CN112280718B - 植物乳杆菌菌株ldvs012及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株LDVS012及其应用，本申请的LDVS012菌株从酸豇豆中分离而得，该菌株具有生长旺盛、存活率高、代谢能力强，特别是对亚硝酸盐有良好的代谢作用，能大大降低腌渍食品的亚硝酸盐含量，由于菌株本身易失活，为了能更好的进行保存、运输和应用，申请人将上述菌株制备成菌粉，应用于食品加工中，使得菌株的使用更加方便，在对菌株进行冻干菌粉制备时，申请人对保护剂进行研究，经该保护剂制备的LDVS012菌株冻干粉其活力最高可达到91％，具有存活率高、对亚硝酸盐分解效果好，有效降低亚硝酸盐含量的优势。
Description
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株LDVS012及其应用。
【背景技术】
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，属于革兰氏阳性菌株，是一类具有弯杆状、圆端短杆状和链状等形态的菌体，且不产芽孢的兼性乳酸菌，其以果糖、葡萄糖、乳糖和木糖等作为原料进行代谢生长而产酸，是发酵产品生产中不可缺少的菌种之一，常见用于等豇豆、白菜、洋葱等泡菜生产。
植物乳杆菌目前是较为常用的发酵剂，主要是为了提高蔬菜的生产效率，缩短生产周期，提高产品质量和安全性，申请人致力于植物乳杆菌的筛选，研究发现植物乳杆菌具有很好的降低亚硝酸的效果，如果应用得当，将能大幅降低发酵食品中的亚硝酸含量，特别是腌制食品，这将能降低患癌风险，大大提高腌制食品的安全性；在研究过程中，申请人发现，不同的植物乳杆菌其对亚硝酸的降解能力完全不一样，有的虽然是同种菌株，但是却没有分解亚硝酸的能力，而且不同的菌株在实际应用制备成冻干粉时，由于保护液的不同，其活力也并不相同，在冻干处理时，由于机械损伤、细胞膜损伤、溶质损伤、蛋白质变性失活及细胞代谢调节作用损伤等影响，菌体的存活率和细胞活力都会表现出降低的现象，但是，不同菌株其对保护液的需求差异较大，为了提高植物乳杆菌的活力，除了筛选出具有更高分解亚硝酸能力的菌株外，还需要对冻干保护剂进行改良以获得具有高活性的菌株冻干粉。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种能降解亚硝酸盐的菌株，同时还通过改良冻干工艺达到提高菌株冻干粉活性的目的。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012，其保藏编号为CGMCCNO： 20030。
进一步的，所述菌株从酸豇豆中分离而得。
本发明还包括包含所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的冻干粉。
进一步的，所述冻干粉中的保护剂成分为：28-32g/100mL的脱脂乳、20-24g/100mL的海藻糖和0.02-0.04g/100mL的硫酸锰。
进一步的，所述冻干粉中的保护剂成分还包括：5-8g/100mL的甜菊苷。
本发明还包括一种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012和/或所述冻干粉在降低亚硝酸盐上的应用。
本发明还包括所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012和/或所述冻干粉在食品加工上的应用。
本发明还包括一种制备所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012冻干粉的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，将植物乳杆菌接种到MRS培养基扩大培养；
(2)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后、离心、去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液；
(3)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(4)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度20-30Pa条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右，即得。
本发明具有如下有益效果：
本发明的LDVS012菌株从南宁市场的酸豇豆中分离而得，该菌株具有生长旺盛、存活率高、代谢能力强，特别是对亚硝酸盐有良好的代谢作用，能大大降低腌渍食品的亚硝酸盐含量，由于菌株本身易失活，为了能更好的进行保存、运输和应用，申请人将上述菌株制备成菌粉，应用于食品加工中，使得菌株的使用更加方便，在对菌株进行冻干菌粉制备时，申请人发现，不同菌株由于植物乳杆菌不同，其形状和结构都有差异，因此冻干保护剂的效果存在一定的差异，不能直接套用前人的研究来选择保护剂，经过多次的尝试，申请人发现保护剂中含28-32g/100mL的脱脂乳、20-24g/100mL的海藻糖和0.02-0.04g/100mL的硫酸锰就能使植物乳杆菌菌株LDVS012的存活率达到80％以上；如果再加入5-8g/100mL的甜菊苷就能将乳杆菌菌株LDVS012的存活率提高到88％以上；保护剂主要是维持细菌的细胞液平衡、促进细菌生长，浓度过高过低冻干粉的存活率都有明显影响，使用本申请的方法制备得到的冻干粉具有：存活率高、对亚硝酸盐分解效果好，有效降低亚硝酸盐含量的优势。
【附图说明】
图1为本申请实施例的LDVS012菌株在平皿上的形态图；
图2为本申请实施例的LDVS012菌株在显微镜下的镜检图；
图3为实施例2植物乳杆菌菌株生长曲线图；
图4为实施例2植物乳杆菌pH值变化曲线图；
图5为实施例3的植物乳杆菌降解亚硝酸钠测定结果。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
本实施例为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的筛选方法：
本实施例的菌株从酸豇豆中分离而得，酸豇豆取自广西南宁的市场，采用MRS培养基平板涂布法、斜面划线法分离而得，最终筛选出菌株LDVS012、LDVS007、LDVS008、LDVS005。经过测定申请人发现菌株LDVS012的产酸能力和降解亚硝酸的能力最高。
本实施例的菌株用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，比对结果通过MEGA7.0构建系统发育树。其结果显示菌株LDVS012与植物乳杆菌的同源性分别为99.3％。经生理生化实验得出：菌株LDVS012的适合生长温度为28～32℃，经鉴定，菌株LDVS012属于乳酸菌属，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)种。所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：20030，保藏日期为2020 年6月8日。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LDVS012的平皿形态特征如图1所示，该菌落在平皿上呈白色，菌落边缘光滑、中间凸起呈半球状；镜检图如图2所示，在显微镜下菌株呈现长短不一的杆状，成对或单个存在，不运动，无芽胞。
实施例2：
本实施例的菌株LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的生长、产酸能力鉴定：
在装有100mL液体MRS的三角瓶中，按2％(v/v)的接种量接入种子发酵液，于30℃条件下培养36h，分别于0、1、3、6、9、12、24、36h测定在波长600nm的OD值，绘制生长曲线；结果如图3所示：在0-3h时4株乳酸菌在生长阶段中处于迟缓期，3h之后开始进入对数生长期，12h之后开始进入稳定期。结果表明，12h前乳酸菌生长繁殖较旺盛，与图4乳酸菌pH值变化曲线的特征刚好吻合。在12h时LDVS012在600nm的吸光值要显著高于其他三株菌株(P<0.05)，LDVS005和LDVS007间无显著差异(P>0.05)，LDVS008显著低于其他三株菌株(P<0.05)。在24h、36h时，LDVS012和LDVS005在600nm的吸光值要显著高于其他两株(P<0.05)LDVS007和LDVS008之间无显著差异(P>0.05)，从4株高产酸菌株的生长曲线可以看出LDVS005和LDVS012较其他两株乳酸菌生长旺盛，在发酵后期具有显著优势，LDVS012生长能力最好。
将分离纯化的菌株接种到5mLMRS液体培养基中，30℃静置培养12h后，将种子发酵液按2％(v/v)的接种量接入在装有100mL液体MRS培养基，于30℃条件下培养发酵36h，分别测定在0、0.5、3、6、9、12、24、36h的pH值，结果如图4所示：在前12h内，乳酸菌生长繁殖较旺盛，产酸速度快，其中LDVS012在该阶段产酸能力优于LDVS005、LDVS007、 LDVS008。在12h后pH值下降缓慢，进入相对平稳阶段，4株乳酸菌在各时间点pH值无显著差异(P>0.05)，在36h时LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的MRS培养基 pH值分别为3.80、3.85、3.83、3.70，在后发酵阶段LDVS012和LDVS005要优于其他菌株。
同时，乳酸菌产酸使培养基形成透明圈，透明圈的大小反映了乳酸菌的产酸能力，透明圈和酸度结果参见表1：
表1 不同乳酸菌产酸能力
| 菌株编号 | 溶钙圈直径/cm | 酸度/％ |
| LDVS005 | 1.33±0.072<sup>a</sup> | 2.001±0.006<sup>a</sup> |
| LDVS007 | 1.24±0.042<sup>b</sup> | 1.958±0.054<sup>b</sup> |
| LDVS008 | 1.23±0.038<sup>b</sup> | 1.950±0.030<sup>b</sup> |
| LDVS012 | 1.34±0.076<sup>a</sup> | 2.018±0.054<sup>a</sup> |
从表1可知果表明LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012的透明圈直径显著大于其他乳酸菌(P<0.05)，其中LDVS012透明圈直径最大(1.34±0.076cm)。与培养基酸度得到结果一致，其中LDVS005和LDVS012显著高于LDVS007和LDVS008菌株(P<0.05)。
实施例3：
菌株对亚硝酸盐降解能力的测试：
将乳酸菌接种液体MRS培养基中，于30℃条件下培养24h后,然后按2％(v/v)的添加量接入到5mL含100μg/mL的亚硝酸盐MRS培养液中，于30℃下恒温培养24h。采用亚硝酸盐试剂盒测定亚硝酸盐含量。
式中W0——亚硝酸盐初始含量
Wt——培养时间t时发酵液亚硝酸盐含量
将本申请筛选出来的4株菌株：LDVS005、LDVS007、LDVS008、LDVS012和市面上一款商业菌剂(购买自淘宝网)按照上述的试验方法，分别接入含有亚硝酸钠的MRS培养基中，在0、6、12、24h时测定亚硝酸钠的含量进行亚硝酸盐的降解能力对比；
结果如图5所示。结果表明在6h时，LDVS005、LDVS008、LDVS012降解亚硝酸盐的能力显著高于其他菌株(P<0.05)，其中LDVS012的亚硝酸盐降解率最高(16.2％)，降解能力LDVS012＞LDVS005＞LDVS007＞LDVS008＞商业菌剂。在12h时，LDVS005、 LDVS007、LDVS008、LDVS012降解亚硝酸盐的能力显著高于商业菌剂(P<0.05)，其中 LDVS012的亚硝酸盐降解率最高(86.6％)，降解能力LDVS012＞LDVS005＞LDVS007＞ LDVS008＞商业菌剂。在24h时LDVS005、LDVS012降解亚硝酸盐的能力显著高于其他菌株(P<0.05)，其中LDVS012的亚硝酸盐降解率最高(98.83％)，降解能力LDVS012＞LDVS005 ＞LDVS007＞LDVS008＞商业菌剂。
实施例4：
将菌株直投入食品中制备腌渍食品的亚硝酸盐能力检测：
应用本申请的菌株制备酸豆角，即：将上述菌株配置成约106cfu/mL的菌液；将豇豆洗净沥干水分，放入盐腌制，变软后，按照3％的的接种上述LDVS012、LDVS005、LDVS008、LDVS007和商业菌剂；放入豇中，压紧常温下腌制3天后，取腌渍产生的液体，检测其中的亚硝酸盐含量，测试结果参见表2：
表2 不同菌株腌渍豇豆后的亚硝酸盐含量
| 组别 | LDVS012 | LDVS005 | LDVS007 | LDVS008 | 商品菌剂 |
| 亚硝酸盐(ug/ml) | 0 | 0.10 | 0.47 | 0.89 | 1.75 |
由表2可知，菌株LDVS012发酵过程基本检测不到亚硝酸盐，说明本申请的菌株能有效降低豇豆中的亚硝酸盐含量，具有显著的降低亚硝酸盐的效果，菌株对亚硝酸盐的分解能力从高到低为LDVS012＞LDVS005＞LDVS007＞LDVS008＞商业菌剂。
实施例5：
选择对亚硝酸降解能力最好的菌株LDVS012来制备冻干粉；制备方法如下：
(1)菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，按接种量2％(v/v)将植物乳杆菌接种到MRS培养基扩大培养，30℃条件下40r/min摇床培养24h。
(2)离心收集菌体、分装：将发酵液分装后，在4℃条件下7500rpm离心10min，去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的冻干保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液。
(3)预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12h。
(4)真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度30Pa(本实施例仅公开一个试验条件，实际上在20-30Pa都能达到冷冻干燥的效果)条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3％左右。
冻干保护剂经过申请人的正交优化选择后认为，对保护剂影响最大的几个成分为脱脂乳、海藻糖和硫酸锰，保护剂中脱脂乳为28-32g/100mL、海藻糖为20-24g/100mL、硫酸锰为 0.02-0.04g/100mL；除此之外，申请人还意外发现甜菊苷对乳杆菌有明显的保护作用，对菌株LDVS012的作用效果在5-8g/100mL尤为明显；申请人选择实验过程中几组明显有代表性的配方进行比对，具体配方如表3所示：
表3 冻干粉保护剂的选择配方
| 组1 | 脱脂乳28g/100mL、海藻糖20g/100mL、硫酸锰0.02g/100mL； |
| 组2 | 脱脂乳30g/100mL、海藻糖22g/100mL、硫酸锰0.03g/100mL； |
| 组3 | 脱脂乳32g/100mL、海藻糖24g/100mL、硫酸锰0.04g/100mL； |
| 组4 | 脱脂乳30g/100mL、海藻糖22g/100mL、硫酸锰0.03g/100mL、甜菊苷4g/100mL； |
| 组5 | 脱脂乳30g/100mL、海藻糖22g/100mL、硫酸锰0.03g/100mL、甜菊苷5g/100mL； |
| 组6 | 脱脂乳30g/100mL、海藻糖22g/100mL、硫酸锰0.03g/100mL、甜菊苷7g/100mL； |
| 组7 | 脱脂乳30g/100mL、海藻糖22g/100mL、硫酸锰0.03g/100mL、甜菊苷8g/100mL； |
| 组8 | 脱脂乳30g/100mL、海藻糖22g/100mL、硫酸锰0.03g/100mL、甜菊苷9g/100mL； |
根据表3冻干粉保护剂制备得到的冻干保护剂制备得到的冻干粉进行存活率测定和亚硝酸降解能力测定，测定方法如下：
(1)存活率测定：在第24h，分别测定冻干前的植物乳杆菌活菌数和同样体积菌泥冻干后的活菌数。
冻干存活率/％＝(冻干后1mL菌泥活菌数)/(冻干前1mL菌泥活菌数)
(2)将冻干粉接种到含150μg/mL的亚硝酸盐的MRS培养液中30℃恒温摇床培养24h后测定其亚硝酸盐含量，并计算亚硝酸盐的降解率，以无菌水接种组为对照。亚硝酸盐含量采用亚硝酸盐试剂盒测定。
亚硝酸盐降解率/％＝(发酵前的亚硝酸盐含量－发酵液中的亚硝酸盐含量)/发酵前的亚硝酸盐含量×100％。
测试得到的结果见表4：
表4 不同冻干保护剂的菌株存活率和亚硝酸盐降解率
由表4可知，组5-组7的存活率和亚硝酸盐降解率最高，组1-3的存活率和亚硝酸盐降解率高于组4和组8；说明冻干保护剂中对LDVS012菌株有明显保护效果的成分是：脱脂乳、海藻糖和硫酸锰，添加5-8g/100mL的甜菊苷能对LDVS012菌株保护有促进作用，而甜菊苷添加量为不在5-8g/100mL的范围，将会影响菌株的存活率，同时会对亚硝酸盐的降解率产生影响，因为本申请中降解亚硝酸盐主要是菌株LDVS012的代谢作用产生的效果，如果LDVS012的存活率低，其降解率自然会低；甜菊苷主要是起到平衡细胞浓度的作用，过低、过高都会造成细菌的细胞损伤。
实施例6：
将菌株冻干粉用于制备腌渍食品中亚硝酸盐能力的检测：
选用上述组1-组8制备得到的冻干粉和市面上购买的发酵剂(购买自陕西赛恩生物科技有限公司)来生产腌渍食品，食品加工方法如下：
将蔬菜(萝卜)洗净后沥干加入盐、辣椒等调味料，按照总质量3％的接种量接种上述组 1-组8的冻干菌种，腌渍，腌渍3天后吸取腌渍液检测其中的亚硝酸盐含量。测试得到的亚硝酸盐含量如表5：
表5 酸萝卜中亚硝酸盐含量
| 组别 | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 | 组6 | 组7 | 组8 | 商业种 |
| 亚硝酸盐(ug/ml) | 0.62 | 0.58 | 0.71 | 1.33 | 0.07 | 0.09 | 0.04 | 1.54 | 2.15 |
由表5可知，组5-组7的亚硝酸盐含量最低，组1-组3的亚硝酸盐含量高于组5-组7；组4和组8的亚硝酸盐含量低于组1-组3和组5-组7，商业种的亚硝酸盐含量最高，说明本申请菌株LDVS012制备成冻干菌粉后仍能保持较高的活性，大幅降低腌渍食品中亚硝酸盐的含量。
综上所述，使用本申请的菌株：植物乳杆菌LDVS012虽然不是一个新种菌株，但是与同种微生物相比其具有良好的降解亚硝酸盐的性能，制备成冻干粉后仍能保持较高的活性，具有良好的代谢亚硝酸盐的能力，应用在食品加工过程中能减少亚硝酸盐的产生，能提高腌制食品的安全性，减少癌症发生。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的冻干粉，其特征在于，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的保藏编号为CGMCC NO：20030；所述冻干粉中的保护剂成分为：28-32g/100mL的脱脂乳、20-24g/100mL的海藻糖和0.02-0.04g/100mL的硫酸锰和5-8g/100mL的甜菊苷。
2.如权利要求1所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的冻干粉在降低亚硝酸盐上的应用。
3.如权利要求1所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的冻干粉在食品加工上的应用。
4.一种制备如权利要求1所述包含植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株LDVS012的冻干粉的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）菌种活化及培养：将保藏的植物乳杆菌接种到MRS培养基，静置过夜进行种子培养，经过一次传代活化后，将植物乳杆菌接种到MRS培养基扩大培养；
（2）离心收集菌体、分装：将发酵液分装后、离心、去掉上清发酵液后加入生理盐水重悬，重复离心后得到菌泥；将菌泥与1/5原发酵液体积的保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制成菌悬液；
（3）预冻：将菌悬液倒入无菌培养皿，厚度约为0.5cm，在-80℃下预冻12 h。
（4）真空冷冻干燥：菌泥预冻后在真空度20-30Pa条件下冷冻干燥24h，使冻干菌粉水分含量在3%左右，即得。
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