CN108041022A - 一种新型的血浆游离dna和血细胞保存液 - Google Patents

一种新型的血浆游离dna和血细胞保存液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，有以下按重量百分比计的原料组成：磷酸缓冲液10～15％；防腐剂20～30％；抗凝剂4～8％；酶抑制剂1～5％；固定剂0.3～0.8％；超纯无菌水；以上各组分含量之和为100％。本发明产品具有以下有益效果：本产品综合解决了两大细胞保存难题，使在保存血细胞不破碎的情况下，保证了血浆游离DNA的含量，并能在常温下保存样本7天时间仍有较高的细胞活性。本发明组分优化，减少了生产难度，节约了成本。具有更高的市场适应性，且本发明产品在保存和运输上更加方便，减少运输成本。

Description

一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液
技术领域
本发明公开了一种保存液，具体为一种血浆游离DNA和血细胞保存液，属于生物制剂技术领域。
背景技术
细胞，是组成生命最基本的单位，血细胞个各个组分在很多方面均具有应用价值。与普通的生物制品和药品不同，血细胞制品中，维持细胞活性是一个极大的挑战。生理盐水作为常用的输注介质，在临床应用上方便安全，但是细胞在生理盐水中活性的下降速度非常快，10小时之内细胞的活性丧失就达到30％之多，因此只适合细胞短暂保存。
而传统的抗凝管如EDTA抗凝管，肝素抗凝管等具有保存血样的作用，但是其对保存的条件要求高，在-4℃的环境下保存12小时，其中细胞活性丧失严重达30-40％之多，使得样本在更高要求的实验中无法满足要求。
目前市场上虽有相应保存血液细胞的产品，但其功能具有单一性，且保存效果随时间增加下降严重。如强生cellsave细胞保存管、罗氏cellfree DNA collection tube血浆游离DNA保存管。两种产品在不同程度上满足使用者要求，但因其高昂的价格，功能单一性使得使用者承担高额费用的同时无法得到更好的效果。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，以解决现有技术的的上述问题。本发明在降低生产成本的同时，扩大产品的使用范围，在常温保存血细胞的同时，对血浆中的游离DNA液进行有效的保存。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，由以下按重量百分比计的原料组成：
磷酸缓冲液10～15％；
防腐剂20～30％；
抗凝剂4～8％；
酶抑制剂1～5％；
固定剂0.3～0.8％；
余量为超纯无菌水。以上各组分之和为100％。
上述保存液中，
所述的超纯无菌水为mili-Q生产经过高温灭菌处理过的超纯无菌水。
所述的磷酸缓冲液的pH值为7.4，所述的磷酸缓冲液由以下重量份的原料组成：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加超纯无菌水约800mL充分搅拌溶解，然后加入盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。其作用为维持血液的PH值和钠、钾离子强度。
所述的防腐剂选自重氮烷基脲、咪唑烷基脲和羟甲基甘氨酸钠中的一种或几种组合。其作用为防止血液腐败，抑制细菌滋生。优选重氮烷基脲和羟甲基甘氨酸钠的组合。
所述的抗凝剂选自EDTA、EDTA钠盐和EDTA钾盐中的一种或几种组合，不推荐添加肝素、柠檬酸钠等加入。抗凝剂的作用为防止血液的凝固，优选为EDTA钾盐。
所述的酶抑制剂选自金精三羧酸、氟化钠和D-(+)-甘油醛中的一种或几种组合，优选金精三羧酸、氟化钠和D-(+)-甘油醛三者的组合。
所述的固定剂为PEG20000，其作用用于固定细胞膜，防止细胞破碎，所述的固定剂优选为0.3～0.6％。
本发明产品具有以下有益效果：
(1)本产品综合解决了两大细胞保存难题，使在保存血细胞不破碎的情况下，保证了血浆游离DNA的含量，并能在常温下保存样本7天时间仍有较高的细胞活性。
(2)组分优化，减少了生产难度，节约了成本。具有更高的市场适应性，且本发明产品在保存和运输上更加方便，减少运输成本。
附图说明
图1为防腐剂比例对细胞保存效果影响图；
图2为抑制剂比例对游离DNA的影响；
图3为本发明与强生cellsave细胞保存存活率对比图；
图4为本发明与罗氏cellfree DNA collection tube细胞保存存活率对比图；
图5为本发明与强生cellsave对比血浆游离DNA细胞保存效果对比图；
图6为本发明与罗氏cellfree DNA collection tube血浆游离DNA细胞保存效果对比图；
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
表1：实施例1配方：默禾1组
组分名称 含量
磷酸缓冲液 10ml
羟甲基甘氨酸钠 10g
重氮烷基脲 10g
EDTA-K2 4g
PEG20000 0.5g
金精三羧酸 1g
氟化钠 1g
超纯无菌水 定容至100ml
表2：实施例4配方：
表3：防腐剂比例对细胞保存效果影响
0h 24h 48h 72h 96h
实施例1 100.00％ 98.30％ 95.80％ 94.30％ 90.10％
实施例4 99.70％ 97.50％ 94.80％ 90.80％ 85.50％
如图1所示的防腐剂比例对细胞保存效果影响图可见：防腐剂只添加重氮烷基脲的保存效果和重氮烷基脲和羟甲基甘氨酸钠的组合保存效果对比，优选组分结果优于单一组分。
表4：实施例2配方：默禾2组
组分名称 含量
磷酸缓冲液 15ml
羟甲基甘氨酸钠 5g
重氮烷基脲 15g
咪唑烷基脲 5g
EDTA-K2 6g
PEG20000 0.8g
金精三羧酸 1g
D-(+)-甘油醛 2.5g
超纯无菌水 定容至100ml
表5：实施例5配方：
实施例5中EDTA-Na2溶解耗时较长，批量生产时延长生产工期。将两种配方保存管各采血8-10mL，配方五保存管，24h后血液有部分凝结，相比下配方二中样本正常。
表6：实施例3配方：默禾3组
组分名称 含量
磷酸缓冲液 10ml
重氮烷基脲 25g
咪唑烷基脲 5g
EDTA 1g
EDTA-K2 4.5g
PEG20000 0.4g
氟化钠 2g
超纯无菌水 定容至100ml
实施例6-7：单一抑制剂和优选抑制剂对细胞保存后游离DNA的影响效果
表7：实施例6配方：
组分名称 含量
磷酸缓冲液 15ml
羟甲基甘氨酸钠 5g
重氮烷基脲 15g
咪唑烷基脲 5g
EDTA-K2 6g
PEG20000 0.6g
金精三羧酸 3.5g
超纯无菌水 定容至100ml
表8：实施例7配方
表9：抑制剂比例对游离DNA的影响
24h 48h 72h 96h
实施例6 8.00ng 8.27ng 9.10ng 10.30ng
实施例7 7.82ng 7.85ng 8.35ng 8.90ng
由图2或表8-9结果可以看出，单一酶抑制剂的配方六相比与优选比例的配方七的血浆游离DNA的保存效果较差。
上述样品的制备：本产品分装至10ml容量的采血管中，每管保存液含量为200ul，使用采血针将静脉血采入管内，采血量8-10ml，不应少于8ml。同时使用强生和罗氏采血管，按照其操作说明书完成采血。
细胞保存存活率实验：
(1)与强生cellsave对比：
检测使用仪器为美国Nexcelom公司全自动双荧光细胞活性计数分析仪Cellometer AUTO 2000，使用复合型染料AO/PI，调其浓度至2×，使用1×PBS溶液将保存后的稀释10倍，与2×复合染料1:1混合后，在荧光细胞计数仪下分别在24h、48h、72h、96h观察计活率。
随着保存时间的延长，本发明配方保存细胞存活的百分比上优于强生公司cellsave产品，且稳定性较好，细胞形态正常。如图3所示。(以上表格和图附图3对应。)
(2)与罗氏cellfree DNA collection tube对比：
检测使用仪器为美国Nexcelom公司全自动双荧光细胞活性计数分析仪Cellometer AUTO 2000，使用复合型染料AO/PI，调其浓度至2×，使用1×PBS溶液将保存后的稀释10倍，与2×复合染料1:1混合后，在荧光细胞计数仪下分别在24h、48h、72h、96h观察计活率。
其测试数据如图4所示。(以上表格和图附图4对应。)
血浆游离DNA实验：
(1)与强生cellsave对比：
将每管血样本分装至两毫升EP管中，分别在24h、48h、72h、96h时2000rpm离心10min，12000rpm离心5min，取其中500ul血浆用于血浆游离DNA提取。使用Thermo Fisher公司MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit试剂盒完成抽提。检测数据由Thermo Fisher公司Qbit3.0测出。
通过测试数据可以看出本发明中的配方效果优于强生血浆游离DNA保存效果，其中强生产品中有基因组释放导致检测出DNA含量升高。如图5所示。(以上表格和图附图5对应。)
(2)与罗氏cellfree DNA collection tube对比：
将每管血样本分装至两毫升EP管中，分别在24h、48h、72h、96h时2000rpm离心10min，12000rpm离心5min，取其中500ul血浆用于血浆游离DNA提取。使用Thermo Fisher公司MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit试剂盒完成抽提。检测数据由Thermo Fisher公司Qbit3.0测出。
由对比数据得出本产品同样在血浆游离DNA保存效果上优于罗氏产品，能更好的保持基因组DNA不释放到血浆中。如图6所示。(以上表格和图附图6对应。)

Claims (10)

1.一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：由以下按重量百分比计的原料组成：
磷酸缓冲液 10～15％；
防腐剂 20～30％；
抗凝剂 4～8％；
酶抑制剂 1～5％；
固定剂 0.3～0.8％；
余量为超纯无菌水；以上各组分含量之和为100％。
2.根据权利要求1所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述超纯无菌水为mili-Q生产经过高温灭菌处理过的超纯无菌水。
3.根据权利要求1所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的磷酸缓冲液的pH值为7.4，所述的磷酸缓冲液由以下重量份的原料组成：磷酸二氢钾：0.27g，磷酸氢二钠：1.42g，氯化钠：8g，氯化钾：0.2g，加超纯无菌水约800mL充分搅拌溶解，然后加入盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。
4.根据权利要求1所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的防腐剂选自重氮烷基脲、咪唑烷基脲和羟甲基甘氨酸钠中的一种或几种组合。
5.根据权利要求4所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的防腐剂选自重氮烷基脲和羟甲基甘氨酸钠的组合。
6.根据权利要求1所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的抗凝剂选自EDTA、EDTA钠盐和EDTA钾盐中的一种或几种组合。
7.根据权利要求6所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的抗凝剂选自EDTA钾盐。
8.根据权利要求1所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的酶抑制剂选自金精三羧酸、氟化钠和D-(+)-甘油醛中的一种或几种组合。
9.根据权利要求8所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的酶抑制剂选自金精三羧酸、氟化钠和D-(+)-甘油醛三者的组合。
10.根据权利要求1所述的一种新型的血浆游离DNA和血细胞保存液，其特征在于：所述的固定剂为PEG20000，含量为0.3～0.6％。
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