CN110982762B - 一种生孢梭菌的稳定剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生孢梭菌的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含柠檬酸钠、植酸、半胱氨酸、脱脂奶粉和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。本发明的生孢梭菌质控菌的稳定剂，可使生孢梭菌其冻干存活率达到90％以上，冻干过程几乎不会损失，保证了冻干过程的稳定性，且能够使生孢梭菌冻干粉在长期储存过程中菌含量不发生变化。

Description

一种生孢梭菌的稳定剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种生孢梭菌的稳定剂及其应用。
背景技术
生胞梭菌属于严格厌氧的革兰氏阳性菌，能产生孢子，对外界具有较强的抵抗力，广泛存在于自然界废水、土壤、人和动物粪便中。肉毒梭菌属于革兰氏阳性菌,厌氧条件下产生的神经毒素可以导致严重的肌肉松弛和麻痹的肉毒毒素中毒,是食品工业中危害最大的有害物之一，生孢梭菌也能产生不同于肉毒毒素的其他有毒代谢产物。生孢梭菌和肉毒梭菌在生化特征、遗传学特性方面非常相似。因此，通常以生孢梭菌的形式作为评估产品及生产环境等厌氧微生物污染指示菌。现行中国药典中无菌检查法及微生物限度检查均需求生孢梭菌作为质控菌进行检验。质控菌株能够验证检验方法、对检验人员进行能力验证、验收微生物培养基，保证微生物实验过程的质量控制，是微生物检验过程中的标准物质。
稳定剂是菌株在冷冻干燥过程保护细胞的有效物质,不同的菌株生理代谢特性不同，在冷冻干燥过程中抗逆能力不同，因此在保护剂选择上有各自的偏好，因此需对不同种类的菌株进行筛选，以便得到效果最好的稳定剂。目前还没有一种专门用于生孢梭菌定量储存的稳定剂。中国专利CN109971673提供了一种适用性试验菌株的制备方法，该方法定量方法不明确，后续仅能使用该次制备的菌重复使用，无法使用该方法重复制备。现市场上较少有生胞梭菌定量质控菌种产品，由于技术有限，保质期较短，无法避免在运输和储存期间菌细胞数量的衰减，影响微生物检验过程质量的控制。因此提供一种生孢梭菌的稳定剂具有重要意义。
发明内容
为克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种生孢梭菌的稳定剂及其应用。
本发明所采取的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供：
一种生孢梭菌的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含以下原料：柠檬酸钠、植酸、半胱氨酸、脱脂奶粉、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
在一些实施例中，上述稳定剂中溶质的质量组成为：0.1-1份柠檬酸钠、0.5-2份植酸、1-2份半胱氨酸、8-12份脱脂奶粉、0.05-0.3份聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
在一些实施例中，上述稳定剂中溶质的质量组成为：0.1％-1％柠檬酸钠、0.5％-2％植酸、1％-2％半胱氨酸、8％-12％脱脂奶粉、0.05％-0.3％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
本发明的第二个方面，提供：
一种生孢梭菌定量化质控品，由生孢梭菌菌液与上述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。
在一些实施例中，生孢梭菌菌液与稳定剂(干重)的混合比为300-1000CFU/(0.1-0.3)g稳定剂(干重)。这样可以保证细菌可以充分被稳定剂保护，同时也不会过于浪费稳定剂。
在一些实施例中，上述的定量化质控品中生孢梭菌的含量为300-1000CFU/瓶。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的含量。该菌含量的偏差不大于20％。
本发明的第三个方面，提供：
一种生孢梭菌定量质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株复苏：生孢梭菌接种至复苏培养基，复苏传代；
(2)增菌：复苏的生孢梭菌接种至增殖培养基中，培养增殖，得生孢梭菌菌液；
(3)计数：将生孢梭菌菌液与上述的稳定剂混匀，计数后分装，得定量化生孢梭菌菌液；
(4)冻干：将定量化生孢梭菌菌液冷冻干燥，密封得到生孢梭菌定量质控品。
在一些实施例中，步骤(2)中所述增殖培养基包含以下质量分数的原料为0.1％-2％蛋白胨，0.5％-2％大豆胨，0.2％-2％牛肉粉，0.1％-2％酵母粉，0.05％-0.5％可溶性淀粉、0.2％的L-半胱氨酸盐酸盐。
在一些实施例中，步骤(2)中所述增殖培养基包含以下质量分数的原料为1％蛋白胨，1％大豆胨，1％牛肉粉，0.5％酵母粉，0.1％可溶性淀粉、0.2％的L-半胱氨酸盐酸盐。
在一些实施例中，步骤(1)中所述复苏培养基为哥伦比亚培养基。
在一些实施例中，步骤(4)中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至-30℃至-40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0-3％。
在一些实施例中，上述真空干燥的条件为：真空度10Pa-100Pa，干燥温度-35℃至-15℃，干燥时间20h-48h；所述解析干燥条件为：干燥温度0℃-25℃。
在一些实施例中，步骤(3)中所述的计数方法为吸光度标准曲线法。
本发明的有益效果为：
本发明使用的稳定剂，可使生孢梭菌其冻干存活率达到90％以上，冻干过程几乎不会损失，保证了冻干过程的稳定性，且能够使生孢梭菌冻干粉在长期储存过程中菌含量不发生变化。
附图说明
图1为实施例和对比例中各组成中生孢梭菌含量随时间的变化图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
方便比较起见，菌株复苏、增菌、计数和冻干的操作如下：
菌株复苏
生孢梭菌划线(编号：CMCC64941，购买自：中国医学细菌保藏中心)接种至哥伦比亚培养基，厌氧复苏传代，培养温度为36±1℃，并进行鉴定。
增菌
复苏并鉴定后的生孢梭菌接种至生孢梭菌特制培养基中，培养基的组成为：1％蛋白胨，1％大豆胨，1％牛肉粉，0.5％酵母粉，0.1％可溶性淀粉、0.2％的L-半胱氨酸盐酸盐，pH为6.8±0.2，置于36℃恒温振荡器中培养增殖，转速为150rpm/min，培养32h。
计数
用增菌后的生孢梭菌菌悬液建立吸光值与平板计数含菌量的标准曲线。其方程式为：Y＝(1E+09)X+(3E+07)，R2＝0.998。以生孢梭菌悬液与稳定剂体积比为1:10的用量，用稳定剂将步骤(2)中的生孢梭菌悬液稀释至合适的浓度，用分光光度计测定吸光值，即可根据吸光值测定结果计算所需生孢梭菌悬液量
冻干
用稳定剂将生孢梭菌菌悬液稀释至合适的浓度，分装至西林瓶，半加塞后采用液氮进行快速冷冻，置于已预冷至-40℃的冷冻干燥箱中，平衡30min后，开启真空泵，真空干燥条件为：真空度20Pa，干燥温度-25℃，干燥时间为30h，真空干燥后进行解析干燥，解析干燥条件为：干燥温度20℃，干燥时间约10h，干燥至样品含水量小于3％，真空压塞。
当然，上述操作也可以使用本领域周知的方法进行。
表1不同组成的稳定剂(质量百分数，％)
Figure BDA0002355744170000041
生孢梭菌定量质控菌的均匀性和稳定性检验：
将上述冻干好的定量质控生孢梭菌置于2-8℃的冰箱内储存。每个月随机抽取其中3瓶，每瓶涂布两个平板计数，其平均数为每个月的活菌数。
按照GB/T15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》对实施例所制备的生孢梭菌定量质控菌均匀性和稳定性进行检验，采用SPSS单因素方差分析验证数据是否有显著性差异。其中均匀性检验随机抽取10瓶样品进行计数，稳定性选取12个月检验数据进行检验，在95％的置信区间下，P值均>0.05，表明数据没有统计学差异，即所制备的质控菌均匀性和稳定性符合要求。
使用不同组成稳定剂对生孢梭菌冻干及储存的影响
采用不同组成稳定剂对生孢梭菌进行稳定保护，各稳定剂组成如表1所示。
采用平板计数法，分别计算冻干前和冻干后西林瓶内生孢梭菌含量，并计算冻干存活率，其中冻干前生孢梭菌含量计算方法：吸取西林瓶内100uL生孢梭菌细胞悬液，涂布至哥伦比亚培养基上，37℃下厌氧培养24h-48h后进行计数；冻干后生孢梭菌含量计算方法：添加冻干前等体积的无菌生理盐水进行溶解并振荡均匀，吸取100uL菌悬液涂布于对应琼脂培养基上培养后进行计数。
冻干存活率的计算公式为：
Figure BDA0002355744170000042
结果如表2所示：
表2不同组成稳定剂中的生孢梭菌冻干存活率
Figure BDA0002355744170000051
由表2可看出，采用实施例的稳定剂，可使冻干存活率提高至90％以上，而采用组成B或组成C的稳定剂，冻干存活率也比采用组成D的稳定剂明显较高。
不同组成稳定剂对生孢梭菌冻干储存的影响
使用不同组成稳定剂对生孢梭菌进行稳定保护，各稳定剂组成如表1所示。为使对比试验初期的菌数量接近，保持对比基础状态一致，根据表2测得的不同组成稳定剂中生孢梭菌的冻干存活率，用吸光度标准曲线法对冻干前活菌数进行即时测定，按冻干存活率计算冻干前生孢梭菌的用量，并配制成冻干后含活菌数约为1000CFU/瓶的生孢梭菌产品。
对使用不同稳定剂制备而成的生孢梭菌冻干产品进行长期储存(储存温度：2℃-8℃，储存时间：12个月)，每月测定各冻干产品中菌含量，各组成中生孢梭菌含量随时间的变化如图1所示。
从图1可看出，使用组成A1(实施例1)、A2(实施例2)制备得到的生孢梭菌产品在12个月的储存期内，其菌含量在1000CFU/瓶上下摆动，变化范围较小；而组成B-C则在储存初期(第1-3个月)菌含量能保持在较高的水平，但在储存第4个月后，生孢梭菌含量开始显著下降，而D组则在储存初期就出现生孢梭菌含量下降的现象。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生孢梭菌的稳定剂，溶剂为水，其特征在于：其溶质的质量百分数为：0.1%-1%柠檬酸钠、0.5%-2%植酸、1%-2%半胱氨酸、8%-12%脱脂奶粉、0.05%-0.3%聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
2.一种生孢梭菌定量化质控品，其特征在于：由生孢梭菌菌液与权利要求1所述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。
3.根据权利要求2所述的定量化质控品，其特征在于：所述生孢梭菌的含量为300-1000CFU/瓶。
4.一种如权利要求2或3所述的生孢梭菌定量化质控品的制备方法，包括如下步骤：
（1）菌株复苏：生孢梭菌接种至复苏培养基，复苏传代；
（2）增菌：复苏的生孢梭菌接种至增殖培养基中，培养增殖，得生孢梭菌菌液；
（3）计数：将生孢梭菌菌液与权利要求1所述的稳定剂混匀，计数后分装，得定量化生孢梭菌菌液；
（4）冻干：将定量化生孢梭菌菌液冷冻干燥，密封得到生孢梭菌定量化质控品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述增殖培养基包含以下质量分数的原料：0.1%-2%蛋白胨，0.5%-2%大豆胨，0.2%-2%牛肉粉，0.1%-2%酵母粉，0.05%-0.5%可溶性淀粉、0.2%的L-半胱氨酸盐酸盐。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至-30℃至-40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0-3%。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述真空干燥的条件为：真空度10Pa-100Pa，干燥温度-35℃至-15℃，干燥时间20h-48h；所述解析干燥的条件为：干燥温度0℃-25℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中的计数方法为吸光度标准曲线法。
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