CN102334605B - 一种直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法，包括丁酸梭菌种子培养、丁酸梭菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式丁酸梭菌发酵剂，所述丁酸梭菌种子培养及高密度放大培养的培养基为g/L：蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO40.5、MnSO40.02，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为：离心转速5000r/min，离心10min，离心温度为4℃，冻干保护剂为10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液。用本方法生产的直投式丁酸梭菌发酵剂的存活率为94.6％，活菌数为3.92×1010cfu/g，按照1‰的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效果。基于本菌株开发了一种新型高活性的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法应用于丁酸梭菌的发酵培养。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，尤其是一种直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法。
背景技术
丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是对宿主有益的正常微生物，经特殊工艺而制成的制剂，通过动物消化道中生物的竞争性排斥作用，可抑制有害菌生长，形成优势菌群或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，可达到调整体内微生态平衡的目的，进而促进动物生长及提高饲料转化率，降低粪便的臭味。在使用抗生素的弊端日益凸显的背景下，丁酸梭菌活菌制剂所具备的诸多优势使其在预防治疗肠道疾病中具有重要意义。
直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入热处理的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理工作。目前直投式丁酸梭菌发酵剂的应用国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种操作简单、活菌含量很高，活力高，接种量小的直投式丁酸梭菌发酵剂及其制备方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，包括丁酸梭菌种子培养、丁酸梭菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式丁酸梭菌发酵剂，所述丁酸梭菌种子培养及高密度放大培养的培养基为g/L：蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO40.5、MnSO40.02，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为：离心转速5000r/min，离心10min，离心温度为4℃，冻干保护剂为10％g/ml脱脂奶粉+10％g/ml麦芽浸出液。
而且，所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCCNo.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述种子培养条件为pH7.4，培养16小时，培养温度为37℃厌氧培养。
而且，所述直投式丁酸梭菌发酵剂中丁酸梭菌的存活率为94.6％，活菌数为3.92×1010cfu/g。
而且，所述直投式丁酸梭菌发酵剂按1‰的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为10.2×109cfu/mL。
而且，直投式丁酸梭菌发酵剂按1‰的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为10.5×109cfu/g。
一种直投式丁酸梭菌发酵剂，其特征在于：包括冻干保护剂和丁酸梭菌，所述冻干保护剂为10％g/ml脱脂奶粉+10％g/ml麦芽浸出液。
而且，所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCCNo.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明中丁酸梭菌TK2菌株通过补料分批发酵高密度放大培养后，采用冷冻干燥法制备菌体发酵剂，用本方法生产的直投式丁酸梭菌发酵剂的存活率为94.6％，活菌数为3.92×1010cfu/g，按照1‰的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效果。
2、本发明首次采用冷冻干燥法制备直投式厌氧型丁酸梭菌发酵剂，与原液态种子接种相比，发酵剂接种量小，直接使用，节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化；保存管理方便，产品品质稳定等优势。
3、本发明确定了丁酸梭菌在浓缩过程中采用离心转速5000r/min，4℃下离心10min，离心得率为92.32％。
4、本发明确定了菌体冷冻干燥过程中保护剂为10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液，最终丁酸梭菌冻干存活率为94.6％，活菌数为3.92×1010cfu/g。
5、采用本发明方法制备的直投式丁酸梭菌发酵剂按1‰的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为10.2×109cfu/mL，采用本发明方法制备的直投式丁酸梭菌发酵剂按1‰的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为10.5×109cfu/g。
6、本发明制备的丁酸梭菌发酵剂具有以下优点：活菌含量很高，活力高，因而接种量小；能直接使用，避免了繁冗的扩大培养过程，既节约劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化；保存管理方便；易于控制生产工艺，产品品质稳定；经简单复水处理后可直接作为种子菌株应用。
附图说明
图1为本发明200L发酵罐生长曲线；
图2为本发明单一保护剂对丁酸梭菌冻干存活率的影响，(注：1水平各保护剂浓度为：脱脂奶粉10％，可溶性淀粉10％，麦芽浸出液10％，蔗糖10％，甘油1％，抗坏血酸1％；2水平各保护剂浓度为：脱脂奶粉15％，可溶性淀粉15％，麦芽浸出液15％，蔗糖15％，甘油2％，抗坏血酸2％)；
图3为本发明复合保护剂对丁酸梭菌冻干存活率的影响，(注：1号10％脱脂奶粉；2号10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液；3号10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液+1％甘油；4号10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液+1％抗坏血酸；5号10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液+10％蔗糖)；
图4为本发明直投式丁酸梭菌发酵剂液态发酵接种效果比较；
图5为本发明直投式丁酸梭菌发酵剂固态发酵接种效果比较。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种丁酸梭菌TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，以下叙述均基于该菌株。
1.种子及发酵培养基：
液态种子及发酵培养基(％)：蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO40.5、MnSO40.02，pH7.4。
2.菌体的种子制备：
将甘油管冻藏的菌种接到装有液体种子培养基的试管中，37℃静置厌氧培养16h。
3.菌体的液态深层发酵培养：
将培养至对数期中期的液体种子以5％的接种量接到装液量为200mL的250mL平底烧瓶中，于37±1℃静置培养16h。
4.菌体的高密度放大培养：
(1)50L种子罐培养
以8％的接种量将丁酸梭菌接种于起始装液量为40L的种子罐中，补料后进行轻微搅拌，于38±0.5℃静置培养16h。
(2)200L发酵罐培养
以5％的接种量将丁酸梭菌接种于200L罐进行发酵培养，装液量160L，于38±0.5℃培养18h。采用蠕动泵添加2mol/L的NaOH溶液调节pH，使之维持在5.8以上，发酵采用静置补料分批发酵，补料后进行轻微搅拌，添加0.3％重量百分比的豆油作消泡剂。
5.离心分离：
采用离心法浓缩分离菌体，分离条件为：5000r/min离心10min，离心温度为4℃。
离心效果测定：
6.保护剂的制备：
分别将10g脱脂奶粉和10g麦芽浸出液溶于100mL蒸馏水中，搅拌均匀、充分分散，配置成10％的脱脂奶粉和10％的麦芽浸出液，以10％脱脂奶粉和10％麦芽浸出液为复合保护剂。
6.菌悬液的制备：
离心后，弃去上清液，将浓缩后的菌泥添加配置好的复合保护剂制成菌悬浮液，菌泥与复合保护剂体积比为1∶3。
7.预冷冻：
将菌悬液放入超低温冰箱中，-40℃下，预冻24h。
8.冷冻干燥：
将预冻的菌悬液经真空冷冻干燥机在-60℃，0.001mbar下干燥18h，制得高活力丁酸梭菌冻干粉。
冻干存活率测定：
取待测样品冻干菌粉于超净工作台，加入10mL无菌生理盐水，静置20min使其复水，然后采用高层半固体琼脂试管计数法测定活菌数，存活率按下式计算：
9.菌体浓度的测定：
高层半固体琼脂试管计数法，用移液管取1mL菌液加进9mL半固体琼脂试管培养基中，振荡搅匀，不要有气泡，依次做10倍梯度稀释，稀释管和计数管于同一管，每个稀释度做三个平行，厌氧培养箱37℃培养32h。
以下是对直投式丁酸梭菌TK2发酵剂制备条件的确定，包括最适菌体收获时间、离心时
间、离心力、冻干保护剂等参数的确定，以及直投式丁酸梭菌发酵剂的应用效果的测定。
一、最适菌体收获时间的确定：
筛选实例1
液态发酵进行8h后从发酵罐中取样，采用高层半固体琼脂试管计数法，测该时刻活菌数。
测得活菌数为：3.7×108cfu/mL。
筛选实例2
液态发酵进行18h后从发酵罐中取样，采用高层半固体琼脂试管计数法，测该时刻活菌数。
测得活菌数为：1×109cfu/mL。
结果
从绘出的发酵过程丁酸梭菌生长曲线可知(附图1)，发酵进行18h左右活菌数达到最大，约为1×109cfu/mL，此后进入稳定期，活菌数基本保持不变，因此最适菌体收获时间为18h-20h。
二、离心分离：
1、发酵液pH对分离效果的影响
筛选实例1
取发酵罐中培养18h的菌液，不调节其pH，在4000r/min、4℃离心15min的条件下收集
上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得离心沉积物活菌数为3.4×1010cfu/g；上清液活菌数为2.4×104cfu/g。；离心得率为80％。
筛选实例2
取发酵罐中培养18h的菌液用NaOH调节pH到6.8，在4000r/min、4℃离心15min的条件
下收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为4.1×109cfu/g；上清液活菌数为2.23×104cfu/g；离心得率为81.3％。
结果
发酵液pH对丁酸梭菌的离心收得率影响不显著(附表1)，因此，对发酵液pH不作调整，可节省劳动强度，简化操作工艺，离心收得率为80％，沉积物活菌数为3.4×1010cfu/g。
2、离心时间对分离效果的影响
筛选实例1
离心力为3438g(4000r/min)时，4℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为3.23×1010cfu/g；上清液活菌数为2.31×104cfu/g；离心得率为75.71％。
筛选实例2
离心力为4297g(5000r/min)时，4℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为4.14×1010cfu/g；上清液活菌数为1.47×104cfu/g；离心得率为92.32％。
筛选实例3
离心力为4297g(5000r/min)时，4℃离心15min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为3.4×1010cfu/g；上清液活菌数为1.16×104cfu/g；离心得率为85.19％。
结果
离心10min-15min，离心得率较高，但以5000r/min，离心10min时，离心得率最高为92.32％
(附表2)，且与4000r/min，离心15min的离心得率差异显著，所以离心时间定为10min。
3、离心力对分离效果的影响
筛选实例1
离心力为5157g(6000r/min)时，4℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为1.26×1010cfu/g；上清液活菌数为8.47×103cfu/g；离心得率为52.41％。
筛选实例2
离心力为6036g(7000r/min)时，4℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为1.49×1010cfu/g；上清液活菌数为1.2×104cfu/g；离心得率为65.8％。
筛选实例3
离心力为6451g(8000r/min)时，4℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为1.28×1010cfu/g；上清液活菌数为6.5×103cfu/g；离心得率为58.48％。
结果
随着离心力的增大，离心得率逐渐降低，以5000r/min离心10min，离心得率为92.32％，其他离心力条件下离心10min，离心得率均较低，其中6000r/min离心10min，离心得率最低为52.41％(附表3)，表明6000r/min离心10min为离心得率的临界条件。故选择5000r/min离心10min。
4、离心温度对分离效果的影响
筛选实例1
离心力为3438g(4000r/min)时，20℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为3.2×1010cfu/g；上清液活菌数为3.46×104cfu/g；离心得率为71.23％。
筛选实例2
离心力为4297g(5000r/min)时，20℃离心10min后，收集上清液和沉淀物，分别进行活菌计数，计算离心收得率。
测得：离心沉积物活菌数为4.08×1010cfu/g；上清液活菌数为2.64×104cfu/g；离心得率为82.28％。
结果
离心力和离心时间不变，温度增加，丁酸梭菌的离心得率降低(附表4)。相同条件下，4℃比20℃离心得率提高约4％-10％。故选择在4℃下离心。
三、冻干保护剂的确定
1、单一保护剂的确定：
筛选实例1
收集离心后的菌泥，以10％的脱脂奶粉作为保护剂，按保护剂与菌泥的体积比为3∶1的比例混合。测定冻干前后的活菌数，计算菌体存活率。
测得存活率为81.5％。
筛选实例2
收集离心后的菌泥，以10％的可溶性淀粉作为保护剂，按保护剂与菌泥的体积比为3∶1的比例混合。测定冻干前后的活菌数，计算菌体存活率。
测得存活率为3.4％。
筛选实例3
收集离心后的菌泥，以10％的麦芽浸出液作为保护剂，按保护剂与菌泥的体积比为3∶1的比例混合。测定冻干前后的活菌数，计算菌体存活率。
测得存活率为58.7％。
结果
作为大分子保护剂的脱脂奶粉保护作用效果显著(附图2)，质量分数为10％的脱脂奶粉可使丁酸梭菌存活率达81.5％，添加15％的脱脂奶粉可使其存活率达到88.7％。
2、复合保护剂的筛选：
筛选实例1
以10％的脱脂奶粉为基础，添加10％麦芽浸出液作为保护剂，测定冻干前后的活菌数，计算菌体存活率。
测得存活率为94.6％。
筛选实例2
以10％的脱脂奶粉为基础，添加10％麦芽浸出液和1％甘油作为保护剂，测定冻干前后的活菌数，计算菌体存活率。
测得存活率为82.3％。
筛选实例3
以10％的脱脂奶粉为基础，添加10％麦芽浸出液和10％蔗糖作为保护剂，测定冻干前后的活菌数，计算菌体存活率。
测得存活率为95％。
结果
以10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液为保护剂和以10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液+10％蔗糖为保护剂时，丁酸梭菌冻干存活率达到最高，分别为94.6％和95％(附图3)。出于成本考虑，组合10％脱脂奶粉+10％麦芽浸出液为最佳，丁酸菌冻干粉活菌数为3.92×1010cfu/g。
四、直投式丁酸梭菌发酵剂在液态发酵中的应用
筛选实例1
将丁酸梭菌发酵剂加入已灭菌的0.85％生理盐水中，常温复水20min，然后按0.1％的接
种量接入灭过菌的液态发酵培养基，组成(％)：蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO40.5、MnSO40.02。于37±1℃厌氧培养16h，测活菌数。
测得活菌数为：9.9×109cfu/mL。
筛选实例2
将经液体活化后的丁酸梭菌按5％的接种量接入灭过菌的液态发酵培养基，组成(％)：蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO40.5、MnSO40.02。于37±1℃厌氧培养16h，测活菌数。
测得活菌数为：8.83×109cfu/mL。
结果
使用直投式丁酸梭菌发酵剂按接种量0.1％与接种量5％液体接种于液态发酵培养基中对比，最高活菌数分别为10.2×109cfu/mL和8.8×109cfu/mL(附图4)。明显降低接种量，并可达到更好的发酵效果。
五、直投式丁酸梭菌发酵剂在固态发酵中的应用
筛选实例1
将丁酸梭菌发酵剂加入已灭菌的0.85％生理盐水中，常温复水20min，然后按0.1％的接种量接入灭过菌的以豆粕为主的固态发酵培养基，组成(％)：豆粕24，玉米粉12，玉米浆粉4，K2HPO41，水60。于37±1℃厌氧培养24h，测活菌数。
测得活菌数为：7.6×109cfu/g。
筛选实例2
将经液体活化后的丁酸梭菌按10％(v/w)的接种量接入灭过菌的以豆粕为主的固态发酵培养基，组成(％)：豆粕24，玉米粉12，玉米浆粉4，K2HPO41，水60。于37±1℃厌氧培养24h，测活菌数。
测得活菌数为：7.9×109cfu/g。
结果
使用直投式丁酸梭菌发酵剂按接种量0.1％与接种量10％液体接种于固态发酵培养基中对比，最高活菌数分别为10.45×109cfu/g和9.4×109cfu/g(附图5)。发酵剂接种后菌体存在约16h的迟滞期，而后生长快速，最终发酵效果理想，可明显降低接种量。
结论
通过对直投式丁酸梭菌发酵剂生产工艺的研究，丁酸梭菌浓缩采用最终丁酸梭菌存活率达94.6％，发酵剂的活菌数为3.92×1010cfu/g，按1‰的接种量便可达到理想的液态或固态发酵效果，最高活菌数分别为10.2×109cfu/mL、10.45×109cfu/g。
表1发酵液pH对分离效果的影响
表2离心时间对分离效果的影响
表3离心力对分离效果的影响
表4离心温度对分离效果的影响
Claims (4)
1.一种直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于：包括丁酸梭菌种子培养、丁酸梭菌高密度放大培养、冷冻干燥法制备菌体发酵剂，最后得到直投式丁酸梭菌发酵剂，所述丁酸梭菌种子培养及高密度放大培养的培养基为g/L：蛋白胨1.75-2；葡萄糖0.5，MgSO40.02、K2HPO4 0.5、MnSO4 0.02，冷冻干燥法制备菌体发酵剂浓缩条件为：离心转速5000r/min，离心10min，离心温度为4℃，冻干保护剂单位以g/ml计为：10%脱脂奶粉+10%麦芽浸出液，
所述种子培养条件为pH7.4，培养16小时，培养温度为37℃厌氧培养；
所述直投式丁酸梭菌发酵剂中丁酸梭菌的存活率为94.6%，活菌数为3.92×1010cfu/g。
2.根据权利要求1所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于：所述丁酸梭菌的名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.根据权利要求1所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于：所述直投式丁酸梭菌发酵剂按1‰的接种量应用于液态发酵，最高活菌数为10.2×109cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的直投式丁酸梭菌发酵剂的制备方法，其特征在于：直投式丁酸梭菌发酵剂按1‰的接种量应用于固态发酵，最高活菌数为10.5×109cfu/g。
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