CN108431222A - 无细胞dna提取法用于非侵入性产前筛选的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了从液体生物样品进行无细胞DNA提取的方法和系统。所述方法可用于胎儿DNA分数的确定和胎儿非整倍性的非侵入性产前筛选和其他类型的无细胞DNA的分析。
Description
背景技术
常染色体三体性在500例成活的分娩中约发生1例。这些三体性的大多数发生在染色体13、18和21处。性染色体非整倍性在500例成活的分娩中约发生1例。目前的母体血清筛选标记仅检测85-95%的染色体异常,并且具有高达5或6%的假阳性比率。羊膜腔穿刺术和CVS是确定染色体异常的高度准确的方法,但是它们携带流产的程序相关的风险。该风险经常胜过该程序的好处,并且不适合作为常规筛选工具。非侵入性产前测试的目的是在没有与胎儿基因测试的传统方法相关的风险的情况下,提供准确检测胎儿的基因缺陷的筛选工具。
母体血浆中的胎儿核酸的检测和定量是用于产前基因诊断的非侵入性备选方法。有效诊断取决于分离的DNA的数量和质量,其影响测定的敏感度和再现性。
发明内容
本文提供了改善来自液体生物样品的无细胞DNA(cfDNA)分离的数量、质量和一致性的方法。在特定的实施方案中,液体生物样品从妊娠哺乳动物(例如人类患者)获得,用于胎儿非整倍性的非侵入性产前诊断。
在一些实施方案中,提供的方法可用于癌症的诊断。在一些实施方案中,液体生物样品从诊断为具有癌症或怀疑具有癌症的患者获得,用于分离和检测循环肿瘤DNA。在一些实施方案中,测试可应用于一般群体作为筛选测试以预测具有癌症的风险。
在某些实施方案中,本文提供的是用于改善从来自哺乳动物的液体生物样品分离的无细胞DNA(cfDNA)的产率的方法,其包括使用可逆地结合cfDNA的磁性珠粒从样品分离cfDNA,和用于操作磁性珠粒的至少两种类型的磁性分离步骤。例如,在一些实施方案中,cfDNA与磁性珠粒结合,并且cfDNA结合的磁性珠粒从样品管顺序转移到一个或多个容器,例如含有洗涤溶液的容器或含有洗脱溶液的容器。通过使含有洗脱的cfDNA和磁性珠粒的洗脱溶液的容器的外表面与磁性平板接触并收集含有洗脱的cfDNA的洗脱溶液将洗脱的cfDNA从磁性珠粒分离。在一些实施方案中,磁性平板包含环状磁铁,其引起磁性珠粒附着于容器壁,从而可收集含有洗脱的cfDNA的洗脱溶液。
在某些实施方案中,本文提供的是用于从来自哺乳动物的液体生物样品分离无细胞DNA的方法,其包括以下步骤:
a)使含有cfDNA的液体生物样品与多个可逆地结合DNA的磁性珠粒接触;
b)将cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品的未结合组分分离;
c)将所述cfDNA结合的磁性珠粒转移到含有洗脱溶液的容器;
d)通过使含有在所述洗脱溶液中的所述cfDNA和所述磁性珠粒的容器与磁性平板接触和收集含有所述cfDNA的洗脱溶液将所述磁性珠粒从所述洗脱溶液分离。
在一些实施方案中,通过将所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品转移到另一个容器而将所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品的未结合组分分离。在一些实施方案中,所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品直接转移到含有所述洗脱溶液的容器。在一些实施方案中,将从所述液体生物样品转移的所述cfDNA结合的磁性珠粒转移到含有洗涤溶液的容器。
在一些实施方案中,在步骤(b)之后和步骤(c)之前,将cfDNA结合的磁性珠粒转移到洗涤溶液。在一些实施方案中,将cfDNA结合的磁性珠粒磁性转移到洗涤溶液。在一些实施方案中,将cfDNA结合的磁性珠粒顺序转移到两个或更多洗涤溶液。在一些实施方案中,将cfDNA结合的磁性珠粒顺序磁性地转移到两个或更多洗涤溶液。在一些实施方案中,两个或更多洗涤溶液为相同的。在一些实施方案中,两个或更多洗涤溶液包含两个或更多不同的洗涤溶液。
在一些实施方案中,通过将棒状磁铁插入到所述液体生物样品中以磁性地结合所述cfDNA结合的磁性珠粒而将所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品的未结合的组分分离,并且使磁性地结合的珠粒沉积在另一个容器中。在一些实施方案中,该容器含有洗涤溶液。在一些实施方案中,该容器含有洗脱溶液。
在一些实施方案中,通过将棒状磁铁插入到所述液体生物样品中以磁性地结合所述cfDNA结合的磁性珠粒而将所述cfDNA结合的磁性珠粒转移到洗涤溶液,并且使磁性地结合的珠粒沉积在含有洗涤溶液的容器中。
在一些实施方案中,通过将棒状磁铁插入到含有cfDNA结合的磁性珠粒的乙醇洗涤溶液中而在步骤(c)中将cfDNA结合的磁性珠粒转移到洗脱溶液,并使磁性地结合的珠粒沉积在含有洗脱溶液的容器中。在一些实施方案中,洗涤的cfDNA结合的磁性珠粒在洗脱溶液中温育足够的时间以将cfDNA从磁性珠粒洗脱。合适的洗脱溶液使结合的cfDNA从磁性珠粒释放。示例性的洗脱溶液包括水或缓冲溶液,诸如Tris缓冲液(例如,10mM Tris,pH 7.0-8.0)或TRIS-EDTA缓冲液。
在一些实施方案中,棒状磁铁被尖端覆盖物包围,从而磁铁没有直接接触液体生物样品、洗涤溶液或洗脱溶液。
在一些实施方案中,磁性珠粒从一个容器到另一个容器的转移为自动的。
在一些实施方案中,磁性珠粒的表面包含可逆地结合DNA的一个或多个官能团。在一些实施方案中,磁性珠粒包含磁性金属氧化物和聚合物。在一些实施方案中,磁性金属氧化物为铁、钴或镍的氧化物或它们的组合。在一些实施方案中,聚合物为交联的聚苯乙烯。在一些实施方案中,磁性珠粒的表面包被有含硅包衣。在一些实施方案中,磁性珠粒包含聚合物核、包含覆盖聚合物的磁性金属氧化物的磁性层和覆盖磁性层的含硅外层。
在一些实施方案中,磁性珠粒为直径均一的。在一些实施方案中,磁性珠粒为直径不均一的。在一些实施方案中,磁性珠粒的直径约为1μm。
在一些实施方案中,将磁性珠粒温育足够的时间来结合液体生物样品中的cfDNA以生成cfDNA结合的磁性珠粒。
在一些实施方案中,磁性平板含有环状磁铁。
在一些实施方案中,液体生物样品为血浆样品。在一些实施方案中,通过从血液样品去除细胞制备液体生物样品。
在一些实施方案中,液体生物样品从人类受试者获得。
在一些实施方案中,液体生物样品从妊娠雌性获得。
在一些实施方案中,液体生物样品的体积为0.5-2mL。
在一些实施方案中,洗脱溶液的体积小于200μl。在一些实施方案中,洗脱溶液的体积小于或约为150μl、小于或约为100μl、小于或约为90μl、小于或约为80μl、小于或约为70μl、小于或约为60μl、小于或约为50μl或者小于或约为40μl。
在一些实施方案中,步骤(a)在多孔板中进行。在一些实施方案中,洗涤和洗脱步骤在相同大小的多孔板中进行。在一些实施方案中,所述多孔板为24孔深孔板。
在一些实施方案中,含有cfDNA的至少两个重复液体生物样品与多个磁性珠粒接触。在一些实施方案中,在步骤(a)后汇集每个重复样品中的所述cfDNA结合的磁性珠粒。
在一些实施方案中,两个或更多洗涤溶液的至少一个为乙醇洗涤溶液。在一些实施方案中,通过将棒状磁铁插入到洗涤溶液中以磁性地结合cfDNA结合的磁性珠粒而将cfDNA结合的磁性珠粒转移到乙醇洗涤溶液,并使磁性地结合的珠粒沉积在含有乙醇洗涤溶液的容器中。在一些实施方案中,所述方法进一步包括将洗涤的cfDNA结合的磁性珠粒转移到含有第二乙醇洗涤溶液的容器。
在一些实施方案中,洗涤的cfDNA结合的磁性珠粒在洗脱溶液中温育约1至约10分钟。在一些实施方案中,洗涤的cfDNA结合的磁性珠粒在洗脱溶液中温育至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟或至少10分钟。在一些实施方案中,将热施加到磁性珠粒以洗脱cfDNA。
具体实施方案
某些术语
为了促进本公开的理解,一些术语和短语在以下定义。
除非另有说明,如本文所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”也包括复数形式。因此,例如,提及“寡核苷酸”包括多个寡核苷酸分子,提及“标签”是提及一个或多个标签,提及“探针”是提及一个或多个探针,和提及“核酸”是提及一个或多个多核苷酸。
除非另有说明,当提及数值时,如本文所使用的术语“约”意指加上或减去列举值的10%。
如本文所使用的,“携带者(carrier)”或“遗传携带者”是具有参与特定基因型的表达的遗传决定因子的等位基因的至少一个拷贝的个体。
如本文所使用的术语“扩增(amplification)”或“扩增(amplify)”包括用于拷贝靶核酸的方法,由此增加选择的核酸序列的拷贝数。扩增可以是指数的或线性的。靶核酸可以是DNA或RNA。以该方式扩增的序列形成“扩增产物”,也称为“扩增子”。虽然以下描述的示例性方法与使用聚合酶链反应(PCR)的扩增相关,但是许多其他方法是本领域中已知的,用于核酸的扩增(例如,等温法、滚环法等)。技术人员理解的是这些其他方法可代替PCR方法使用,或与PCR方法一起使用。见例如,Saiki,“Amplification of Genomic DNA”in PCRProtocols,Innis et al.,Eds.,Academic Press,San Diego,CA 1990,pp.13-20;Wharamet al.,Nucleic Acids Res.,29(11):E54-E54,2001;Hafner et al.,Biotechniques,30(4):852-56,858,860,2001;Zhong et al.,Biotechniques,30(4):852-6,858,860,2001。
如本文所使用的术语“检测”指观察来自可检测标记的信号以指示靶标的存在。更具体地,检测用于检测具体序列的上下文中。
如本文关于多核苷酸(即核苷酸的序列,诸如寡核苷酸或基因组核酸)所使用的术语“互补”、“互补的”或“互补性”与碱基配对法则相关。如本文所使用的核酸序列的补体指寡核苷酸,其当与核酸序列对齐从而一个序列的5′端与另一个的3′端配对时呈“反向平行结合”。例如,对于序列5′-A-G-T-3′是与序列3′-T-C-A-5′互补的。在天然核酸中一般没有发现的某些碱基可包括在本公开的核酸中,并包括例如肌苷(inosine)和7-去氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)。互补性不需要是完美的;稳定的双螺旋可含有错配的碱基对或未匹配的碱基。考虑到一些可变因素,其包括例如寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基成分和序列、错配的碱基对的离子强度和发生率,核酸技术领域的技术人员可凭经验确定双螺旋稳定性。互补性可以是“部分的”,其中,仅一些核酸碱基根据碱基配对法则匹配。或者,可以是核酸之间的“完全的”、“全部的”或“完整的”互补性。
如本文所使用的术语“可检测标记”指分子或化合物或分子的组或化合物的组,其与探针关联并且用来鉴定与基因组核酸或参考核酸杂交的探针。
多核苷酸的上下文中的“片段”指核苷酸残基的序列,双链的或单链的,其为至少约2个核苷酸、至少约5个核苷酸、至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约100个核苷酸。
术语“同一性”或“相同的”指序列之间的同一性的程度。可以有部分同一性或完全同一性。部分相同的序列是与另一个序列小于100%相同的序列。部分相同的序列可具有至少70%或至少75%、至少80%或至少85%或者至少90%或至少95%的全部同一性。
如本文所使用的术语“分离的”、“纯化的”或“基本纯化的”指将分子诸如核酸从它们的天然环境中移出,经分离或分开,并且至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%不含与它们天然联合的其他组分。分离的分子因此是基本纯化的分子。
如本文所使用的术语“文库”指核酸序列的集合(collection),例如,源自整个基因组、亚基因组片段、cDNA、cDNA片段、RNA、RNA片段或它们的组合的核酸的集合。在一个实施方案中,部分或所有的文库核酸序列包含衔接子序列。衔接子序列可位于一端或两端。衔接子序列可用于,例如测序方法(例如NGS方法)、扩增、逆转录或克隆到载体中。
文库可包含核酸序列例如靶核酸序列(例如,肿瘤核酸序列)、参考核酸序列或它们的组合的集合。在一些实施方案中,文库的核酸序列源自单个受试者。在其他实施方案中,文库可包含来自多于一个受试者(例如2、3、4、5、6、、7、8、9、10、20、30或更多受试者)的核酸序列。在一些实施方案中,来自不同受试者的两个或更多文库可以组合以形成具有来自多于一个受试者的核酸序列的文库。在一个实施方案中,受试者为具有癌症或肿瘤,或处于具有癌症或肿瘤的风险的人类。
“文库核酸序列”指作为文库的成员的核酸分子,例如DNA、RNA或它们的组合。一般地,文库核酸序列为DNA分子,例如基因组DNA或cDNA。在一些实施方案中,文库核酸序列是片段化的,例如剪切的或酶促制备的基因组DNA。在某些实施方案中,文库核酸序列包含来自受试者的序列和不来自受试者的序列,例如衔接子序列、引物序列或允许识别的其他序列例如“条形码”序列。
如本文所使用的术语“多重PCR”指两个或更多靶核酸的扩增,其中各自使用不同引物对启动。
如本文所使用的“下一代测序或NGS”指任何测序方法,其以高通量平行方式(例如同时测序大于103、104、105或更多分子)确定单个核酸分子的核苷酸序列(例如在单个分子测序中)或单个核酸分子的克隆扩大代表(proxies)。在一个实施方案中,可通过计数藉由测序实验生成的数据中发生其同源(cognate)序列的的相对数量估计文库中的核酸种类的相对丰度。下一代测序方法是本领域中已知的,并且例如在Metzker,M.NatureBiotechnology Reviews 11:31-46(2010)中描述。
如本文所使用的术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”指由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或它们的组合组成的短聚合物。寡核苷酸的长度通常为约10、11、12、13、14、15、20、25或30~约150个核苷酸(nt),更优选地为约10、11、12、13、14、15、20、25或30~约70nt。
如本文所使用的“引物”为寡核苷酸,其与靶核苷酸序列是互补的,并且在DNA或RNA聚合酶的存在下引起核苷酸添加到引物的3′端。引物的3′端通常应该与最佳延伸和/或扩增的相应核苷酸位置处的靶序列相同。术语“引物”包括引物的所有形式,其可以是合成的,包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物、标记的引物等。如本文所使用的“正向引物”为与DNA的反义链互补的引物。“反向引物”与DNA的有义链是互补的。
对于靶核酸特异性的寡核苷酸(例如探针或引物)会在合适条件下与靶核酸“杂交”。如本文所使用的“杂交(hybridization或hybridizing)”指在限定的杂交条件下通过碱基配对使寡核苷酸单链与互补链一起退火的过程。它是两个互补多核苷酸之间的特异性的(即非随机的)相互作用。杂交和杂交的强度(即核酸之间的结合的强度)受诸如核酸之间的互补的程度、涉及的条件的严格性和形成的杂交物的Tm的因素影响。
“特异性杂交”是两个核酸序列共有高度互补性的指示。特异性杂交复合物在许可的退火条件下形成并且在任何随后的洗涤步骤之后保持杂交。核酸序列的退火的许可条件通常可由本领域的普通技术人员确定,并且可例如在65℃在约6×SSC的存在下发生。部分地,杂交的严格性可部分根据进行洗涤步骤的温度表达。这样的温度通常选择为比在限定的离子强度和pH下的特异性序列的热解链点(Tm)低约5℃至20℃。Tm是靶序列的50%与完美匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和Tm下)。计算Tm的等式和核酸杂交的条件是本领域中已知的。
如本文所使用的,如果它能够与感兴趣的靶标杂交并且基本上不与不感兴趣的核酸杂交,则寡核苷酸对于核酸是“特异性的”。高水平的序列同一性是优选的,并且包括至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性。序列同一性可使用具有采用本领域公知的算法的默认设置的可商购的计算机程序(例如BLAST)确定。
术语“感兴趣的区域”指被测序的核酸的区域。
如本文所使用的术语“受试者”指哺乳动物,诸如人类,但还可以是另外的动物,诸如家养动物(例如狗、猫等)、家畜(例如牛、羊、猪、马等)或实验室动物(例如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。
概述
母体血浆中的胎儿核酸的检测和定量是产前遗传诊断的非侵入性备选方法。有效的诊断取决于分离的DNA的数量和质量,其影响了测定的敏感性和再现性。本文所描述的是用于改善从液体生物样品中分离的无细胞核酸(例如,无细胞,cfDNA)的数量和质量的方法。本文所提供的方法还减少分离的cfDNA的样品间差异(即改善cfDNA提取过程的一致性)。本文所提供的方法改善了胎儿分数确定分析和胎儿非整倍体的检测的准确性。本文所提供的方法还可应用于其他形式的无细胞DNA(包括循环肿瘤DNA)的分离和分析。
无细胞核酸可从任何类型的合适的液体生物样本或样品(例如测试样品)中分离。样品或测试样品可为从受试者或其部分(例如人类受试者、妊娠雌性、胎儿)分离或获得的任何样本。样本的非限制性实例包括来自受试者的液体,其包括但不限于,血液或血液产物(例如血清、血浆等)、脐带血、羊膜液、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节镜)、雌性生殖道的洗出液、尿液、粪便、痰液、唾液、鼻腔粘液、前列腺液、灌洗液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳液等,或它们的组合。在一些实施方案中,液体生物样品是血液血浆或血液血清样品。如本文所使用的术语“血液”指来自妊娠妇女或接受可能妊娠的测试的妇女的血液样品或制备物。该术语涵盖了全血、血液产物或血液的任何级分,诸如血清、血浆、血沉棕黄层等,如常规定义的。血液或其级分经常包含核小体(例如母体和/或胎儿的核小体)。核小体包含核酸并且有时是无细胞或细胞内的。血液还包含血沉棕黄层。有时通过利用聚蔗糖梯度分离血沉棕黄层。血沉棕黄层可包含白细胞(white blood cell)(例如白细胞(leukocyte)、T细胞、B细胞、血小板等)。在某些实施方案中,血沉棕黄层包含母体和或胎儿的核酸。血液血浆指由离心用抗凝血剂处理的血液得到的全血的级分。血液血清指血液样品凝结后剩余的液体的含水部分。液体样品经常根据医院或门诊通常遵循的标准方案收集。对于血液,经常收集适合量的外周血液(例如3-40毫升),并在制备之前或之后根据标准程序储存。来自提取了核酸的液体样品可以是非细胞的(例如无细胞)。在一些实施方案中,液体或组织样品可含有细胞元件或细胞残余物。在一些实施方案中,在核酸提取之前,将细胞元件或细胞残余物从液体样品中去除。
样品经常是异质的,这意味着超过一种的核酸种类存在于样品中。例如,异质核酸可包括但不限于,(i)胎儿来源和母体来源的核酸,(ii)癌症或非癌症核酸,(ii)病原体或宿主核酸,或(iv)突变和野生型的核酸。
对于本文所述的技术的产前应用,液体样品可从处于适合于测试的孕龄的雌性,或从接受可能妊娠的测试的雌性中收集。合适的孕龄可根据进行的产前测试改变。在某些实施方案中,妊娠雌性受试者有时在妊娠头三月、妊娠中三月或有时在妊娠末三月。在某些实施方案中,液体样品从约1~约45周的胎儿妊娠(fetal gestation)(例如在1-4、4-8、8-12、12-16、16-20、20-24、24-28、28-32、32-36、36-40或40-44周的胎儿妊娠),或约5~约28周的胎儿妊娠(例如在6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27周的胎儿妊娠)的妊娠雌性中收集。在某些实施方案中,液体样品从分娩(例如,阴道或非阴道分娩(例如手术分娩))过程中或刚分娩后(例如0-72小时后)的妊娠雌性中收集。
从母体血液制备血清或血浆的方法是已知的。例如,可将妊娠妇女的血液置于含有EDTA的管中或专门的商业产品诸如Streck BCT收集管(Streck),其稳定白细胞,防止基因组DNA的释放,允许高质量无细胞DNA的分离,然后可通过离心从全血中获得血浆。血清可在有或没有血液凝固后离心的情况下获得。如果使用离心,那么它通常,但非排他地,以适当速度例如1,500-3,000倍g进行。在被转移到用于cfDNA提取的新的试管之前,血浆或血清可经受另外的离心步骤。
在某些实施方案中,本文所述的方法可应用于无细胞DNA的分离用于检测循环肿瘤DNA。因此,在一些实施方案中,受试者为被诊断为具有癌症或被怀疑具有癌症的受试者。
提取无细胞DNA的方法
本文所述的方法产生高质量和高产率cfDNA样品,并减小提取的cfDNA的样品间差异。
在该方法的第一步中,含有cfDNA的液体生物样品与多个磁性固相颗粒,例如具有包含可逆地结合DNA的一个或多个官能团的表面的磁性珠粒接触。在一些实施方案中,磁性珠粒包被有基于硅的包衣。在一些实施方案中,磁性珠粒包被有具有可逆地结合DNA的官能团的化合物。
任何结合DNA并具有足够表面积以容许有效结合的固体表面可用于本发明的方法。微粒、纤维、珠粒和支持体含有合适的表面。一般地,磁性珠粒用于本发明的方法。在一些实施方案中,用于本发明方法的磁性微粒包含磁性金属氧化物核,其由吸附地或共价地结合的硅烷包衣包围,其中可通过选择的偶联化学共价地结合多种生物亲和性吸附剂,由此微粒的表面包被有官能团。在一些实施方案中,磁性珠粒包含聚合物。在一些实施方案中,聚合物是交联的聚苯乙烯。在一些实施方案中,磁性珠粒的表面包被有含硅包衣。在一些实施方案中,磁性珠粒包含聚合物核,包含覆盖聚合物的磁性金属氧化物的磁性层,和覆盖磁性层的含硅外层。在一些实施方案中,磁性珠粒的大小是均一的。在一些实施方案中,磁性珠粒的直径约为1μm。
在一些实施方案中,磁性金属氧化物为氧化铁。在一些实施方案中,氧化铁为Fe2+和Fe3+的混合物。Fe2+/Fe3+比例可从约0.5:1改为约4:1,诸如,例如2:1。用于包被微粒表面的合适的氨基硅烷,包括但不限于,对氨基丙基三甲氧基硅烷、N-2-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、三氨基官能硅烷(H2NCH2--NH--CH2CH2--NH--CH2--Si--(OCH3)3)、正十二烷基三乙氧基硅烷和正己基三甲氧基硅烷。制备这些微粒的方法在美国专利号4,628,037、4,554,088、4,672,040、4,695,393和4,698,302中描述,它们的教导通过提及以其整体由此并入本申请。这些专利公开了其他氨基硅烷,其适合于包被氧化铁核或层,并且其可用于本发明的方法。
在一些实施方案中,液体生物样品的体积约为0.5-2mL。在一些实施方案中,在样品与磁性固相颗粒接触之前、之后或同时,将合适的结合缓冲液添加到液体生物样品中。在一些实施方案中,结合缓冲液含有有效地使无细胞DNA从任何相关组蛋白释放的离液盐和洗涤剂的组合。其实例包括但不限于,(异)硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、(异)硫氰酸钠酯、尿素或它们的组合。在特定的实施方案中,离液盐为(异)硫氰酸胍。
将液体生物样品和磁性固相颗粒温育足够的时间来结合液体生物样品中的cfDNA以生成cfDNA结合的磁性固相颗粒。通过将磁性颗粒转移到含有合适洗涤溶液的容器将cfDNA结合的磁性固相颗粒从液体样品的未结合组分分离。洗涤缓冲溶液必须具有足够高的盐浓度(即具有足够高的离子强度),即结合磁性微粒的DNA没有从微粒洗脱,而是仍然结合微粒。合适的盐浓度高于约1.0M,并且优选为约5.0M。选择缓冲溶液,从而溶解结合DNA或微粒的杂质。缓冲溶液的pH和溶质成分以及浓度可根据预期存在的杂质的类型改变。合适的洗涤溶液包括以下:含离液胍盐的洗涤缓冲液,0.5×5SSC;100mM硫酸铵,400mM Tris pH9,25mM MgCl2和1%胎牛血清白蛋白(BSA);和5M NaCl。磁性微粒与结合的DNA还可用超过一种洗涤缓冲溶液洗涤。磁性微粒可按要求的频率洗涤以去除预期的杂质。然而,洗涤的次数优选限制到2或3次,从而将结合的DNA的产率损失最小化。
在一些实施方案中,通过将磁性颗粒转移到含有洗涤溶液用于每次另外的洗涤的另外的容器来进行两个或更多洗涤步骤。然后将洗涤的cfDNA结合的磁性固相颗粒从洗涤溶液转移到含有乙醇洗涤溶液的容器中。在一些实施方案,乙醇洗涤溶液为70%、75%、80%、85%或90%乙醇溶液。在一些实施方案中,通过将磁性颗粒转移到含有乙醇洗涤溶液用于每次另外的乙醇洗涤的另外的容器来进行两个或更多乙醇洗涤步骤。然后将乙醇洗涤的cfDNA结合的磁性颗粒转移到含有洗脱溶液的容器。合适的洗脱溶液使结合的cfDNA从磁性珠粒释放。示例性的洗脱溶液包括水或缓冲溶液,诸如Tris缓冲液(例如,10mM Tris,pH7.0-8.0)或TRIS-EDTA缓冲液。
在一些实施方案中,通过将垂直的棒状磁铁顺序插入到含有cfDNA结合的磁性固相颗粒的液体样品中以磁性地结合颗粒将cfDNA结合的磁性固相颗粒转移到含有多种洗涤溶液和洗脱溶液的容器中,并且使磁性地结合的固相颗粒沉积在含有洗涤或洗脱溶液的下一个容器中。用于本发明的示例性垂直的棒状磁铁在美国专利6,447,729中描述。一般地,棒状磁铁用对生物分子具有低/无结合亲和力的塑料尖端(例如聚丙烯)防护。在一些实施方案中,该尖端匹配多孔板的形状(例如,与24深孔板一起使用的24孔磁铁尖梳,Kingfisher)。这容许磁铁从尖端收回,将尖端留在孔中,这允许磁性颗粒在低搅拌的情况下释放到接收溶液。一旦释放了磁性颗粒,那么塑料尖端可从孔中移除。或者,在混合过程中,塑料尖端可保留在孔中。为了将磁性颗粒转移到随后的容器中,重新运用棒的磁性。
通过将含有在洗脱溶液中的磁性珠粒的容器转移到磁性平板,例如含有环状磁铁的磁性平板并去除含有cfDNA的洗脱溶液,完成从含有洗脱的cfDNA的洗脱溶液分离磁性固相颗粒。然后从该容器去除含有cfDNA的洗脱溶液,留下磁性固相颗粒。在一些实施方案中,将热施加到磁性固相颗粒以洗脱cfDNA。
在一些实施方案中,洗脱溶液的体积小于200μl。在一些实施方案中,洗脱溶液的体积小于或约为150μl、小于或约为100μl、小于或约为90μl、小于或约为80μl、小于或约为70μl、小于或约为60μl、小于或约为50μl或者小于或约为40μl。在一些实施方案中,洗脱溶液的体积约为70μl。
在一些实施方案中,cfDNA提取方法使用多孔板进行。在一些实施方案中,多孔板为深孔板。在一些实施方案中,多孔板为24孔深孔板。
本发明的方法的一个优势是液体生物样品的多个等分试样可与磁性固相颗粒接触,并且来自每个结合反应的cfDNA结合的磁性固相颗粒可在洗涤之前组合。例如,在使所有的cfDNA结合的颗粒沉积到第一洗涤溶液中之前,垂直的棒状磁铁可用于收集来自每个结合反应的cfDNA结合的磁性固相颗粒。因此,在一些实施方案中,使含有cfDNA的至少两个重复液体生物样品与多个磁性颗粒接触。在一些实施方案中,使含有cfDNA的至少两个或更多重复液体生物样品与多个磁性珠粒接触。这样的方法改善了分离步骤的功效和提取的cfDNA的产率。该方法不同于以前的方法,其中将液体生物样品的等分试样分别处理或顺序应用于磁性固相颗粒用于结合。本发明的方法允许样品的同时结合和汇集。
本发明的方法的另一个优势是由于将磁性平板应用于含有磁性固相颗粒的洗脱溶液从而将磁性颗粒从洗脱的cfDNA分离的步骤,改善了最终产率并且可以使用较低洗脱体积。在将垂直的棒状磁铁用于DNA提取的先前的方法中,垂直的棒状磁铁用于将磁性固体颗粒转移到洗涤溶液以及在最终洗脱步骤将磁性固体颗粒从洗脱溶液去除(见例如,Flex System(Thermo Scientific))。为了从这样的系统实现可接受的一致的产率,需要更高洗脱体积(500μl),尤其是当使用深孔多孔板(例如24孔深孔板)时(见www.thermo.com/kingfisher)。较低洗脱体积导致不可回收或未充分洗脱的DNA。较低洗脱体积需要的是降低尖端高度以接触洗脱溶液,这导致混合过程中随机的珠粒击穿平板。在本文中发现,在去除珠粒后,该方法导致至少5-10%的具有不可回收或未充分洗脱的DNA的孔。相反,当使用低洗脱体积(例如小于200μl)时,使用平板磁铁用于洗脱步骤的本发明的方法产生高产率和高质量的cfDNA,其具有低的样品间可变性。较低体积的洗脱减小对浓缩样品用于下游文库制备步骤和/或直接测序步骤的需要。
在一些实施方案中,DNA提取步骤是自动的。例如,机器人手臂用于将磁性珠粒从一个容器转移到另一个容器。在一些实例中,装配有垂直的棒状磁铁的仪器,诸如KingFisherTM Flex磁性颗粒处理器(Thermo Scientific,Waltham,MA)用于从液体生物样品收集cfDNA结合的磁性颗粒,并且使珠粒沉积在洗涤溶液或洗脱溶液中。
文库生成和测序
在一些实施方案中,提取的cfDNA用于制备扩增的文库用于高通量测序。一般地,cfDNA不需要断裂。在一些实施方案中,cfDNA大小的范围为约150bp至200bp。在一些实施方案中,cfDNA的平均大小为约170bp至约175bp。
在示例性的方法中,无细胞DNA首先被平端化和5’-磷酸化,从而cfDNA片段可与衔接子连接。该过程可用可商购的试剂盒进行,诸如NEB Quick Blunting或NEBNextEnd Prep。
然后可将制备的cfDNA与核酸衔接子连接,这容许核酸扩增、靶标标记和/或测序。在一些实施方案中,第一衔接子连接在制备的cfDNA片段的5′端和/或3′端。在特定的实施方案中,第一衔接子为包含部分互补地两个寡核苷酸的Y形衔接子。这样的衔接子容许差示标记。
在一些实施方案中,“正向”Y形衔接子序列由以下序列组成或包含以下序列:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T(SEQ ID NO:1),或与SEQ ID NO:1 90%、95%、97%、98%或99%相同的序列,且“反向”Y形衔接子序列由以下序列组成或包含以下序列:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA*C(SEQ ID NO:2),或与SEQ ID NO:2 90%、95%、97%、98%或99%相同的序列。“正向”序列中的C*T和“反向”序列中的A*C是硫代磷酸酯键。下划线的序列在每个寡核苷酸中表示互补核苷酸序列。Y形衔接子端部的颈部(即双链部分)具有T悬垂,这容许用平端/TA连接酶(NEB)与cfDNA片段连接。可使用可商购的试剂盒例如XP PCR纯化珠粒(Beckman Coulter,#A63881)根据制造商的方案纯化衔接子连接反应以去除未连接的衔接子和其他杂质。
在一些实施方案中,然后使用扩增引物对扩增衔接子连接的产物,其中引物对的一个扩增引物是通用引物,并且引物对的另一个引物是条形码化的反向引物。通用引物和/或条形码化的引物可提供用于测序的启动位点。该序列可允许片段与流动池(flow cell)结合用于进行高通量、大规模平行测序,如本文所述。
在一些情况下,来自单个样品来源的扩增子包含相同索引序列(还称为索引标签,“条形码”或多重标识符(MID))。在一些情况下,索引的扩增子使用含有索引序列的引物(例如,正向引物和/或反向引物)生成。可在文库制备过程中包括这样的索引的引物作为“加条形码”工具,以鉴定起源于特定样品来源的特定扩增子。单独定量来自多于一个样品来源的索引的扩增子,然后在测序之前汇集。因此,索引序列的使用容许每次测序运行汇集多个样品(即来自多于一个样品来源的样品),并且样品来源基于索引序列随后可确定。
示例性通用正向引物和条形码化的反向引物容许包括以下引物:
P5通用:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQID NO:3)
MID引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:4),其中,“NNNNNNNNNN”表示分子条形码序列。
任何衔接子序列可包括在用于本发明的引物中。
在一些实施方案中,所有正向扩增子(即,从与靶区段的反义链杂交的正向引物延伸的扩增子)含有相同衔接子序列。在一些实施方案中,当进行双链序列测序时,所有正向扩增子含有相同衔接子序列,并且所有反向扩增子(即,从与靶区段的有义链杂交的反向引物延伸的扩增子)含有不同于正向扩增子的衔接子序列的衔接子序列。
其他衔接子序列是本领域中已知的。一些制造商推荐特定的衔接子序列以与特定测序技术和他们提供的机器一起使用。
在一些实施方案中,当衔接子连接的和/或索引的引物用来扩增cfDNA片段时,衔接子序列和/或索引序列在扩增过程中并入扩增子(沿着靶特异性引物序列)。索引标签的存在容许来自多个样品来源的序列的差异。
在一些实施方案中,在高通量测序前,汇集来自多于一个样品来源的扩增子。“多路化(multiplexing)”是将多个衔接子标签的和索引的文库汇集到单个测序运行中。当使用索引的引物组时,该能力可用于比较研究。在一些实施方案中,在测序前,汇集来自高达48独立来源的扩增子文库。
高通量、大规模平行测序指可平行生成克隆扩增分子和单核酸分子的多个测序反应的测序方法。这允许增加的通量和数据的产生。这些方法也是本领域已知的下一代测序(NGS)方法。NGS方法包括,例如使用可逆染料终止子的合成法测序(sequencing-by-synthesis),以及连接法测序(sequencing-by-ligation)。
在一些实施方案中,高通量、大规模平行测序采用使用可逆染料终止子的合成法测序。在其他实施方案中,经由连接法测序进行测序。在还另外的实施方案中,测序是单分子测序。
通常使用的NGS平台的非限制性实例包括Apollo 324TM NGS Library PrepSystem(IntengenX,Pleasanton,United States)、Ion TorrentTM(Life Technologies,Carlsbad,CA)、miRNA BeadArray(Illumina,Inc.)、Roche 454TM GS FLXTM-Titanium(Roche Molecular Diagnostics,Germany)和ABI SOLiDTM System(Applied Biosystems,Foster City,CA)。在产生衔接子标签和任选地索引的扩增子文库之后,扩增子使用高通量、大规模平行测序来测序。
无细胞胎儿分数的确定
确定雄性胎儿中的胎儿分数是相对简单的,因为存在Y染色体的量,以及观察到的相对于雌性胎儿样品的归一化X染色体读段计数缺陷的数值可以用于直接计算胎儿分数。确定是否存在来自雌性胎儿的胎儿DNA更困难。确定是否存在雌性胎儿DNA需要分析常染色体以确定其存在。常染色体中的特定基因座显示具有胎儿起源的cfDNA增加。在这些基因座处富集的程度可用来确定雌性胎儿DNA的存在。
可分析通过在cfDNA片段文库上进行的NGS方法生成的测序数据以确定无细胞胎儿分数,这区分了归因于胎儿DNA相对于母体DNA的cfDNA的部分。用于确定胎儿分数的示例性方法包括测量胎儿特异性基因、母体特异性基因和/或雄性特异性基因的相对水平。一旦确定了无细胞胎儿分数,就可以估计特定非整倍性的存在。用于确定来自NGS数据的非整倍性的示例性方法例如在US2015/0005176中描述。测序的读段使用短读段比对器(aligner)与参考人类基因组比对。基于与一组基线样品比较,如果映射到每个染色体的读段的数量不同于其预期,则称为非整倍性。一般方法通常称为读段深度策略(read depthstrategy)。在cfDNA测试中,在整倍体和三体妊娠中比较产生自特定染色体的特定cfDNA片段的计数,并将结果表示为Z-分数。来自整倍体和三体妊娠的Z-分数的分布之间的间隔随测序的更深水平和增加胎儿分数而增加。如本文提供的实施例所示,根据提供的方法进行cfDNA提取导致更高胎儿分数,并且因此,导致Z分数更高以供准确和灵敏预测胎儿非整倍体。
实施例
实施例1NIPT循环无细胞DNA提取
来自预期雌性的全血含有母体无细胞DNA(cfDNA)和胎儿cfDNA。全血从预期母体收集在特定血液收集管中,该收集管防止母体细胞裂解并将它们的DNA释放到血浆中。保存母体细胞并防止它们的DNA进入血浆防止了胎儿cfDNA与母体DNA的比例降到可能不能检测出胎儿cfDNA的点。当血液通过实验室获得时,将其离心以分离血浆、血沉棕黄层和红细胞部分。然后从全血的血浆部分提取cfDNA(母体和胎儿)。
进行本文所述的方法以通过使用在样品中结合DNA的磁性珠粒(例如DynabeadsMyOne Silane)从母体血浆样品分离循环cfDNA。提取的DNA用于下游测序应用,例如以用于特定染色体异常的检测的测试。
MyOneTM SILANE是均一的单一尺寸的铁磁性珠粒,直径为1μm。珠粒由高度交联的聚苯乙烯与均匀分布的磁性材料组成。珠粒被进一步包被,将氧化铁封入珠粒内部并且珠粒表面呈现具有优化的二氧化硅样化学。这些珠粒的增加的磁性强度确保快速磁性移动性和核酸(DNA/RNA)的有效分离。珠粒还具有低沉降速率和有利的反应动力学的特征,使得它们特别适合于自动测定(见Product Description forMyOneTM SILANE,Life Technologies)。
每个母体血液样品收集在两个Streck BCT收集管中并保存在环境温度长达4天。然后通过自旋样品两次分离血浆。在Hamilton Microlab STAR液体处理器(HamiltonCompany,Reno,NV)上首先制备试剂和血浆样品平板。然后将制备的平板加上一个梳型平板加载在KingFisherTM Flex磁性颗粒处理器(具有24个深孔头)(Thermo Scientific,Waltham,MA)上用于DNA提取。循环DNA在室温用离液盐和洗涤剂的独特组合从组蛋白包裹有效地释放。
游离dsDNA结合Silane磁性珠粒,然后在具有插入到梳子的中心的磁棒的梳子上收集DNA结合的珠粒。在几次洗涤后,洗去了非特异性结合蛋白。Silane珠粒从梳子释放,并且将dsDNA在DNA洗脱缓冲液中洗脱。最终,将仍然在洗脱缓冲液中含有磁性珠粒的KingFisherTM DNA洗脱平板转移到Hamilton Microlab Starlet上含有环状磁铁的磁性平板,这将洗脱的DNA溶液转移到DNA收集平板中,然后将其储存在-20℃直到使用。DNA提取方案的详细说明如下。
方案
将来自患者的全血样品(约20mL)收集在Streck BCT收集管(Streck,Ct#218962,每个管约10mL,每个患者两个管)中。样品在环境温度(18-26℃)运输到处理实验室。为了最佳结果,样品在从患者收集的4天之内接收到实验室。
Streck管在22℃在圆底桶型适配器中以2,500×g(RCF)离心10分钟。在完成离心后,将Streck管转移到安全通风橱而不扰动血沉棕黄层。血浆从每个管收集而不接触血沉棕黄层。将来自每个患者各自的两个Streck管的血浆汇集到第一个圆锥管(管#1)中。去除血浆后,将Streck管用它们原始的瓶塞重新加盖,并且将剩余材料保存在4℃。
圆锥管在22℃在圆锥底桶型适配器中以3,200×g(RC离心20分钟。在完成离心后,收集血浆。将4.5mL的收集的血浆转移到第二圆锥管(管#2),并且将剩余收集的血浆转移到第三圆锥管(管#3)作为备份。丢弃在圆锥管#1中剩余的细胞离心沉淀。为了DNA的同一天提取,将血浆管#2储存在4℃。为了长期储存,将该管储存在-20℃或更低直到使用。
在DNA提取前,如果血浆仍然是冷冻的,将血浆在室温解冻。一旦解冻,将血浆管以3,000×g(RCF)离心10分钟。记录具有血浆少于3mL的任何管。
然后制备Dynabeads结合溶液库存。将MyOneTM SILANE(LifeTechnologies–目录号37002D)的容器从冰箱移出,并且恰好在添加DynaMax结合溶液(DynaMax无细胞DNA提取试剂盒,目录号4479983)之前将其有力地涡旋1分钟。将1500μL的MyOneTM SILANE磁性珠粒添加到125mL的DynaMax结合溶液(DynaMax无细胞DNA提取试剂盒,目录号4479983)以生成Dynabeads结合溶液库存。
使用Hamilton Microlab STAR液体处理器(Hamilton Company,Reno,NV)制备以下24深孔平板的组(KingFisherTM Flex 24深孔平板,MolecularBioProducts Inc.,目录号95040480)
1)2mL的患者血浆样品加2mL Dynabeads结合溶液储液(以上制备的)(4mL总体积)。
2)一式两份平板#1。
3)1mL DynaMax洗涤溶液(DynaMax无细胞DNA提取试剂盒,目录号4479983)
4)1mL DynaMax洗涤溶液(DynaMax无细胞DNA提取试剂盒,目录号4479983)
5)2mL 80%乙醇
6)600μl 80%乙醇
7)DynaMax洗脱溶液(DynaMax无细胞DNA提取试剂盒,目录号4479983)
然后将制备的平板从Hamilton Microlab STAR卸载,并且检查试剂体积的一致性。然后将制备的平板装载在KingFisherTM Flex磁性颗粒处理器(具有24个深孔头)(Thermo Scientific,Waltham,MA)上。将含有KingFisherTM Flex24深孔尖梳(tip comb)的平板(Molecular BioProducts Inc.–目录号97002610)装载在KingFisherTM处理器上。在单独步骤中,将平板保持不动,并且唯一的移动组件是具有尖梳和磁棒的处理头。该头由两个垂直的移动平台组成。一个平台移动塑料尖梳出入深孔样品平板,并且另一个平台移动磁棒出入塑料尖梳。用于DNA提取的操作原理被称为逆磁颗粒处理(MPP)技术。与使用外部磁铁方法所做的将液体移入和移出平板不同,将磁性颗粒本身从平板移动到含有特定试剂的平板。将磁性颗粒在覆盖有一次性的特别设计的塑料尖梳的磁棒的辅助下转移到每个连续的平板(#1-#7)。
用于从血浆样品中分离cfDNA的程序如下进行:1)收集结合至平板#1的磁性颗粒的cfDNA(即,通过将梳子和磁棒组件插入到平板#1的孔中使DNA结合的磁性颗粒和梳子结合);2)收集结合至平板#2的磁性颗粒的cfDNA(即,在平板#2结合磁性颗粒的DNA也变为结合梳子);3)用DynaMax洗涤溶液第一次洗涤;4)用DynaMax洗涤溶液第二次洗涤;5)第一次80%乙醇洗涤;6)第二次80%乙醇洗涤;和7)用70μl DynaMax洗脱溶液洗脱。在每个步骤之间,通过从梳子组件去除磁棒而从梳子释放珠粒,并且通过将磁棒插入到梳子组件中重新结合。
在标准操作下,当珠粒沉积在洗脱缓冲液中时,KingFisherTM处理器在步骤7的过程中从洗脱液中去除珠粒,这会留下含有cfDNA的纯化的液体样品。发现了当使用小于100μl的洗脱溶液时,5-10%的孔具有不可回收或未充分洗脱的DNA。对于余下的孔,通常从70μl洗脱液中回收少于50μl。这些不好的结果可能由于在低洗脱体积中在珠粒的沉积和混合过程中发生珠粒撞击。
现在的方法修改了标准KingFisherTM DNA纯化方案,其中,不从步骤7过程中的洗脱溶液中去除珠粒,因此允许使用更小洗脱体积。将珠粒释放到洗脱溶液平板(#7)中用于洗脱步骤,然后,将仍然含有珠粒和洗脱溶液的洗脱平板移动到具有环形磁铁的24孔磁性平板。环形磁铁使珠粒结合到孔的侧面,因此允许洗脱样品的更完全去除。转换成环形磁铁用于收集洗脱样品的这样修改的步骤增加了最终样品中的cfDNA的产率,并且允许小得多的洗脱体积。另外,现在的方法导致100%回收70μl洗脱液的至少65μl。
含有环形磁铁的磁性平板位于Hamilton Microlab STARlet液体处理器。一旦发生磁性珠粒的结合,含有cfDNA的洗脱样品使用液体处理器转移到96孔平板。
实施例2:cfDNA样品的测序
在该实施例中,制备从实施例1提取的cfDNA用于测序。扩增提取的DNA并且将样品特异性条码附接于cfDNA片段。然后使用大规模平行测序技术(也称为下一代测序(NGS))分析扩增产物。然后分析来自测序仪的数据,并生成关于染色体13、18、21、X和Y的报告,其会告知存在于胎儿样品中的那些染色体的拷贝数。该测定能够检测Patau综合征(三体性13)、Edward氏综合征(三体性18)、Down综合征(三体性21)以及性染色体异常,诸如Turner氏综合征(X)和Kleinfelter氏综合征(XXY)。
方案
根据实施例1所述的方法提取无细胞DNA。然后根据以下方案使用用于(New England BioLabs,#E7370B)的UltraTM DNA Library Prep试剂盒从提取的cfDNA制备文库。为了试剂的自动等分,使用Hamilton Starlet液体处理器。
末端修复
对于cfDNA片段的末端修复,准备NEBNext End Prep反应。在冷冻块上解冻NEBNext End Prep试剂,并且如下等分。
表1
将127μL NEBNext End Prep主混合物手动等分到冷冻块上的8-条PCR管的各孔。然后,9.5μL NEBNext End Prep主混合物使用Hamilton Starlet液体处理器从8-条管转移到96孔平板的各孔。将55.5μL的提取的cfDNA转移到96孔PCR平板(总反应体积65μL)。PCR平板用铝箔封条密封,简单涡旋(约5秒),并在平板离心机中以2,000-6,000rcf(在SorvallT6000D离心机或等同物中为1,600rpm)离心约5-15秒。
然后将PCR平板置于热循环仪中,并且在以下条件下温育。
表2
1 | 20℃ | 30分钟 |
2 | 65℃ | 30分钟 |
3 | 4℃ | 保持 |
然后从热循环仪中移出96孔平板,然后在平板离心机中以2,000-6,000rcf(在Sorvall T6000D离心机或等同物中为1,600rpm)离心约5-15秒。
衔接子连接
Y形NIPT衔接子从以下寡核苷酸NIPT衔接子1和NIPT衔接子2生成:
NIPT衔接子1:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T(SEQ ID NO:5)
NIPT衔接子2:/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA*C(SEQ ID NO:6)
NIPT衔接子1中的C*T和NIPT衔接子2中的A*C是硫代磷酸酯键。下划线的序列表示每个寡核苷酸中的互补核苷酸序列。含有杂交的NIPT衔接子1和NIPT衔接子2的原种(stock)NIPT衔接子根据下表以50μM浓度制备。
表3
将50μL的原种50μL衔接子混合物等分到新的96孔PCR平板的各孔中。密封平板,将其置于热循环仪,并在以下条件下温育:
表4
步骤 | 温度 | 时间 | Ramp% |
1 | 95℃ | 5分钟 | 100 |
2 | 35℃ | 1秒 | 10 |
3 | 25℃ | 5分钟 | 40 |
4 | 4℃ | 保持 | 100 |
当完成程序时,将所有孔合并回到一个单一的无菌微量离心管中并脉冲涡旋5-10次。为了储存,将30uL体积等分到无菌微量离心管,并储存在-15℃至-25℃。
根据以下的量制备衔接子连接主混合物:
表5
将259μL衔接子连接主混合物手动等分到冷冻块上的8-条PCR管的各孔。然后18.5μL衔接子连接主混合物使用Hamilton Starlet液体处理器从8-条管转移到End Prep PCR平板的各孔(总体积=83.5μL。PCR平板用铝箔封条密封,简单涡旋(约5秒)并在平板离心机中以2,000-6,000rcf(在Sorvall T6000D离心机或等同物中为1,600rpm)离心约5-15秒。
然后将PRC平板置于热循环仪并在以下条件下温育。
表6
1 | 20℃ | 15分钟 |
2 | 4℃ | 保持 |
然后将96孔平板从热循环仪中移出,并在平板离心机中以2,000-6,000rcf(在Sorvall T6000D离心机或等同物中为1,600rpm)离心约5-15秒。
连接产物的AMPure提纯(Clean-Up)
然后根据制造商的方案使用XP PCR纯化珠粒(Beckman Coulter,#A63881)纯化衔接子连接反应以去除未连接的衔接子和其他杂质。该方法的等分步骤使用Hamilton Starlet液体处理器进行。
简言之,将83.5μL AMPure XP珠粒添加到连接产物平板,混合并在室温温育10分钟用于DNA结合。然后将平板转移到磁性平板上,并静置4分钟以澄清上清液。然后将上清液去除并丢弃。添加180μL的新鲜制备的80%乙醇,温育30秒,然后去除并丢弃。将80%乙醇洗涤多重复两次(总共3次洗涤)。在去除最后乙醇洗涤之后,珠粒在磁铁平板上风干2分钟。然后将平板从磁铁移出。添加28μL水以重悬珠粒并在室温温育2-5分钟以洗脱DNA。然后将平板转移回到磁铁,静置2分钟澄清洗脱溶液。然后将23μL的上清液(纯化的DNA)转移到新的96孔PCR平板。
文库的PCR
然后使用通用正向引物和条形码化的反向引物扩增衔接子连接产物。
P5通用的:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:3)
MID引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:4)
(MID引物的下划线部分表示独特的10个核苷酸分子ID序列)。示例性条形码序列可例如在US 20140141436和(Attorney Docket No.034827-0803)中发现。
PCR主混合物根据以下的量制备。将MID条形码化的引物分别等分。
表7
将26μL PCR主混合物直接添加到提纯的连接平板的各孔(总体积=50μL)。将2μL的适当MID引物(5μM)等分到PCR平板的各孔。将不同条形码等分到平板的各孔中。PCR平板使用铝箔封条密封,简单涡旋(约5秒),并在平板离心分离机中以2,000-6,000rcf(在Sorvall T6000D离心机或等同物中为1,600rpm)离心约5-15秒。
然后将PCR平板置于热循环仪并在以下条件下温育。
表8
然后将96孔平板从热循环仪移出,并在平板离心分离机中以2,000-6,000rcf(在Sorvall T6000D离心机或等同物中为1,600rpm)离心约5-15秒。
文库PCR产物的提纯
然后根据制造商的方案使用XP PCR纯化珠粒(Beckman Coulter,#A63881)纯化文库PCR反应以去除引物和其他杂质。方法的等分步骤使用Hamilton Starlet液体处理器进行。
简言之,将50μL AMPure XP珠粒添加到连接产物平板,混合并在室温温育5分钟用于DNA结合。然后将平板转移到磁性平板上,并静置3分钟以澄清上清液。然后将上清液去除并丢弃。添加180μL的新鲜制备的80%乙醇,温育30秒,然后去除并丢弃。将80%乙醇洗涤再重复两次(总共3次洗涤)。在去除最后乙醇洗涤之后,珠粒在磁铁平板上风干2分钟。然后将平板从磁铁去除。添加33μL水以重悬珠粒并在室温温育2-5分钟以洗脱DNA。然后将平板转移回到磁铁,静置2分钟澄清洗脱溶液。然后将28μL的上清液(纯化的DNA)转移到新的96孔PCR平板。
扩增的文库根据制造商的方案使用Quant-ItdsDNA测定试剂盒(Invitrogen,#P7589)定量。文库样品的摩尔浓度基于298bp的平均文库大小计算。因此,文库的分子量约为193,700g/mol(298bp×每bp 650g/mol)。
在定量扩增的文库后,文库使用水标准化至2nM。文库跨越96孔平板(5μL/孔)的各排汇集以为每个96孔平板产生每个为60μL的8个汇集物。
NGS测序
然后使用HiSeq SR Cluster试剂盒v4cBot制备标准化的汇集的文库用于测序,其包括高输出单读取流动池、cBot聚簇试剂和索引试剂。根据制造商的说明书进行cBot试剂平板上的流动池聚簇。然后根据制造商的说明书使用Illumina HiSeq 2500和HiSeq SBS试剂盒v4进行高输出测序。
以下对照样品用于每次测序运行:
1)PhiX测序对照
在簇生成前将5%的从PhiX病毒生成的对照文库的低水平掺混物(spike)添加到测序汇集物,并加载在HiSeq上用于测序。这允许Illumina簇检测算法更好地进行,原因是A、T、G和C核苷酸更平衡的表达。这还帮助确定失败的HiSeq运行,如果失败在于样品制备或在于在流动池上的簇生成。因为PhiX序列是已知的,该掺混物还帮助确定运行的误差率,并提供测序成功的指示。相位速率和预相位速率也使用PhiX序列确定。
2)汇集的阴性血浆对照
将先前运行剩余的血浆的混合物混合在一起,并且确定组合的混合物的胎儿分数。将汇集的血浆等分成单次使用,并冷冻储存直到使用。在每个96孔平板上运行这些对照中的一个并且用作整个测定方案的对照。用于对照的已知的胎儿分数应该与用于每次运行的计算的胎儿分数匹配。
3)阳性对照
在多路化过程中添加阳性对照。该对照通过组合文库扩增的产物生成,每个具有与其附接的不同条形码,包括正常整倍体样品,具有每种三体性21、三体性18和三体性13的5%混合物。
4)阴性DNA对照
阴性DNA对照包括以下:a)NS(无样品)对照:试剂空白,其包括用于提取样品DNA的试剂。如果在不同场合制备样品,对于每个单独制备物必须包括试剂空白对照。b)ND对照:负DNA对照(ND对照)必须置于运行的终点。该对照由用于测定运行的PCR试剂盒和聚合酶混合物组成。
序列读段的比对和分析使用专有的软件进行。Z分数基于每个样品-染色体对(即,对于染色体21、18和13)计算。使用cfDNA提取方法、构建的样品和正常样品的已知三体性21阳性的预验证研究的示例性Z评分数据示于表9。
表9
样品ID | Z分数 | 构建的/正常样品的组合物 |
Q0256_MID039 | 13.48461293 | |
Q00352_MID039 | 12.94768903 | |
Q01407_MID024 | 13.24801795 | |
Q00082_MID073 | 12.80022514 | |
Q01319_MID027 | 12.63944832 | |
Q00084_MID074 | 12.71152341 | |
Q00083_MID074 | 11.39330754 | |
Q00527_MID051 | 11.27868636 | |
Q01408_MID025 | 11.23511941 | |
Q00614_MID047 | 7.711804345 | |
Q01056_MID035 | 6.1944683 | |
Q12378_S12_L001 | 6.001329598 | T21 3%构建的 |
Q01143_MID032 | 5.317069393 | SQNM FF=3.973 |
Q11498_MID384 | 5.143841863 | T21 4%构建的 |
Q11497_MID383 | 4.857682003 | T21 3%构建的 |
Q12377_S24_L002 | 2.974488931 | T21 2%构建的 |
Q01504_MID029 | 2.086359525 | 正常的 |
Q00305_MID375 | 1.823235865 | 正常的 |
Q00373_MID061 | 1.299134458 | 正常的 |
表10显示使用两个质量控制指标(单独读段计数阈值(即900万个读段)或读段计数与映射到基因组的读段的百分比组合)的染色体13、18和21非整倍性的示例性验证结果。
表10
对于预验证(pre-validation)研究,在示例性阴性样品和示例性三体性21阳性样品的至少五个复制中观察到完美的测定内一致性。
表11显示Z分数的示例性验证数据,和多个妊娠样品(multiple gestationpregnancy samples)的胎儿分数。
表11
T13 | ||||
流动池 | 样品 | Z.Mean.Mad | 一致性 | FF |
AC6G9R | MF0116_MID040 | 11.14954337 | 是 | 12.49 |
T18 | ||||
Flowcell | 样品 | Z.Mean.Mad | 一致性 | FF |
AC6G9R | MF0111_MID038 | 30.55752229 | 是 | 10.98 |
AC6G92 | MF114_MID039 | 23.45230739 | 是 | 20.17 |
AC6G9R | MF0112_MID039 | 12.81936655 | 是 | 7.63 |
AC6G92 | MF113_MID038 | 10.64368517 | 是 | 9.21 |
T21 | ||||
流动池 | 样品 | Z.Mean.Mad | 一致性 | FF |
AC6G92 | MF106_MID037 | 26.64485662 | 是 | 14.23 |
AC6G9R | MF0101_MID035 | 16.80828463 | 是 | 14.2 |
AC6G9R | MF0103_MID037 | 15.1580532 | 是 | 13.55 |
AC6G78 | MF0108_MID037 | 14.66836417 | 是 | 8 |
AC6G78 | MF0107_MID036 | 13.13026839 | 是 | 8.66 |
AC6G9R | MF0102_MID036 | 12.37312038 | 是 | 8.62 |
AC6G78 | MF0110_MID039 | 12.19752486 | 是 | 10.94 |
AC6G92 | MF0105_MID036 | 11.52830058 | 是 | 10.77 |
AC6G92 | MF0104_MID035 | 9.452609754 | 是 | 13.17 |
AC6G78 | MF0109_MID038 | 8.033323435 | 是 | 7.77 |
表12显示用于选择的阳性样品的Z分数的示例性测试数据显示染色体13、18和21的非整倍性。wt/wt样品的平均Z分数是T13为-0.3、T18为-0.06和T21为-0.06。
表12
应该理解的是,虽然已经通过优选的实施方案和可选的特征具体地公开了本发明,但是本领域技术人员可采取本文公开的在此包括的本发明的修改、改善和改变,并且这样的修改、改善和改变被认为在本发明的范围内。这里提供的材料、方法和实施例是特定实施方案的代表,是示例性的,并且不意图作为对本发明的范围的限制。
在本文中广泛且一般地描述了本发明。落入一般公开中的每个较窄物种和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述,附带条件或负面限制从该属中移除任何主题,而不管在本文中是否具体列举了所删去的材料。
另外,在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到,本发明还由此根据马库什组的任何单个成员或亚组成员进行描述。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过提及到如同通过单独提及并入的相同程度以其整体特别并入。在矛盾的情况下,以本说明书(包括定义)为准。
本文示例说明地描述的发明可以在没有任何一个或多个元素,一个或多个限制的情况下适当地实施,本文没有具体公开。因此,例如,术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地理解并且没有限制。另外,本文采用的术语和表达已经用作说明的术语,而不是限制,并且在使用这样的术语和表达不意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物的情况下,但是认识到在所要求的本发明的范围内,各种修改是可能的。
在权利要求内列举了另外的实施例。
Claims (31)
1.一种用于将无细胞DNA(cfDNA)从来自哺乳动物的液体生物样品分离的方法,所述方法包括:
a)使含有cfDNA的液体生物样品与多个可逆地结合DNA的磁性珠粒接触;
b)将cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品的未结合组分分离;
c)将所述cfDNA结合的磁性珠粒转移到含有洗脱溶液的容器;
d)通过使含有在所述洗脱溶液中的所述磁性珠粒的容器与磁性平板接触将所述磁性珠粒从所述洗脱溶液分离和收集含有所述cfDNA的洗脱溶液。
2.权利要求1的方法,其中,所述磁性珠粒包含交联的聚苯乙烯。
3.权利要求1的方法,其中,所述磁性珠粒的表面包含可逆地结合DNA的一个或多个官能团。
4.权利要求1的方法,其中,所述磁性珠粒包被有含硅包衣。
5.权利要求1的方法,其中,通过将所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品转移到另一个容器而将所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品的未结合组分分离。
6.权利要求1的方法,其中,所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品直接转移到含有所述洗脱溶液的容器。
7.权利要求1的方法,其中,将从所述液体生物样品转移的所述cfDNA结合的磁性珠粒转移到含有洗涤溶液的容器。
8.权利要求1的方法,其中,通过将棒状磁铁插入到所述液体生物样品中以磁性地结合所述cfDNA结合的磁性珠粒而将所述cfDNA结合的磁性珠粒从所述液体生物样品的未结合的组分分离。
9.权利要求8的方法,其中,使所述珠粒沉积在含有所述洗脱溶液的容器中。
10.权利要求8的方法,其中,使所述珠粒沉积在含有所述洗涤溶液的容器中。
11.权利要求10的方法,其中,通过将棒状磁铁插入到含有所述cfDNA结合的磁性珠粒的洗涤溶液中而将所述cfDNA结合的磁性珠粒转移到所述洗脱溶液,和使所述磁性地结合的珠粒沉积在含有所述洗脱溶液的容器中。
12.权利要求1的方法,其中,所述磁性珠粒的转移为自动的。
13.权利要求1的方法,其中,所述液体生物样品为血浆样品。
14.权利要求1的方法,其中,所述液体生物样品为从妊娠雌性获得的。
15.权利要求1的方法,其中,所述液体生物样品为从人类受试者获得的。
16.权利要求1的方法,其中,所述液体生物样品的体积为0.5-2mL。
17.权利要求1的方法,其中,所述洗脱溶液的体积小于200μl。
18.权利要求1的方法,其中,所述洗脱溶液的体积小于或约为150μl、小于或约为100μl、小于或约为90μl、小于或约为80μl、小于或约为70μl、小于或约为60μl、小于或约为50μl或者小于或约为40μl。
19.权利要求1的方法,其中,步骤(a)在多孔板中进行。
20.权利要求19的方法,其中,洗涤和洗脱步骤在相同大小的多孔板中进行。
21.权利要求20的方法,其中,所述多孔板为24孔深孔板。
22.权利要求1的方法,其中,含有cfDNA的至少两个重复液体生物样品与多个磁性珠粒接触。
23.权利要求22的方法,其中,在步骤(a)后汇集每个重复样品中的所述cfDNA结合的磁性珠粒。
24.权利要求1的方法,其进一步包括在步骤(a)之后,将洗涤的cfDNA结合的磁性珠粒顺序转移到两个或更多洗涤溶液。
25.权利要求1的方法,其中,所述磁性珠粒为直径均一的。
26.权利要求1的方法,其中,所述磁性珠粒直径为约1μm。
27.权利要求1的方法,其中,所述洗涤的cfDNA结合的磁性珠粒在所述洗脱溶液中温育至少4分钟。
28.权利要求1的方法,其中,将热施加到步骤(d)中含有所述磁性珠粒的洗脱溶液中以洗脱所述cfDNA。
29.权利要求1的方法,其中,所述磁性平板包含环状磁铁。
30.权利要求1的方法,其中,在步骤(d)中所述磁性平板引起所述磁性珠粒附着于容器壁。
31.权利要求1的方法,其中,所述液体生物样品通过从血液样品中去除细胞来制备。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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