobacillus brevis)位于同一进化支，进化亲缘度为100％，AS21与戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，进化亲缘度为100％，AS7与弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)位于同一进化支，进化亲缘度为97％，AS19与清酒乳杆菌(Lactobacillussakei) 位于同一进化支，进化亲缘度为93％。因此，AS98属于植物乳杆菌，AS7属于弯曲乳杆菌，AS19属于清酒乳杆菌，AS49属于短乳杆菌，AS21属于戊糖片球菌。
2.4乳酸菌菌株的生理特性
将经16S rRNA鉴定获得的5株乳酸菌进行葡萄产气试验以及不同温度、不同pH和盐浓度水平生长试验，结果见表5。AS19和AS49为异型发酵，其余3株均为同型发酵，菌株AS7、AS19、AS98均能在pH2.5～pH9和5℃～50℃的范围内生长，同时也能在3％NaCl 和6.5％NaCl的盐浓度环境中正常生长，AS21不能在pH2.5和6.5％NaCl环境中生长， AS49不能在50℃环境中生长。
表5分离乳酸菌的生理特性
注：“+”表示生长，“W”表示微弱生长，“-”表示不生长。
2.5乳酸菌菌株的生化特性
乳酸菌菌株的糖酵解试验结果如表6所示，AS7、AS19、AS21、AS49和AS98均能利用核糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇、山梨醇、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵和海藻糖，均不能利用赤藓糖醇、L-木糖、阿东醇、B-甲基-木糖苷、L-山梨糖、半乳糖醇、肌糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、淀粉、肝糖、木糖醇、D-来苏糖、D-海藻糖、L-岩藻糖、 L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐，AS21可以利用D-木糖、鼠李糖、胰岛素和D-塔格糖产酸，其它菌株均无法利用，除AS49外，其它菌株都能利用水杨苷和半乳糖。各菌株具体发酵情况见表7。
表6乳酸菌菌株糖发酵特性
表7乳酸菌菌株糖发酵特性
注：“++”表示生长良好，“+”表示生长，“W”表示微弱生长，“-”表示不生长。
2.6乳酸菌菌株的产酸和生长特性
不同菌株的产酸和生长特性见表8，培养12h后，菌株AS21、AS49、AS98的产酸速率最快，pH值均低于4，分别为3.96、3.99、3.91；OD值达到了2以上，分别为2.124、2.339、2.436，其余菌株的pH值均为4以上。培养24h后，除AS19、AS49的pH值大于4外，其余菌株的的pH值均低于3.9，其中AS98的pH值为3.66，OD值分别为2.481。培养36h后，各菌株的产酸和生长性能趋于稳定，所有菌株的OD值均大于2，除AS19、AS49的pH值为4.03和4.01 外，其余菌株的pH值均低于3.8。
表8乳酸菌菌株的产酸和生长特性
注：OD值：吸光度。
2.7优良乳酸菌菌株的产酸和生长曲线
5株乳酸菌菌株中早期生长和产酸性能较强的为菌株AS21、AS49和AS98。如图5，AS21、 AS49和AS98在0～12h内产酸迅速，8～12h产酸速率最快，12～24h趋于平缓，24后趋于稳定，其中AS98产酸能力最强，一直保持着较低的pH值，3株乳酸菌的产酸能力： AS98>AS49>AS21。
如图6所示，AS21、AS49和AS98生长特性均为对数生长曲线，在0～8h内生长速率最快，8～16h趋于平缓，16h后趋于稳定，3株乳酸菌的生长能力：AS98>AS49>AS21。
传统的细菌鉴定方法主要包括革兰氏染色和形态学鉴定等，近年来，利用16SrRNA 序列对微生物进行分子鉴定已经得到了极为广泛的应用，以16S rRNA序列为基础建立的系统进化树可以准确的对微生物进行分类，相较于传统的鉴定方法更加快速可靠。本发明对利用MRS固体培养基分离纯化的菌株进行过氧化氢酶和革兰氏染色试验，凡是过氧化氢酶阴性和革兰氏阳性的菌株均初步鉴定为乳酸菌，进行16S rRNA序列分子鉴定，经PCR扩增电泳，有5株乳酸菌菌株电泳条带符合预期目的片段，并且单一清晰，序列分析结果显示，5株乳酸菌菌株中包括1株弯曲乳杆菌AS7、1株清酒乳杆菌AS19、1株戊糖片球菌AS21、1株短乳杆菌AS49、1株植物乳杆菌AS98。
用于青贮的乳酸菌应当具有耐酸能力强、繁殖速度快的特性，在青贮过程能够快速产生大量乳酸，降低青贮饲料的酸度，抑制有害微生物的繁殖，进而减少杂菌对饲料营养物质的消耗，以达到长期保存饲料的目的。另外由于青贮过程中pH值不断降低，乳酸菌自身的增殖也会受到限制，同时乳酸菌的生长也会受到环境温度的影响，饲料发酵品质的稳定性也会随之受到影响，因此乳酸菌的增殖能力与青贮品质息息相关，耐酸耐碱程度更高的乳酸菌会更适用作为青贮添加剂。本发明分离鉴定出的5株乳酸菌中，菌株AS7、AS19、 AS98均能在pH2.5～9和5℃～50℃的范围内正常生长，同时也能在3％NaCl和6.5％NaCl 的盐浓度环境中正常生长，说明这3株乳酸菌具有耐酸、耐盐和耐低温的特性。
在筛选乳酸菌的过程中，不同菌株之间的产酸和生长特性都存在很大差异，产酸速率和生长速率也是评价优良乳酸菌的重要指标，同时也是衡量乳酸菌添加剂的重要指标。本发明中，菌株AS21、AS49和AS98的产酸和生长速率最快，培养12h后pH均低于4， OD值达到了2以上，其中以AS98菌株最突出。培养36h后，各菌株的产酸和生长性能趋于稳定。
从富集植物醇的苜蓿青贮饲料中分离出5株乳酸菌，分别为弯曲乳杆菌AS7、清酒乳杆菌AS19、戊糖片球菌AS21、短乳杆菌AS49、植物乳杆菌AS98。其中植物乳杆菌AS98 产酸和生长速率最好，且耐酸、耐碱、耐盐，适用于青贮用乳酸菌添加剂。
实施例2
苜蓿青贮中减少植物醇损失的优势菌株应用效果
1材料与方法
1.1试验材料
供试苜蓿刈割于黑龙江省大庆市让胡路喇嘛甸镇红骥牧场，刈割时间为2020年9月19日，收获方式为距离地面2-3cm刈割，其化学成分及微生物附着情况见表6。
表6供试苜蓿一般化学成分
注：FM：鲜物。
乳酸菌制剂：将本发明的植物乳杆菌AS98菌株和现有的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Master-LP作为添加剂(日本种苗株式会社，北海道札幌市厚别区上野幌1条5 丁目1番8号)。将AS98菌株活化两次后，用生理盐水将浓度调至107CFU/mL，Master-LP 按照说明书同样用生理盐水将浓度调为107CFU/mL。
富集植物醇青贮发酵液：根据2.4筛选出植物醇含量最高的AS98组的苜蓿青贮，即青贮60日的苜蓿青贮饲料。取青贮样品200g加入500mL蒸馏水榨汁，用双层纱布过滤，取200mL滤液于500mL锥形瓶中，加入2g葡萄糖，于室温厌氧发酵3d后，即为富集植物醇青贮发酵液(FJASEP,Fermented juice of alfalfa silage enriched phytol)，用量为10 mL/kg鲜草，其中植物醇及乳酸菌理论接种含量分别约为2.4g/kg和8.0×105cfu/g鲜草。
1.2试验设计与青贮制作
采用单因素完全随机试验设计。将苜蓿于通风阴凉处晾晒至至含水量45％～50％，铡短至2～3cm作为青贮原料，添加组分别添加AS98和Master-LP菌液0.2mL以及2mL的FJASEP，无添加组加入等量蒸馏水(2mL)，充分混匀后，装袋(每袋约200g)真空密封，室内常温发酵60天开封测定相关指标。
1.4测定指标及方法
1.4.1发酵品质
开封后对苜蓿青贮饲料的颜色、质地、气味及霉变情况进行评定。
pH：取10g苜蓿青贮饲料，加入90mL灭菌蒸馏水，于均质器中拍打90s，使用便携式pH计测定上述浸提液pH。
有机酸：取部分过滤后浸提液经离心机(6 500×g，4℃)离心5min，过0.45μm滤膜，利用高效液相色谱仪测定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)及丁酸(butyric acid，BA)的含量。
氨态氮/总氮(NH3-N/TN)：采用凯氏定氮法测定并计算。
微生物培养及计数：采用平板计数法，取10g青贮饲料样品，加入90mL无菌蒸馏水于均质器中拍打90s，在无菌操作环境中，用无菌蒸馏水将浸提液浓度稀释为10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5备用。使用MRS Agar培养乳酸菌(30℃厌氧，48h)，Nutrient Agar培养好氧性细菌和芽孢杆菌(30℃，48h)，Potato Dextrose Agar培养酵母菌和霉菌(30℃，48h)， BlueLight Broth Agar培养大肠杆菌(30℃，48h)，Clostridia Count Agar培养基培养梭菌孢子(30℃厌氧，48h)，其中，芽孢杆菌和梭菌孢子培养使用的浸提液需经75℃水浴15min。计算各菌落总数时，用每克新鲜样品中菌落形成单位的对数表示(lg CFU/g FM)。所用培养基均购于青岛海博生物科技有限公司。
1.4.2化学成分
取苜蓿青贮饲料样品于电热恒温鼓风干燥箱(65℃，48h)恒重，粉碎过2mm筛，备用分析营养成分。依据AOAC(1990)中的934.01、976.06、930.39和942.05方法，利用电热恒温鼓风干燥箱测定干物质(dry matter，DM)、凯氏定氮仪测定粗蛋白质(crude protein，CP)、索氏提取器测定粗脂肪(ether extract，EE)、马弗炉测定有机物(organic matter，OM) 含量。参照Van soest方法分析中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)含量。采用蒽酮比色法分析水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)含量。
1.4.3植物醇提取
采用GC-TOF-MS技术，对植物醇进行定性及定量分析。
取50mg待测样品于EP管中，加入钢珠和500μL预冷提取液(甲醇水体积比＝3:1)，含内标核糖醇(0.5mg/mL)，使用研磨仪，35Hz研磨4min，并进行超声冰水浴5min (重复3次)；离心(12000rpm，15min，4℃)后取100μL上清液于EP管中；每个待测样品各取25μL混合形成质控(quality control，QC)样本；于真空干燥仪中干燥提取物，加入80μL甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20mg/mL)，混匀，进行孵育 (80℃，30min)，然后加入100μLBSTFA(含1％TMCS，v/v)，继续孵育(70℃， 1.5h)，冷却至室温，加入5μL FAMEs(溶于氯仿)，随机顺序上机检测。
GC-TOF-MS具体分析条件如下：
1.5数据分析
试验数据采用Excel 2010计算与整理后，使用SAS 9.4进行方差分析，并用Tukey法进行多重比较，差异显著性水平为P<0.05。
2结果与分析
2.1优势菌株对苜蓿青贮发酵品质的影响效果
表7优势菌株对苜蓿青贮感官品质的影响效果
注：C：contral，无添加组；AS98：AS98菌液；LP：Master-LP菌液；FJASEP：Fermentedjuice of alfalfa silage enriched phytol，富集植物醇青贮发酵液。
由表7可知，无添加组以黄色为主，而添加组均为黄绿色，并且添加组的酸香味比无添加组更为醇厚，各组的青贮饲料质地均为茎叶柔软、湿润不黏手、无霉变。
由表8可知，添加组的pH均显著低于无添加组(P<0.05)，LA、AA含量显著高于无添加组(P<0.05)，其中AS98组pH最低，为4.15，LA含量最高，NH3-N/TN显著低于其他组 (P<0.05)，各处理组的PA含量无显著差异(P>0.05)，FJASEP组NH3-N/TN显著高于其他添加组(P<0.05)，且高于无添加组(P>0.05)。同时，各处理组均未检测出BA。
表8优势菌株对苜蓿青贮发酵品质的影响效果
注：重复数N＝3，同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著 (P>0.05)。“—”表示未统计。FM：鲜物；SEM，标准误。
2.2优势菌株对苜蓿青贮化学成分的影响效果
表9优势菌株对苜蓿青贮化学成分的影响效果
注：重复数N＝3，同行数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著 (P>0.05)。SEM，标准误。
由表9可知，AS98组的DM、OM、CP和WSC含量均显著高于其他组(P<0.05)，添加组的NDF和ADF含量均显著低于无添加组(P<0.05)，其中AS98组最低。各处理组间的 EE含量无显著差异(P>0.05)。
2.3优势菌株对苜蓿青贮微生物组成的影响效果
由表10可知，添加组的乳酸菌数量均显著高于无添加组(P<0.05)，好氧性细菌、芽孢杆菌和酵母菌均显著低于无添加组(P<0.05)，其中AS98组的乳酸菌数量最高，好氧性细菌和酵母菌数量最低，各处理均未检测出大肠杆菌、霉菌和梭菌。
表10优势菌株对苜蓿青贮微生物组成的影响效果
注：重复数N＝3，同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著 (P>0.05)。“—”表示未统计。FM：鲜物；SEM，标准误。
2.4优势菌株对苜蓿青贮植物醇含量的影响效果
由表11可知，AS98组和FJASEP组的植物醇和顺式植物醇含量均显著高于其他组(P<0.05)，两组间的植物醇和顺式植物醇含量均无显著差异(P>0.05)，无添加组和LP组间植物醇和顺式植物醇含量也均无显著差异(P>0.05)。
表11优势菌株对苜蓿青贮植物醇和顺式植物醇含量的影响效果
注：重复数N＝3，同列数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著 (P>0.05)。SEM，标准误。
3结果
3.1优势菌株对苜蓿青贮发酵品质的影响效果
优质青贮饲料颜色应当为接近牧草原料的绿色或者黄绿色，气味醇厚芳香，质地松软，茎叶分明，水分适宜，触感湿润、不黏手。本发明中，添加组的颜色均为黄绿色，气味相比无添加组酸香味更为醇厚，茎叶柔软、湿润不黏手，可见添加乳酸菌和FJASEP均能提高青贮饲料的适口性。
乳酸菌在青贮过程中有着举足轻重的作用，其数量决定着青贮发酵的成败，添加乳酸菌可以增加青贮发酵初期的乳酸菌含量，产生大量乳酸，迅速降低pH值，以抑制有害微生物的增殖，减少对饲料营养物质的消耗。本发明中，乳酸菌添加组的LA和AA含量均显著高于对照组，NH3-N/TN显著低于对照组，好氧菌、芽孢杆菌和酵母菌数量均显著低于对照组。FJASEP中也含有大量的乳酸菌，因此也可以增加青贮初期的乳酸菌含量，提高青贮饲料中的LA和AA含量，但由于其中不仅仅含有大量乳酸菌，还存在一些耐酸的杂菌，会分解饲料的营养物质，因此FJASEP组的NH3-N/TN高于其他组。
3.2优势菌株对苜蓿青贮化学成分的影响效果
乳酸菌产生的大量乳酸降低了饲料的酸度，大部分不耐酸的有害微生物会因此活性受到抑制甚至失活，可以有效减少这些杂菌对饲料营养物质的消耗。本发明中，乳酸菌添加组的DM、OM、CP和WSC含量均显著高于无添加组，与其试验结果相似。FJASEP组的 CP含量低于其他处理组，也是由于其中含有的杂菌的活性未完全受抑制，仍然在分解青贮饲料中的蛋白质和氨基酸。所有添加组的NDF和ADF含量均低于无添加组，这是由于乳酸菌产生的乳酸和乙酸可以酸解细胞壁的纤维成分，提高饲料的消化率。
3.3优势菌株对苜蓿青贮微生物组成的影响效果
青贮饲料中乳酸菌的数量是判断青贮发酵是否充分和是否需要添加外源乳酸菌的主要因素。添加外源乳酸菌有助于增加发酵前期青贮饲料中的乳酸菌数量，加快发酵进程，并确保进行乳酸发酵，迅速降低环境pH，为乳酸菌的繁殖创造有利条件。本发明中，添加组的乳酸菌数量均显著高于无添加组，好氧性细菌、芽孢杆菌和酵母菌均显著低于无添加组，可见外源乳酸菌的添加可以有效提高青贮饲料中的乳酸菌数量，抑制有害微生物的繁殖。
3.4优势菌株对苜蓿青贮植物醇含量的影响效果
本发明中，苜蓿青贮后的植物醇和顺式植物醇含量均高于青贮前，可见通过青贮可以提高苜蓿中的植物醇含量。添加AS98组和FJASEP组的植物醇和顺式植物醇含量均显著高于LP组和无添加组，FJASEP组作为富集植物醇的发酵液，发酵液中已经含有能够抑制植物醇损失或者说增加植物醇含量的影响因子，添加后的确可以使植物醇含量相比无添加组的更高。而AS98组的植物醇含量高于FJASEP组，但差异不显著，是由于虽然FJASEP组也含有AS98菌株，但同时也含有与植物醇含量呈负相关的其他杂菌，也会影响植物醇的含量。添加LP组和无添加组的植物醇无显著差异。本发明结果添加AS98和FJASEP可以增加植物醇的含量，添加LP却没有这样的效果，造成原因是可能本发明所添加的LP，是对植物醇来说没有特异性的乳酸菌，而经筛选出的AS98是拥有这种特性的乳酸菌，可以增加青贮中的植物醇含量。
综上所述，(1)添加处理均能提高苜蓿青贮饲料的感官品质，显著降低pH值，显著提高LA、AA含量；添加AS98可以显著降低NH3-N/TN。(2)添加AS98的DM、OM、 CP和WSC含量均显著高于其他处理组，NDF和ADF含量显著低于其他组。(3)添加组的乳酸菌数量均显著高于无添加组，好氧性细菌、芽孢杆菌和酵母菌数量均显著低于无添加组，其中添加AS98组的乳酸菌数量最高，好氧性细菌和酵母菌数量最低；各处理组均未检测出大肠杆菌、霉菌和梭菌。(4)添加AS98可以提高植物醇和顺式植物醇的含量。
序列表
<110>黑龙江八一农垦大学
<120>一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用
<160>1
<210> 1
<211>1410
<212> DNA
<213>植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
<220>
<223>AS98
<400>1
aagtcgaacg aactctggta ttgattggtg cttgcatcat gatttacatt tgagtgagtg 60
gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct gcccagaagc gggggataac acctggaaac 120
agatgctaat accgcataac aacttggacc gcatggtccg agcttgaaag atggcttcgg 180
ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat tagctagatg gtggggtaac ggctcaccat 240
ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac attgggactg agacacggcc 300
caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag tctgatggag 360
caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaaac tctgttgtta aagaagaaca 420
tatctgagag taactgttca ggtattgacg gtatttaacc agaaagccac ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa 540
gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt cggctcaacc gaagaagtgc 600
atcggaaact gggagacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga 660
aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac 720
gctgaggctc gaaagtatgg gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccataccgta 780
aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa 840
gcattccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960
acatactatg caaatctaag agattagacg ttcccttcgg ggacatggat acaggtggtg 1020
catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttattatca gttgccagca ttaagttggg cactctggtg agactgccgg tgacaaaccg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1200
tacaatggat ggtacaacga gttgcgaact cgcgagagta agctaatctc ttaaagccat 1260
tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1320
ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg 1410
Claims (6)
1.一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株，其特征在于它为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）AS98，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年12月20日，保藏号为CGMCC No.24146。
2.如权利要求1所述的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，其特征在于是将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）AS98用于提高苜蓿青贮饲料的植物醇含量。
3.根据权利要求2所述的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，其特征在于所述的提高植物醇含量是提高常温下苜蓿青贮饲料植物醇含量。
4.如权利要求1所述的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，其特征在于是将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）AS98用于改善苜蓿青贮饲料品质。
5.根据权利要求4所述的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，其特征在于所述的改善苜蓿青贮品质是指通过加入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）AS98提高苜蓿青贮饲料中乳酸和乙酸的含量，降低氨态氮/总氮的含量。
6.如权利要求1所述的一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株的应用，其特征在于是将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）AS98用于降低苜蓿青贮饲料中有害菌的数量，所述的有害菌为好氧性细菌或酵母菌。
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