CN108823286A - 一种血液游离dna的保护剂及真空采血管 - Google Patents

一种血液游离dna的保护剂及真空采血管 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血液游离DNA的保护剂及真空采血管。本发明血液游离DNA的保护剂为一种组合物，该组合物包括咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸三钾二水合物和甘氨酸。本发明用于血液中游离DNA检测的真空采血管，它包括采血管和与之相匹配的塞子，所述采血管呈真空状态；所述采血管内设有所述的血液游离DNA的保护剂。本发明保护剂能够有效防止细胞中基因组DNA释放到血浆中，保护血浆中游离DNA不被污染；能够在常温条件下使血液中游离DNA稳定储存一周。

Description

一种血液游离DNA的保护剂及真空采血管
技术领域
本发明涉及一种血液游离DNA的保护剂及真空采血管，属于生物检测技术领域。
背景技术
随着二代基因测序技术的快速发展，对于血液中游离DNA的早期筛查已经成为一种重要的检测手段，它可以用于基于基因检测技术的癌症的早期筛查、诊断、监控等领域，也可用于无创伤性产前诊断。虽然健康人体的血浆中只有少量游离DNA，但血液循环中的游离DNA水平的增减与许多临床疾病有关。无创产前诊断是通过对产妇血液中的胎儿游离DNA的检测分析，判断胎儿是否存在整个染色体或者大片段DNA变异等，进而对胎儿遗传疾病做出诊断。但是，孕妇血浆中胎儿游离DNA的含量很少，仅占总游离DNA的5％～7％，血样采集、保存、血浆分离方法不当都会导致母体有核细胞破裂释放出的染色体DNA污染和细胞内高浓度的DNA酶降解，影响分析结果的准确性。
随着液体活检的兴起，众所周知，癌症越早发现越容易治愈，因此液体活检在临床诊断中有着重要的意义。肿瘤细胞在进行分裂增值过程当中，会凋亡、死亡，也会主动向血液中分泌这种已经经历过基因突变的DNA碎片，并且有研究发现血浆DNA与肿瘤细胞DNA具有一致性，这也成为了肿瘤早期诊断中重要的Biomarker。因此如何保存血液，使其最大程度的保持初始状态也成为了人们关注的焦点。
目前市场上已有众多品牌的血液保存管，其主要成分是EDTA或者肝素锂或肝素钠，其主要作用是收集全血，进行血浆分离。仅含有抗凝剂的采血管，对储存和运输条件的要求苛刻，血液样本不易保存，且保存时间有限，不利于边远地区进行采样并且也不能有效抑制RNase酶的活性，从而不能保护血浆中游离DNA的稳定性，导致肿瘤早期筛查或者胎儿的产前筛查和诊断的结果不准确。
发明内容
本发明的目的是提供一种血液游离DNA的保护剂及真空采血管，本发明保护剂能够有效防止细胞中基因组DNA释放到血浆中，保护血浆中游离DNA不被污染；能够在常温条件下使血液中游离DNA稳定储存一周。
本发明提供的一种组合物，它包括防腐剂、乙二胺四乙酸盐和缓冲溶剂；
所述防腐剂选自咪唑烷基脲、双(羟甲基)咪唑烷基脲和重氮咪唑烷基脲中的至少一种；
所述乙二胺四乙酸盐选自乙二胺四乙酸三钾二水合物和/或二水合乙二胺四乙酸二钠；
所述缓冲溶剂选自甘氨酸、Tris-HCl和氯化钠中的至少一种。
本发明所述组合物具体可由所述咪唑烷基脲、所述乙二胺四乙酸三钾二水合物和所述甘氨酸组成。
上述的组合物中，所述防腐剂、所述乙二胺四乙酸盐和所述缓冲溶剂的质量比可为1～9.27：1：0.29～1。
上述的组合物中，所述防腐剂、所述乙二胺四乙酸盐和所述缓冲溶剂的质量比可为4.94～6.17：1：0.46～0.58，具体可为5.20:1:0.48、5.53:1:0.52、5.86:1:0.55、6.17：1：0.58。
本发明中，所述咪唑烷基脲英文名称为Imidazolidinyl urea，简称IDU，起到防腐剂的作用；在本发明保护剂中起到维持细胞稳定，防止细胞破裂释放DNA，从而避免细胞外游离DNA浓度的增加；
所述乙二胺四乙酸三钾二水合物的英文名称为EthylenediaMinetetraaceticacid tripotassium salt dihydrate，简称Tripo-EDTA，它对血液中钙离子有很大的亲和力，能与钙离子络合而使凝血酶原无法转变为凝血酶，从而防止血液发生凝固，与此同时还能够防止游离DNA在体外发生降解；
所述甘氨酸的英文名称为Glycine，简称Gly，在本发明保护剂中作为缓冲剂使用；
Tris-HCl的中文名称为三(羟甲基)氨基甲烷。
本发明所述的组合物应用于制备血液游离DNA的保护剂中。
本发明还提供了一种血液游离DNA的保护剂，它为所述的组合物的溶液。
上述的保护剂中，所述组合物的溶液中，溶剂为无菌水；
所述防腐剂的浓度可为400.14～500mg/mL；
所述乙二胺四乙酸盐的浓度可为76.95～81mg/mL；
所述缓冲溶剂的浓度可为37.28～47mg/mL。
本发明所述血液游离DNA的保护剂由所述防腐剂、所述乙二胺四乙酸盐和所述缓冲溶剂混合溶于溶剂中制得。
本发明所述血液游离DNA的保护剂具体可由质量比为5.20:1:0.48、5.53:1:0.52、5.86:1:0.55、6.17：1：0.58的所述咪唑烷基脲、所述乙二胺四乙酸三钾二水合物和所述甘氨酸溶于溶剂中制成。
上述的保护剂中，所述组合物的溶液中，所述防腐剂的浓度具体可为400.14mg/mL、433.34mg/mL、466.64mg/mL、500mg/mL；
所述乙二胺四乙酸盐的浓度具体可为7695mg/mL、783mg/mL、7965mg/mL、81mg/mL；
所述缓冲溶剂的浓度具体可为37.28mg/mL、40.52mg/mL、43.76mg/mL、47mg/mL。
本发明所述血液游离DNA的保护剂能用于肿瘤早期筛查或胎儿的产前筛查和诊断时采集的血液中游离DNA稳定储存。
本发明进一步提供了一种用于血液中游离DNA检测的真空采血管，它包括采血管和与之相匹配的塞子，所述采血管呈真空状态；所述采血管内设有所述的血液游离DNA的保护剂。
上述的真空采血管中，所述血液游离DNA的保护剂以溶液的形式喷涂于所述采血管内。
上述的真空采血管中，所述血液游离DNA的保护剂溶液的浓度可为0.51437～0.63205g/mL，具体可为0.63205g/mL，溶剂可为无酶水；
每5mL所述采血管的体积内喷涂所述血液游离DNA的保护剂溶液的体积可为400μL～500μL，具体可为每5mL所述采血管的体积内喷涂所述血液游离DNA的保护剂溶液的体积可为500μL。
本发明中，所述的真空采血管的采血管和塞子的材料均为本领域常用的材料，具体地，采血管材质可为PET，即塑料管；塞子可为丁基卤化橡胶塞；采用EFD设备将保护剂均匀喷涂在采血管中。
本发明具有以下优点：
1、本发明所述血液游离DNA的保护剂能防止或者减缓血浆中游离DNA降解；
2、本发明所述血液游离DNA的保护剂能够在常温条件下使血液中游离DNA稳定储存一周；
3、本发明所述用于血液中游离DNA检测的真空采血管能够稳定存储血液中游离DNA。
附图说明
图1为本发明实施例1中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存不同天数后分离血浆对比图。
图2为本发明实施例2中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存不同天数后血浆中游离DNA浓度对比图。
图3为本发明实施例2中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存不同天数后血浆中Y染色体含量变化的对比图。
图4为本发明实施例3中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存不同天数后血浆中游离DNA浓度变化的对比图。
图5为本发明实施例3中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存不同天数后血浆中lambdaDNA含量变化的对比图。
图6为本发明实施例4中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存7天后血浆中胎儿浓度的值。
图7为本发明实施例4中游离DNA保护剂采血管和EDTA采血管储存7天后血浆中Y染色体浓度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、血液游离DNA的保护剂及其应用效果
本发明血液游离DNA的保护剂，由质量比为5.20:1:0.48、5.53:1:0.52、5.86:1:0.55、6.17：1：0.58的咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸三钾二水合物和甘氨酸混合溶于无菌水制得；
调整无菌水的量，可得到咪唑烷基脲的浓度为400.14mg/mL、433.34mg/mL、466.64mg/mL、500mg/mL；
乙二胺四乙酸三钾二水合物的浓度为76.95mg/mL、78.3mg/mL、79.65mg/mL、81mg/mL；
甘氨酸的浓度为37.28mg/mL、40.52mg/mL、43.76mg/mL、47mg/mL。
用于血液中游离DNA检测的真空采血管，它包括PET采血管和与之相匹配的丁基卤化橡胶塞子，采血管呈真空状态；血液游离DNA的保护剂溶液的浓度为0.63205g/mL，溶剂为无酶水；每5mL采血管的体积内喷涂本发明血液游离DNA的保护剂溶液的体积500μL。
实施例2、从血浆颜色上观察，测试本发明保护剂的防溶血效果
用常规抗凝管采血，采血后进行分装，分装16管，每管2mL，其中8管中分别加入200μL本发明实施例1中保护剂，浓度为0.63205g/mL，溶剂为无酶水；另外8管不添加保护剂，均室温(25-28℃)存放，分别放置0天，1天，2天，3天，4天，7天，10天，14天，8个时间点，每个时间点分别取出一管不含保护剂的血和一管加入了本发明实施例1中保护剂的血，分离血浆，观察并拍照记录分离出的血浆的颜色。
结果如图1所示，在8组试验中，加本发明保护剂处理的血浆颜色变化较小，而不加保护剂处理的血浆随着存放时间的延长，颜色也越来越深，出现了严重的溶血现象。这一结果表明本发明保护剂能够有效防止溶血。
实施例3、检测血浆中游离DNA浓度，测试保护剂的防溶血效果
用常规抗凝管采取非妊娠期女性血液，采血后进行分装，分装16管，每管2mL，并且每管血中加入相同量的男性白细胞悬浮液。其中8管中分别加入200μL本发明实施例1中保护剂，浓度为0.63205g/mL，溶剂为无酶水；另外8管不添加保护剂，均室温(25-28℃)存放，分别放置0天，1天，2天，3天，4天，7天，10天，14天，8个时间点，每个时间点分别取出一管不含保护剂的血和一管加入了本发明实施例1中保护剂的血，分离血浆，用磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(TIANGEN，DP710-01)提取游离血浆中的DNA。然后用QUBIT DSDNA HSASSAY KIT SET OF 500(life，Q32854)检测血浆游离DNA的浓度，结果如图2所示。然后以提取的cfDNA为模板，利用SRYF/R Primer引物(如表1所示)进行荧光定量PCR检测血浆游离DNA中SRY的含量，程序为95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 30s，40个循环；40℃30s。其结果如图3所示。
表1SRYF/R Primer引物
SRY FP AGTATCGACCTCGTCGGAAG
SRY RP TCTTGAGTGTGTGGCTTTCG
由图3结果显示：游离血浆DNA浓度在加本发明保护剂处理的条件下随着储存时间的延长基本没有什么变化，而在不加保护剂处理的血浆cfDNA浓度随着储存时间的延长而升高。
同时SRY表达量在加本发明保护剂处理的游离血浆DNA中的相对表达量随着储存时间的延长基本维持稳定，而在不加保护剂处理的游离血浆DNA中的相对表达量随着储存时间的延长明显升高了，这一结果也就说明，男性白细胞在本发明保护剂的作用下基本维持原始状态，基本上没有发生破裂释放DNA到血浆DNA中，因此SRY的表达量维持稳定。而在没有本发明保护剂的作用下男性白细胞可能发生了严重的破裂，导致男性白细胞中的DNA释放到了血浆中，因此其在血浆中SRY的表达量升高。这也就表明，本发明游离血浆DNA保护剂能够很好的保护全血中白细胞的完整性，并且在两周内基本不发生破裂。
实施例4、测试保护剂防止游离DNA降解的效果
用常规抗凝管采血，采血后进行分装，分装16管，每管2mL，并且每管血中加入10ng的标准的打断的lambdaDNA(约150-200bp)。向其中8管分别加入200μL本发明实施例1中保护剂，浓度为0.63205g/mL，溶剂为无酶水；另外8管不添加保护剂，均室温(25-28℃)存放，分别放置0天，1天，2天，3天，4天，7天，10天，14天，8个时间点，每个时间点分别取出一管不含保护剂的血和一管加入了保护剂的血，分离血浆，用磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(TIANGEN，DP710-01)提取游离血浆中的DNA。然后用QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT SET OF500(life，Q32854)检测血浆游离DNA的浓度，结果如图4所示。然后以cfDNA为模板，利用lambdaDNA引物(如表2所示)进行荧光定量PCR检测，程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，60℃30s，40个循环；40℃ 30s。分析其CP值，结果如图3所示。
表2lambdaDNA引物
LambdaDNA-F CGGCGTCAAAAAGAACTTCC
LambdaDNA-R GCATCCTGAATGCAGCCATA
在对血浆中cfDNA(小片段)降解的测试中，荧光定量PCR的结果显示随着储存时间的延长，加本发明保护剂处理和不加本发明保护剂处理的血浆中lambdaDNA的含量变化都不大，CP值几乎在同一水平线上，其相对表达量也比较稳定，没有太大的波动。说明本发明不仅能够抗凝，而且破坏DNaseI的结构，抑制其活性，从而防止了cfDNA的降解。
实施例5、测试保护剂对NGS测序结果的影响
用常规抗凝管采取非妊娠期女性血液，采血后进行分装，分装7管，每管2ml，分为四组，第一组为对照组，取一管血投入1.2ng打断男性基因组DNA；第二组，两管血均投入0.6ng打断的男性基因组DNA；第三组，两管血均投入1.2ng打断的男性基因组DNA；第二组，两管血均投入2.4ng打断的男性基因组DNA。除对照组外，其他三组，每组选取一管血加入200μL本发明实施例1中保护剂，浓度为0.63205g/mL，溶剂为无酶水；另外3管不添加本发明保护剂，均室温(25-28℃)存放，7天后分离血浆，用磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(TIANGEN，DP710-01)提取游离血浆中的DNA。然后用QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT SET OF500(life，Q32854)检测血浆游离DNA的浓度。用KAPA Hyper Prep Kit(KAPA，KK8504)试剂盒进行建库，将文库定量，进行上机测序，分析胎儿浓度和男性Y染色体浓度。结果如图6和图7所示。
从图6的结果中发现，0天处理以及加保护剂处理得到的胎儿浓度数值正常，而不加本发明保护剂处理得到的数值均为负值，数值异常；从图7的分析结果中，发现加本发明保护剂处理的Y染色体浓度符合原始投入打断男性基因组DNA的投入量，即投入量减半时，Y染色体的浓度也减半；投入量加倍，Y染色体的浓度也加倍；而三组数据中，较加本发明保护剂的处理，不加保护剂处理的Y染色体浓度均出现了不同程度的降低，猜测是有其他DNA污染导致的；综上所述，本发明保护剂能够保护血液中基因的稳定性，从而保证了血浆cfDNA建库后的测序结果。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于：它包括防腐剂、乙二胺四乙酸盐和缓冲溶剂；
所述防腐剂选自咪唑烷基脲、双(羟甲基)咪唑烷基脲和重氮咪唑烷基脲中的至少一种；
所述乙二胺四乙酸盐选自乙二胺四乙酸三钾二水合物和/或二水合乙二胺四乙酸二钠；
所述缓冲溶剂选自甘氨酸、Tris-HCl和氯化钠中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述防腐剂、所述乙二胺四乙酸盐和所述缓冲溶剂的质量比为1～9.27：1：0.29～1。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述防腐剂、所述乙二胺四乙酸盐和所述缓冲溶剂的质量比为4.94～6.17：1：0.46～0.58。
4.权利要求1-3中任一项所述的组合物在制备血液游离DNA的保护剂中的应用。
5.一种血液游离DNA的保护剂为权利要求1-3中任一项所述的组合物的溶液。
6.根据权利要求5所述的保护剂，其特征在于：所述组合物的溶液中，溶剂为无菌水；
所述防腐剂的浓度为400.14～500mg/mL；
所述乙二胺四乙酸盐的浓度为76.95～81mg/mL；
所述缓冲溶剂的浓度为37.28～47mg/mL。
7.根据权利要求5所述的保护剂，其特征在于：所述组合物的溶液中，所述防腐剂的浓度为400.14mg/mL、433.34mg/mL、466.64mg/mL、500mg/mL；
所述乙二胺四乙酸盐的浓度为76.95mg/mL、78.3mg/mL、79.65mg/mL、81mg/mL；
所述缓冲溶剂的浓度为37.28mg/mL、40.52mg/mL、43.76mg/mL、47mg/mL。
8.一种用于血液中游离DNA检测的真空采血管，它包括采血管和与之相匹配的塞子，所述采血管呈真空状态；其特征在于：所述采血管内设有权利要求5-7所述的血液游离DNA的保护剂。
9.根据权利8所述的真空采血管，其特征在于：所述血液游离DNA的保护剂以溶液的形式喷涂于所述采血管内。
10.根据权利8或9所述的真空采血管，其特征在于：所述血液游离DNA的保护剂溶液的浓度为0.51437g/ml～0.63205g/mL，溶剂为无酶水；
每5mL所述采血管的体积内喷涂所述血液游离DNA的保护剂溶液的体积为400μL～500μL。
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