CN111004758B - 一种产气肠杆菌的稳定剂及其应用 - Google Patents

一种产气肠杆菌的稳定剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种产气肠杆菌的稳定剂，包含以下原料：L‑肌肽、聚乙二醇、脱脂奶粉、甘氨酸、抗坏血酸。本发明的产气肠杆菌质控菌的稳定剂，可使质控菌冻干存活率达到95％以上，且能够在长期储存过程中保持细菌含量的稳定性。

Description

一种产气肠杆菌的稳定剂及其应用
技术领域
本发明微生物质量控制领域，尤其涉及一种产气肠杆菌的稳定剂及其应用。
背景技术
真空冷冻干燥技术于上世纪70年代初期开始研发，现已商业化生产。冷冻干燥是将菌体在共溶点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空状态下，使菌品中的冰升华，最后达到干燥的目的。但是在冷冻干燥过程中，易造成部分微生物细胞的损伤、死亡及某些酶蛋白分子的钝化，许多研究发现在细菌冻干前加入适当的物质能起到保护作用，即有效保护剂的使用对于细菌的冷冻干燥是成功的关键。在冻干过程中添加保护剂，在很大程度上可减轻或避免冷冻干燥对细胞带来的损伤。保护剂可以减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持其原有的生理、生化特性和生物活性。
产气肠杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科，主要生存于人类和动物的肠道内，在人体虚弱的时候可能会引起疾病。产气肠杆菌属于大肠菌群，是食品、饮用水和餐具等卫生污染情况的指示菌，因其与大肠埃希氏菌的区别，通常与大肠埃希氏菌一起作为大肠菌群阳性质控菌。而质控菌株作为微生物检验中的阳性对照，能够验证检验方法准确性、对检验人员进行能力验证或用来验收微生物培养基，保证微生物实验过程的质量控制，是微生物检验过程中的标准物质。定量质控菌株由于其使用方便，快速，提高检验效率等多种优点，是目前微生物检验过程质控标准物质的发展趋势。如现行水质检测领域推荐产气肠杆菌定量标准菌株作为阳性质控和培养基检验等。
目前还没有针对产气肠杆菌定量质控菌株的制备方法，关键原因在于目前还未有一种稳定剂能够使产气肠杆菌在冻干过程不受损失，且提高产气肠杆菌在长期储存以及短期运输过程的稳定性。因此，提供一种产气肠杆菌的稳定剂及产气肠杆菌定量质控菌的制备方法，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产气肠杆菌的稳定剂及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种产气肠杆菌的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含以下原料：L-肌肽、聚乙二醇、脱脂奶粉、甘氨酸、抗坏血酸。
在一些实例中，其溶质的质量组成为：1～5份L-肌肽、1～2份聚乙二醇、7～12份脱脂奶粉、1～3份甘氨酸、1～3份抗坏血酸。
在一些实例中，其溶质的质量组成为：1％～5％L-肌肽、1％～2％聚乙二醇、7％～12％脱脂奶粉、1％～3％甘氨酸、1％～3％抗坏血酸。
在一些实例中，其溶质的质量组成为：1％～3％L-肌肽、1％～2％聚乙二醇、7％～12％脱脂奶粉、1％～3％甘氨酸、1％～3％抗坏血酸。
本发明的第二个方面，提供：
一种产气肠杆菌定量化质控品，由产气肠杆菌与上述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。
在一些实例中，产气肠杆菌菌液与稳定剂(干重)的混合比为1000CFU/(0.1-0.3)g稳定剂(干重)。这样可以保证细菌可以充分被稳定剂保护，同时也不会过于浪费稳定剂。
在一些实例中，上述的产气肠杆菌定量化质控品中产气肠杆菌的含量为300～1000CFU/支。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的含量。该菌含量的偏差不大于20％。
本发明的第三个方面，提供：
一种产气肠杆菌定量质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株复苏：产气肠杆菌接种至复苏培养基，复苏传代；
(2)增菌：复苏的产气肠杆菌接种至增殖培养基中，培养增殖，得产气肠杆菌菌液；
(3)计数：将产气肠杆菌菌液与上述的稳定剂混匀，确定产气肠杆菌浓度后计数分装，得定量化产气肠杆菌菌液；
(4)冻干：将定量化产气肠杆菌菌液冷冻干燥，密封得到产气肠杆菌定量质控品。
在一些实例中，步骤(2)中所述增殖培养基为增菌肉汤，其组成为：蛋白胨0.5％、特殊蛋白胨0.5％、牛肉粉0.3％、氯化钠0.5％，余量为水，pH调节为7.2±0.1。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的适用于该菌的增殖培养基。
在一些实例中，上述特殊蛋白胨购自OXOID公司，货号为LP0072。
在一些实例中，步骤(4)中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至-30℃至-40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0-3％。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的冷冻干燥方法。
在一些实例中，真空干燥的条件为：真空度10Pa-100Pa，干燥温度-35℃至-15℃，干燥时间20h-48h；所述解析干燥条件为：干燥温度0℃-25℃。
在一些实例中，上述的制备方法步骤(3)中的计数方法选自分光光度计计数、麦氏比浊法计数。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的细菌计数方法，优选计数误差小于20％的计数方法。
本发明的有益效果是：
本发明的产气肠杆菌质控菌的稳定剂，使质控菌冻干存活率达到95％以上，且能够在长期储存过程中保持细菌含量的稳定性。
附图说明
图1为实施例1～3与对比例1～3中各配方中产气肠杆菌含量随时间的变化图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
方便比较起见，菌株复苏、增菌、计数和冻干的操作如下：
菌株复苏
取产气肠杆菌标准菌株划线接种到TSA培养基中进行复苏培养，培养温度36±1℃，并进行鉴定。
增菌
复苏并鉴定后的菌种接种于产气肠杆菌增殖培养基中，并置于36℃恒温振荡器中进行培养，转速为150rpm/min，培养8～12小时。
计数
吸取适量的产气肠杆菌菌液进行测定OD值，根据产气肠杆菌活菌数与OD值的标准曲线，将该菌悬液使用稳定剂进行稀释至需求浓度。
冻干
用稳定剂将细菌悬液振荡均匀混合后，分装至西林瓶中，半加塞，采用液氮进行快速冷冻，置于已经预冷至-40℃的冷冻干燥箱中，平衡30min后，开启真空泵，真空干燥条件为：真空度10pa，干燥温度为-30℃，干燥时间为20小时，干燥结束后进行解析干燥，解析干燥条件为：干燥温度20℃，时间为10小时，干燥至样品含水量小于3％，真空压塞。
当然，上述操作也可以使用本领域周知的方法进行。
表1不同配方的稳定剂(质量百分数，％)
Figure BDA0002355836800000031
Figure BDA0002355836800000041
产气肠杆菌定量质控菌的均匀性和稳定性检验：
将上述冻干好的定量质控菌株置于2-8℃冰箱内储存。每个月随机抽取其中3支，每支涂布两个平板计数，其平均数为每个月的活菌数。
按照GB/T15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》对实施例所制备的产气肠杆菌定量质控菌均匀性和稳定性进行检验，采用SPSS单因素方差分析验证数据是否有显著性差异。其中均匀性检验随机抽取10支样品进行计数，稳定性选取12个月检验数据进行检验，在95％的置信区间下，P值均>0.05，表明数据没有统计学差异，即所制备的质控菌均匀性和稳定性符合要求。
不同配方稳定剂对产气肠杆菌冻干及储存的影响
采用不同配方稳定剂对产气肠杆菌进行稳定保护，各稳定剂配方如表1所示。
采用平板计数法，分别计算冻干前和冻干后西林瓶内细菌含量，并计算冻干存活率，其中冻干前细菌含量计算方法：吸取西林瓶内100ul菌悬液，涂布于TSA培养基上，36℃培养18h～24h后进行计数；冻干后含菌量计算：添加冻干前等体积的无菌生理盐水进行溶解并振荡均匀，吸取100ul菌悬液涂布于对应琼脂培养基上培养后进行计数。
冻干存活率计算公式如下：
Figure BDA0002355836800000042
结果如表2所示：
表2不同配方稳定剂中的产气肠杆菌冻干存活率
Figure BDA0002355836800000043
Figure BDA0002355836800000051
由表2可以看出，采用实施例1～3的稳定剂，可使冻干存活率提高至95％以上。而采用对比例1和2的稳定剂，冻干存活率也比采用对比例3的成形剂明显提高，但相较于实施例1～3，因其缺乏或替换了核心保护成分，冻干保护效果差，无法满足产气肠杆菌冻干保存的实际需求。
不同配方稳定剂对产气肠杆菌冻干储存的影响
采用不同配方稳定剂对产气肠杆菌进行稳定保护，各稳定剂配方如表1所示。
为使对比试验初期的细菌数量接近，保持对比基础状态一致，根据表2测得的不同配方稳定剂中产气肠杆菌的冻干存活率，用分光光度计对冻干前活菌数进行即时测定，按冻干存活率计算冻干前产气肠杆菌的用量，并配制成冻干后含活菌数约为1000CFU/支的产气肠杆菌产品。
对使用不同稳定剂制备而成的产气肠杆菌冻干产品进行长期储存(储存温度：2℃-8℃，储存时间：12个月)，每月测定各冻干产品中细菌含量，各配方中产气肠杆菌含量随时间的变化如图1所示。
从图1可看出，使用实施例1～3制备得到的产气肠杆菌产品在12个月的储存期内，其细菌含量在1000CFU/支上下浮动，变化范围较小；而对比例配方则在储存初期(第1-3个月)细菌含量能保持在较高的水平，但在储存第4个月后，产气肠杆菌含量开始显著下降。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种产气肠杆菌的稳定剂，溶剂为水，其特征在于：其溶质的质量百分数为：1%～5%L-肌肽、1%～2%聚乙二醇、7%～12%脱脂奶粉、1%～3%甘氨酸、1%～3%抗坏血酸。
2.一种产气肠杆菌定量化质控品，其特征在于：由产气肠杆菌与权利要求1所述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。
3. 根据权利要求2所述的产气肠杆菌定量化质控品，其特征在于：所述产气肠杆菌的含量为300~1000 CFU/支。
4.一种产气肠杆菌定量质控品的制备方法，包括如下步骤：
（1）菌株复苏：产气肠杆菌接种至复苏培养基，复苏传代；
（2）增菌：复苏的产气肠杆菌接种至增殖培养基中，培养增殖，得产气肠杆菌菌液；
（3）计数：将产气肠杆菌菌液与权利要求1所述的稳定剂混匀，确定产气肠杆菌浓度后计数分装，得定量化产气肠杆菌菌液；
（4）冻干：将定量化产气肠杆菌菌液冷冻干燥，密封得到产气肠杆菌定量质控品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述增殖培养基为增菌肉汤，其组成为：蛋白胨0.5%、特殊蛋白胨0.5%、牛肉粉0.3%、氯化钠0.5%，余量为水，pH调节为7.2±0.1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至-30℃至-40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0-3%。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述真空干燥的条件为：真空度10Pa-100Pa，干燥温度-35℃至-15℃，干燥时间20h-48h；所述解析干燥的条件为：干燥温度0℃-25℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中的计数方法选自分光光度计计数或麦氏比浊法计数。
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