CN112195139B - 植物乳杆菌菌株ldvs007及其应用 - Google Patents

植物乳杆菌菌株ldvs007及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株LDVS007及其应用，本发明的LDVS007菌株从南宁市场的酸豇豆中分离而得，该菌株具有较高的耐胆盐能力和抗氧化性，为了提高菌株的抗氧化性，发明人进行了单因素和正交实验，最终找到中药剂：黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物均能促进LDVS007菌株的抗氧化能力，用上述提取物配合冻干保护剂将菌株LDVS007加工成冻干粉，能起到方便运输、储藏、提高菌株存活率和抗氧化性的功效；如果将上述菌株应用于动物体中，将大大提升了乳酸菌在动物体中的定植能力，起到良好的对肠道调节和保健效果。

Description

植物乳杆菌菌株LDVS007及其应用
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株LDVS007及其应用。
【背景技术】
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，属于革兰氏阳性菌株，是一类具有弯杆状、圆端短杆状和链状等形态的菌体，且不产芽孢的兼性乳酸菌，其以果糖、葡萄糖、乳糖和木糖等作为原料进行代谢生长而产酸，是发酵产品生产中不可缺少的菌种之一，常见用于等豇豆、白菜、洋葱等泡菜生产。
植物乳杆菌是人体或动物体中常用的益生菌具有对肠道的双向调节作用，目前市面上已有很多乳酸菌的加工产品，例如酸奶、菌粉等多种成品，但是植物乳杆菌在穿过人体肠道的过程中人体的胆盐、酸等物质都会对乳酸菌的活性产生一定影响，从而影响乳酸菌的定植、调节效果，为此有必要对耐胆盐、耐酸的乳酸菌进行进一步筛选以获得具有更高价值的乳酸菌种质资源；为了提高对菌株的保藏、运输能力，现有技术通常采用将菌株制备成冻干粉的方法对菌株进行应用，然而在现有技术中发现，虽然是同种菌株，但是并非所有的保护剂都能完全适用，冻干粉中保护剂的选择与菌株本身的株型有关。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种能耐胆盐、具有高抗氧化性的乳酸菌菌株，同时还通过改良冻干保护剂以达到提高菌株冻干粉中菌株存活率的目的。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007，其保藏编号为CGMCCNO： 20028。
进一步的，其特征在于，所述菌株从酸豇豆中分离而得。
本发明还包括一种包含所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007的冻干粉。
进一步的，所述冻干粉中的保护剂中各成分及浓度如下：30-33g/100mL的脱脂乳、22-25g/100mL的乳糖和0.01-0.02g/100mL的硫酸锌。
本发明还包括一种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007和/或如所述冻干粉在耐胆盐能力和/或提高抗氧化能力上的应用。
本发明还包括一种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007和/或所述冻干粉在食品加工上的应用。
本发明还包括一种可提高所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007抗氧化能力的中药添加剂，所述中药添加剂为黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和/或芦荟提取物。
本发明还包括一种制备所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007冻干粉的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备MRS中药扩大培养基：将中药液按照体积百分数的5％将混合物加入MRS培养液中，混匀制得MRS中药扩大培养基；
(2)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，将植物乳杆菌接种到MRS中药扩大培养基；
(3)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后、离心、去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液；
(4)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(5)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度20-30Pa条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右，即得。
进一步的，所述步骤(1)的中药液为黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物按照质量比为2:1:2混匀。
进一步的，所述黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物均采用水煮、过滤、浓缩的方法制得。
本申请中黑老虎果皮提取物的提取方法为：将黑老虎果皮和水按照固液质量比为1:2熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可。
葡萄果皮提取物的提取方法为：将葡萄果皮和水按照固液质量比为1:2熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可。
芦荟提取物的提取方法为：将芦荟整株捣碎，然后按照质量比为1:2加水熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明的LDVS007菌株从南宁市场的酸豇豆中分离而得，该菌株具有较高的耐胆盐能力(在3g/L的胆盐浓度中仍能保持88％的存活率)和抗氧化性，为了提高菌株的抗氧化性在进一步研究中，发明人发现某些具有抗氧化功能的中药剂对不同乳酸菌菌株的抗氧化性具有不同的效果，为此，为了寻找对LDVS007菌株合适的抗氧化能力促进剂，发明人进行了单因素和正交实验，最终找到中药剂：黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物均能促进LDVS007菌株的抗氧化能力，用上述提取物配合冻干保护剂为：30-33g/100mL的脱脂乳、22-25g/100mL的乳糖和0.01-0.02g/100mL的硫酸锌将菌株LDVS007加工成冻干粉，能起到方便运输、储藏、提高菌株存活率和抗氧化性的功效；如果将上述菌株应用于动物体中，将大大提升了乳酸菌在动物体中的定植能力，起到良好的对肠道调节和保健效果。
【附图说明】
图1为本申请实施例的LDVS007菌株在平皿上的形态图；
图2为本申请实施例的LDVS007菌株在显微镜下的镜检图；
图3为实施例2植物乳杆菌菌株生长曲线图；
图4为实施例2植物乳杆菌pH值变化曲线图。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
本实施例为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007的筛选方法：
本实施例的菌株从酸豇豆中分离而得，酸豇豆取自广西南宁的市场，采用MRS培养基平板涂布法、斜面划线法分离而得，最终筛选出菌株LDVS012、LDVS007、LDVS008、LDVS005。经过测定申请人发现菌株LDVS007对胆盐的耐受能力最高、且在这4株菌株中具有最高的抗氧化能力。
本实施例的菌株用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，比对结果通过MEGA7.0构建系统发育树。其结果显示菌株LDVS007与植物乳杆菌的同源性分别为98.67％。经生理生化实验得出：菌株LDVS007的适合生长温度为28～32℃，经鉴定，菌株LDVS007属于乳酸菌属，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)种。所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：20028，保藏日期为2020 年6月8日。
本发明所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LDVS007在平皿上的形态特征如图1 所示，该菌株菌落呈白色、边缘光滑、中间凸起呈半球状；镜检图如图2所示，在显微镜下菌株呈杆状、多为成对或单个存在，长短不一、不运动，无芽胞。
实施例2：
菌株LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的生长、产酸能力鉴定：
在装有100mL液体MRS的三角瓶中，按2％(v/v)的接种量接入种子发酵液，于30℃条件下培养36h，分别于0、1、3、6、9、12、24、36h测定在波长600nm的OD值，绘制生长曲线；结果如图3所示：在0-3h时4株乳酸菌在生长阶段中处于迟缓期，3h之后开始进入对数生长期，12h之后开始进入稳定期。结果表明，12h前乳酸菌生长繁殖较旺盛，与图4乳酸菌pH值变化曲线的特征刚好吻合。在12h时LDVS012在600nm的吸光值要显著高于其他三株菌株(P<0.05)，LDVS005和LDVS007间无显著差异(P>0.05)，LDVS008显著低于其他三株菌株(P<0.05)。在24h、36h时，LDVS012和LDVS005在600nm的吸光值要显著高于其他两株(P<0.05)LDVS007和LDVS008之间无显著差异(P>0.05)，从4株高产酸菌株的生长曲线可以看出LDVS005和LDVS012较其他两株乳酸菌生长旺盛，在发酵后期具有显著优势，LDVS012生长能力最好。
将分离纯化的菌株接种到5mLMRS液体培养基中，30℃静置培养12h后，将种子发酵液按2％(v/v)的接种量接入在装有100mL液体MRS培养基，于30℃条件下培养发酵36h，分别测定在0、0.5、3、6、9、12、24、36h的pH值，结果如图4所示：在前12h内，乳酸菌生长繁殖较旺盛，产酸速度快，其中LDVS012在该阶段产酸能力优于LDVS005、LDVS007、 LDVS008。在12h后pH值下降缓慢，进入相对平稳阶段，4株乳酸菌在各时间点pH值无显著差异(P>0.05)，在36h时LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的MRS培养基 pH值分别为3.80、3.85、3.83、3.70，在后发酵阶段LDVS012和LDVS005要优于其他菌株。
同时，乳酸菌产酸使培养基形成透明圈，透明圈的大小反映了乳酸菌的产酸能力，透明圈和酸度结果参见表1：
表1 不同乳酸菌产酸能力
菌株编号 溶钙圈直径/cm 酸度/％
LDVS005 1.33±0.072<sup>a</sup> 2.001±0.006<sup>a</sup>
LDVS007 1.24±0.042<sup>b</sup> 1.958±0.054<sup>b</sup>
LDVS008 1.23±0.038<sup>b</sup> 1.950±0.030<sup>b</sup>
LDVS012 1.34±0.076<sup>a</sup> 2.018±0.054<sup>a</sup>
从表1可知果表明LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的透明圈直径显著大于其他乳酸菌(P<0.05)，其中LDVS012透明圈直径最大(1.34±0.076cm)。与培养基酸度得到结果一致，其中LDVS005和LDVS012显著高于LDVS007和LDVS008菌株(P<0.05)。
实施例3：
菌株对胆盐耐受性的测试：
将乳酸菌活化24h后按照2％的接种量接种在胆盐含量为3g/L、3.5g/L和4.0g/L的MRS 培养基中，在于30℃下恒温培养24h。测定4株菌株：LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012和市面上一款商业菌剂(购买自淘宝网)的存活率，具体如表2：
表2 乳酸菌的胆盐耐受性
菌株 3g/L胆盐 3.5g/L胆盐 4.0g/L胆盐
LDVS005 78.3％ 53.5％ 35.2％
LDVS007 88.6％ 75.3％ 52.6％
LDVS008 61.2％ 42.1％ 18.7％
LDVS012 46.3％ 25.3％ 10.2％
商业菌剂 48.4％ 24.6％ 11.6％
由表2可知，在3g/L胆盐浓度下，菌株LDVS005、LDVS007和LDVS008均能达到50％以上的存活率，且存活率LDVS007＞LDVS005＞LDVS008＞LDVS012≈商业菌剂；且在 4.0g/L的胆盐浓度下菌株LDVS007还保持较高的活性，小肠的胆盐浓度在0.3g/L-3g/L之间，因此，往往以3g/L的添加量做为乳酸菌对肠道适应的一个检测指标，由此说明菌株LDVS007 能比其他菌株能更好的适应人体肠道环境。
实施例4：
菌株的抗氧化能力检测：
选取实施例3中在3g/L胆盐添加量下存活率为50％的菌株进行抗氧化能力检测，即选取菌株LDVS005、LDVS007和LDVS008进行体外抗氧化能力测试：测试的两个指标为：有细胞提取物(IC)和无细胞提取物(CFE)的抗氧化测试，具体操作过程如下：
将上述菌株接种于MRS培养基中进行活化培养，接种量为5％，培养时间为24h；将培养液进行离心分离，取菌体，并反复用无菌去离子水清洗，然后将菌体重悬至无菌去离子水中，并调节菌体终浓度为106cfu/mL得到完整细胞菌悬液(IC)，之后进行超声破碎，镜检观察无完整细胞体后停止破碎，之后离心取上清液得到无细胞提取物(CFE)；
测定上述提取物IC和CFE的DPPH·自由基能力，具体如表3所示：
表3 106cfu/mL浓度下不同菌株的DPPH·自由基能力
菌株 LDVS005 LDVS007 LDVS008
IC 10.2％±0.2<sup>a</sup> 15.2％±0.7<sup>b</sup> 9.1％±0.4<sup>a</sup>
CFE 11.3％±0.5<sup>a</sup> 17.3％±0.8<sup>b</sup> 10.2％±0.3<sup>a</sup>
由表3可知，菌株的无细胞提取物(CFE)的DPPH自由基清除能力略高于完整细胞菌悬液(IC)，但是没有显著差异；LDVS007菌株的DPPH自由基清除能力高于LDVS005和LDVS008，并且达到显著水平。
实施例5：
部分药剂对菌株抗氧化性的影响：
现有技术中报道，某些中药具有抗氧化性，因此，申请人选取了几种在现有技术中有报道或者申请人在研究过程中发现的某些具有抗氧化性的中药成分用于培养乳酸菌菌株，并测试中药对乳杆菌的抗氧化能力，选取的中药提取物有：黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物、芦荟提取物、火龙果果皮提取物；上述提取物的制备方法如下：
黑老虎果皮提取物：将黑老虎果皮和水按照固液质量比为1:2熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可；
葡萄果皮提取物：将葡萄果皮和水按照固液质量比为1:2熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可；
芦荟提取物：将芦荟整株捣碎，然后按照质量比为1:2加水熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可；
火龙果果皮提取物：将火龙果果皮按照固液质量比为1:2加水熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可。
取上述提取物分别按照培养液体积5％的添加量添加到MRS液体培养基中制得中药活化培养基；
将菌株LDVS005、LDVS007、LDVS008接种于上述的中药活化培养基中进行活化培养，接种量为5％，培养时间为24h；将培养液进行离心分离，取菌体，并反复用无菌去离子水清洗，然后将菌体重悬至无菌去离子水中，并调节菌体终浓度为106cfu/mL得到完整细胞菌悬液(IC)；测定IC的DPPH·自由基清除能力；具体如表4：
表4 不同中药活化培养基对菌株的抗氧化能力影响
Figure RE-GDA0002820222570000071
由表4和表3比对可知，黑老虎果皮提取物和火龙果果皮提取物对菌株LDVS005的抗氧化能力没有起到促进作用，反而抑制了菌株LDVS005的抗氧化能力；黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物均对菌株LDVS007的抗氧化能力起到促进作用，而火龙果果皮提取物反而对菌株LDVS007的抗氧化能力起到抑制作用；黑老虎果皮提取物和葡萄果皮提取物对菌株LDVS008的抗氧化能力起到抑制作用，而芦荟提取物和火龙果果皮提取物对菌株 LDVS008的抗氧化能力起到促进作用。
上述结果表明，现有技术中有报道或本身具有抗氧化功能的中药用于对不同乳酸菌菌株进行培养不一定都能促进菌株的抗氧化能力，这可能是由于，本身具有抗氧化功能的中药成分，其中的某些成分会抑制菌株生长，从而造成菌株的抗氧化功能减弱，因为现有技术中也有中药抑菌剂的相关报道，从上述结果还表明，即使是同种菌株，不同株型的细菌其生长能力不同，导致不同成分其对菌株的影响也不一致，如果要找到中药中具有促进乳酸菌菌株生长的中药，必须经过实验验证才能甄别，而不能仅凭文献报道。
结合本申请，菌株LDVS007相对于其他菌株而言具有高耐胆盐、高抗氧化性的特性，就抗氧化性的定向培育而言，申请人仅用菌株LDVS007进行实验；以中药添加剂：黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物质量比设计正交实验，并检测LDVS007菌株的抗氧化性，中药添加剂的总量仍为培养液体积5％；具体如下：
表5 菌株LDVS007抗氧化能力的正交实验因素水平
Figure RE-GDA0002820222570000081
上述配比的正交分析，及其结果分别如表6所示：
表6 正交实验及结果
Figure RE-GDA0002820222570000082
Figure RE-GDA0002820222570000091
由表6可知，上述几种中药提取物混合后均对菌株LDVS007的抗氧化能力起到促进作用，效果最好的是试验4，其黑老虎提取物：葡萄果皮提取物：芦荟提取物的质量比为：2:1:2。
实施例6：
用菌株LDVS007来制备冻干粉；制备方法如下：
(1)制备MRS中药扩大培养基：将黑老虎提取物：葡萄果皮提取物：芦荟提取物按照质量比为：2:1:2混匀，然后按照体积百分数的5％将混合物加入MRS培养液中，混匀制得MRS中药扩大培养基，其中，黑老虎提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物的制备方法如实施例5所示；
(2)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS中药培养基中，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，按接种量2％(v/v)将植物乳杆菌接种到MRS中药扩大培养基，30℃条件下40r/min摇床培养24h。
(3)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后，在4℃条件下7500rpm离心10min，去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的冻干保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液。
(4)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(5)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度30Pa(本实施例仅公开一个试验条件，实际上在20-30Pa都能达到冷冻干燥的效果)条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右。
冻干保护剂经过申请人的正交优化选择后认为，对保护剂影响最大的几个成分为脱脂乳、乳糖和硫酸锌对菌株LDVS007的存活率呈正相关，保护剂中各成分为：脱脂乳30-33g/100mL、乳糖22-25g/100mL、硫酸锌0.01-0.02g/100mL，经过正交实验后，选择部分有显著差异的配方进行实验，具体配方如表7所示：
表7 冻干粉保护剂的选择配方
Figure RE-GDA0002820222570000092
Figure RE-GDA0002820222570000101
除了上述冻干保护剂配方选择外还设置一对照组，对照组省去本实施例的第(1)步骤，即不采用中药MRS培养液扩大培养，即不在MRS扩大培养液中添加中药剂；其保护剂配方为组3的配方。
根据表7冻干粉保护剂制备得到的冻干保护剂制备得到的冻干粉进行存活率测定、抗氧化能力测定，测定结果如表8：
表8 不同冻干保护剂的菌株存活率和抗氧化能力
组别 组1 组2 组3 组4 组5 对照组
存活率(％) 95.64 97.36 99.25 60.58 87.54 98.28
DPPH清除能力(％) 19.8 20.3 20.9 13.1 17.5 17.8
由表8可知，组1-组3、对照组的存活率高于组4-组5；说明冻干粉菌粉中，对菌株存活率产生影响的主要是冻干保护剂成分，组1-3的DPPH·自由基清除能力大于组4-5，说明菌株的存活率会影响菌粉的抗氧化能力；而组3的DPPH·自由基清除能力远大于对照组，说明本申请的中药剂对菌株LDVS007的抗氧化能力起到提升作用；同时还说明了，本申请中药剂中影响菌株LDVS007的抗氧化能力与存活率并不明显相关，可能是其促进菌株代谢产生某种可抗氧化的物质，其代谢机理还需进一步验证。
实施例7：
由于本申请的植物乳杆菌LDVS007具有高耐胆盐和较强的抗氧化能力，在3g/L的胆盐浓度中还能有88.6％的存活率，对人体肠道有极强的适应及定植作用，因此，可用于加工益生菌粉，该菌粉应用在动物体上将能起到很好的肠道调节作用。
综上所述，使用本申请的植物乳杆菌LDVS007具有高耐胆盐和较强的抗氧化能力，在 3g/L的胆盐浓度中还能有88.6％的存活率，对人体肠道有极强的适应及定植作用，是一种可应用于人体的益生菌菌株，具有抗氧化功效，能提高人体免疫力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007的冻干粉，其特征在于，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007的保藏编号为CGMCC NO：20028；所述冻干粉中的保护剂中各成分及浓度如下：30-33g/100mL的脱脂乳、22-25g/100mL的乳糖和0.01-0.02g/100mL的硫酸锌。
2.如权利要求1所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007的冻干粉在制备耐胆盐和/或抗氧化相关药物上的应用。
3.如权利要求1所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007的冻干粉在食品加工上的应用。
4.一种制备如权利要求1所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS007冻干粉的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）制备MRS中药扩大培养基：将中药液按照体积百分数的5%将混合物加入MRS培养液中，混匀制得MRS中药扩大培养基；
（2）菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，将植物乳杆菌接种到MRS中药扩大培养基；
（3）离心收集菌体、分装：将发酵液分装后、离心、去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液；
（4）预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12 h。
（5）真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度20-30Pa条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3%左右，即得；
所述步骤（1）的中药液为黑老虎果皮提取物、葡萄果皮提取物和芦荟提取物按照质量比为2:1:2混匀；
所述黑老虎果皮提取物的提取方法为：将黑老虎果皮和水按照固液质量比为1:2熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可；
所述葡萄果皮提取物的提取方法为：将葡萄果皮和水按照固液质量比为1:2熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可；
所述芦荟提取物的提取方法为：将芦荟整株捣碎，然后按照质量比为1:2加水熬煮30min后过滤，取滤液浓缩到原体积的1/10，之后冷却到室温即可。
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