CN104946623A - 基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，包括血液游离DNA提取、片段大小筛选、末端修复、3’端添加接头、PCR扩增、磁珠纯化等步骤。与以往基于测序平台的建库流程相比，本发明建库方法简化了实验流程，缩短建库时间，优化了反应体系，大幅度的减少试剂用量，降低建库成本，并降低了文库的损失，适用于人为片段化的小DNA文库的构建。
Description
技术领域
本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法。
背景技术
染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切的关系。新生儿中染色体异常的发病率为1/160，其中21-三体(唐氏综合征)、18-三体(爱德华氏综合征)和13-三体(帕陶氏综合征)是三种最主要常染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800、1/6000和1/1000。目前此类疾病尚无有效治疗方法，正能通过产前诊断减少患儿的出生。
在该类疾病现有的检测方法中，利用第二代高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法具有明显的优势。第一，只需抽取母体外周血进行检测，避免了传统的侵入性方法可能会对孕妇和胎儿带来的危害；第二，直接检测染色体上的DNA序列即直接致病因素，与用血清蛋白标记物和超声波进行检测的方法相比，检测的准确性和灵敏度都大大提高；第三，通过深度测序，实现了对孕妇外周血中少量胎儿游离DNA(cell-free fetalDNA,cffDNA)的准确检测，克服了传统检测方法因胎儿游离DNA的含量过低而呈现搞得假阴性率的缺点。
高通量测序技术又称为下一代测序技术、以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和读长较短等为标志。第二代高通量illumina测序平台具有测序通量高、准确度高和成本低等优点，并广泛应用于多个领域。在高通量检测方法的整个流程中，游离DNA文库的制备是非常关键的一步，文库质量的好坏将直接影响测序数据的质量，并影响检测结果的准确性。
现有技术中基于Illumina Hiseq2500测序平台的文库构建方法主要包括以下步骤：
1、将DNA打断到一定的大小并纯化；
2、对DNA片段进行末端修复并纯化；
3、在已修复的DNA片段的3’端加上一个“A”碱基并纯化；
4、用DNA连接酶将特异性接头连接至DNA片段的两端，纯化；
5、对加接头的DNA序列进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段，纯化；
6、采用PCR方法扩增DNA文库，纯化。
用Agilent Bioanalyzer2100和Q-PCR检测上述构建文库的片段大小及浓度，之后使用Illumina测序平台进行高通量测序。上述基于illumina测序平台的文库构建方法存在自身的局限性：第一，上述小片段DNA文库构建流程繁琐，操作过程复杂，建库所花费的时间长；第二，上述建库流程中，各个步骤需相互独立进行制备且都需要进行纯化，这就造成了DNA文库样品不可避免的损失和浪费，不适用于DNA量少的样本或其他珍惜样本的检测；第三构建文库所用试剂的种类繁多，使得整个构建文库的过程的成本增加。
发明内容
本发明目的是提供一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，以降低建库成本和缩短建库时间。
本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)血液游离DNA提取：采用磁珠法从样品中提取血液游离DNA；
(2)片段大小筛选：利用磁珠对步骤(1)DNA进行片段大小筛选及纯化；
(3)末端修复：将步骤(2)得到的DNA与试剂1混合，在PCR仪上按22℃20min，72℃20min的程序进行孵育反应；
(4)3’端添加接头：将步骤(3)所得的反应体系与试剂2混合，在PCR仪上22℃15min，72℃20min的程序进行孵育反应；之后磁珠纯化；
(5)PCR扩增：将步骤(4)得到的DNA片段加入试剂3进行PCR扩增；
(6)磁珠纯化：将步骤(5)所得扩增产物利用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；
其中，步骤(3)所述试剂1的pH值为7.5，成分为去离子水、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMγ-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶；
步骤(4)所述试剂2的pH值为7.6，成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA连接酶、10mM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt％甘油、1mM ATP、5mM dNTPs；
步骤(5)所述试剂3的pH值为7.6，成分为去离子水、100mM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA聚合酶和12.5mM引物混合液。
步骤(1)所述样品为孕12-24周的孕妇外周血的血浆。
步骤(1)采用试剂盒提取DNA，所述试剂盒为金麦格血清游离DNA提取试剂盒。
步骤(2)和步骤(6)所述磁珠为AMPure XP磁珠，筛选的DNA片段大小范围是250-350bp。
步骤(4)所述DNA Adapter为正反两个序列组成Y字的接头，接头的序列分别为：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
其中XXXXXX表示标签接头序列，选自SEQ ID NO:2-49，如下表所示：
步骤(5)中PCR扩增所使用的引物序列为：Primer 1如SEQ ID NO:50所示:5’AATGATACGGCGACCACCGAGATATACAC3’，Primer 2如SEQ ID NO:51所示:5’CAAGCAGAACACGGCATACGAGAT3’。
本发明第二方面提供了一种小片段DNA文库，其由上述任一方法构建。
本发明第三方面提供了一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的末端修复反应试剂，其pH值为7.5，成分为去离子水、50mM Tris-Hcl、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMγ-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶。
本发明第四方面提供了一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的接头反应试剂，其pH值为7.6，成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA连接酶、10mM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt％甘油、1mM ATP、5mM dNTPs。
本发明第五方面提供了一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的PCR扩增反应试剂，其pH值为7.6，成分为去离子水、100mM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA聚合酶和12.5mM引物混合液。
本发明的有益效果：
与以往基于测序平台的建库流程相比，本发明建库方法简化了实验流程，缩短建库时间，优化了反应体系，大幅度的减少试剂用量，降低建库成本，并降低了文库的损失，适用于人为片段化的小DNA文库的构建。
附图说明
图1：本发明小片段DNA文库的构建流程图。
图2：采用Agilent Bioanalyzer 2100对本发明文库的检测结果图。
图3：文库测序数据质检结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰，也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建。
1、试剂
试剂1其pH值为7.5，成分为去离子水、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇(DTT)、1mMγ-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶。
试剂2其pH值为7.6，成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA连接酶、10mM MgCl2、50mM Tris-Hcl、50wt％甘油、1mM ATP、5mM dNTPs。
试剂3其pH值为7.6，成分为去离子水、100mM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、 10U/ul Tap DNA聚合酶和12.5mM引物混合液。
2、实验步骤
(1)采集母体外周血，制备血浆
在本实施例中，总共抽取48名孕妇外周血，编号为：ST01、ST02、ST03、ST04、ST05、ST06、ST07、ST08、ST09、ST10、ST11、ST12、ST13、ST14、ST15、ST16、ST17、ST18、ST19、ST20、ST21、ST22、ST23、ST24、ST25、ST26、ST27、ST28、ST29、ST30、ST31、ST32、ST33、ST34、ST35、ST36、ST37、ST38、ST39、ST40、ST41、ST42、ST43、ST44、ST45、ST46、ST47、ST48，均经过染色体核型分析。血液经两步离心法得到除去了血细胞的血浆，每个血样的血浆量为1ml。实验中加入阴性对照N，阴性对照以经过灭菌的高纯水代替血浆。
(2)提取血浆DNA
采用金麦格血清游离DNA提取试剂盒(磁珠法，货号为NA009)提取血浆DNA。
(3)制备血浆DNA文库，如图1所示
A、片段大小筛选
经过两轮磁珠纯化做DNA片段筛选得到片段集中的DNA(DNA片段≤200bp)，16ul Resuspension Buffer溶液溶解洗脱。
B、末端修复
将上一步得到的DNA和试剂1加入Nuclease-free PCR管中(冰上操作)
| 组分 | 体积 |
| DNA(5-10ng) | 16ul |
| 试剂1 | 9ul |
| 体积 | 25ul |
在PCR仪上22℃20min，72℃，20min,4℃结束孵育。
C、3’端添加接头
在PCR仪22℃15min，72℃20min。经过两轮磁珠纯化做DNA片段筛选得到片段集中的DNA(DNA片段≤200bp)，18ul Resuspension Buffer溶液溶解洗脱。
接头的序列分别为：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(如SEQ ID NO:1所示)
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
其中XXXXXX表示标签接头序列，选自SEQ ID NO:2-49。
D、PCR扩增
| 组分 | 体积 |
| 纯化DNA | 18ul |
| 试剂3 | 6ul |
| PCR扩增引物 | 1ul |
| 体积 | 25ul |
PCR反应条件为：先98℃预变性2min；然后98℃30S,65℃30S,72℃30S，共10个循环；最后72℃延伸4min。
试剂3中的PCR扩增引物序列为
Primer1如SEQ ID NO:50所示:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’
Primer2如SEQ ID NO:51所示:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’
E、磁珠纯化
经过两轮磁珠纯化做DNA片段筛选得到片段集中的DNA(DNA片段≤200bp)，25ul Resuspension Buffer溶液溶解洗脱，得到小片段DNA文库。
实施例2
文库检测
用Agilent Bioanalyzer 2100检测DNA文库大小，部分样品检测如图2所示。用ABI7500Q-PCR检测DNA文库的浓度，具体检测结果见下表。
从上表中的数据可知，本发明的试剂组合溶液和文库构建方法所构建的文库浓度适当，远远高于Hiseq上机浓度(10pM)，该发明的试剂组合溶液和文库构建方法可适用于Hiseq2500测序平台。
利用Illumina Hiseq 2500测序平台对上述构建好的DNA文库进行高通量测序，并对测序数据进行生物信息学分析得到如下结果：
| 样本编号 | 核型 | 测序结果 | 样本编号 | 核型 | 测序结果 |
| ST01 | 46，XX | 46，XX | ST25 | 46，XY | 46，XY |
| STO2 | 46，XY | 46，XY | ST26 | 46，XY | 46，XY |
| ST03 | 46，XX | 46，XX | ST27 | 46，XX | 46，XX |
| ST04 | 46，XY | 46，XY | ST28 | 46，XX | 46，XX |
| ST05 | 46，XY | 46，XY | ST29 | 46，XY | 46，XY |
| ST06 | 46，XY | 46，XY | ST30 | 46，XX | 46，XX |
| ST07 | 46，XX | 46，XX | ST31 | 46，XX | 46，XX |
| ST08 | 46，XX | 46，XX | ST32 | 46，XX | 46，XX |
| ST09 | 46，XY | 46，XY | ST33 | 46，XX | 46，XX |
| ST10 | 46，XX | 46，XX | ST34 | 46，XY | 46，XY |
| ST11 | 46，XY | 46，XY | ST35 | 46，XY | 46，XY |
| ST12 | 46，XY | 46，XY | ST36 | 46，XY | 46，XY |
| ST13 | 46，XY | 46，XY | ST37 | 46，XY | 46，XY |
| ST14 | 46，XX | 46，XX | ST38 | 46，XX | 46，XX |
| ST15 | 46，XX | 46，XX | ST39 | 46，XX | 46，XX |
| ST16 | 46，XY | 46，XY | ST40 | 47，XY+13 | 47，XY+13 |
| ST17 | 46，XX | 46，XX | ST41 | 47，XX+13 | 47，XX+13 |
| ST18 | 47，XY+21 | 47，XY+21 | ST42 | 47，XY+18 | 47，XY+18 |
| ST19 | 47，XY+18 | 47，XY+18 | ST43 | 47，XY+18 | 47，XY+18 |
| ST20 | 47，XY+21 | 47，XY+21 | ST44 | 47，XY+21 | 47，XY+21 |
| ST21 | 47，XX+21 | 47，XX+21 | ST45 | 47，XX+21 | 47，XX+21 |
| ST22 | 47，XX+18 | 47，XX+18 | ST46 | 47，XX+18 | 47，XX+18 |
| ST23 | 47，XY+18 | 47，XY+18 | ST47 | 47，XY+21 | 47，XY+21 |
| ST24 | 47，XX+21 | 47，XX+21 | ST48 | 47，XX+21 | 47，XX+21 |
[0083] 在测序数据中，文库的GC含量是判断文库是否合格的一个重要标准，会对后期的数据分析及结果判断产生很大的影响，正常文库的GC含量为39％-42％，文库GC含量低于39％或高于42％都会被判断不合格，需重新进行文库构建。为了验证本发明方法所构建文库的质量，对测序数据进行了QC质检，部分样品结果如图3所示，本发明文库质量全部合格，能够显著的降低在DNA提取和文库构建中对DNA的引入偏差而导致的测序结果不理想的情况，从后期结果判断上，可大幅降低假阳性和假阴性结果出现的可能。
Claims (10)
1.一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，
包括如下步骤：
(1)血液游离DNA提取：采用磁珠法从样品中提取血液游离DNA；
(2)片段大小筛选：利用磁珠对步骤(1)DNA进行片段大小筛选及纯化；
(3)末端修复：将步骤(2)得到的DNA与试剂1混合，在PCR仪上按22℃20min，72℃20min的程序进行孵育反应；
(4)3’端添加接头：将步骤(3)所得的反应体系与试剂2混合，在PCR仪上按22℃15min，72℃20min的程序进行孵育反应；之后磁珠纯化；
(5)PCR扩增：将步骤(4)得到的DNA片段加入试剂3进行PCR扩增；
(6)磁珠纯化：将步骤(5)所得扩增产物利用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；
其中，步骤(3)所述试剂1的pH值为7.5，成分为去离子水、50mM Tris-HCl、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMγ-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4 DNAPolymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶；
步骤(4)所述试剂2的pH值为7.6，成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA连接酶、10mM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt％甘油、1mM ATP、5mM dNTPs；
步骤(5)所述试剂3的pH值为7.6，成分为去离子水、100mM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA聚合酶和12.5mM引物混合液。
2.根据权利要求1所述的基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述样品为孕12-24周的孕妇外周血的血浆。
3.根据权利要求1所述的基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(1)采用试剂盒提取DNA，所述试剂盒为金麦格血清游离DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求1所述的基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(6)所述磁珠为AMPure XP磁珠，筛选的DNA片段大小范围是250-350bp。
5.根据权利要求1所述的基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述DNA Adapter为正反两个序列组成Y字的接头，接头的序列分别为：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
其中XXXXXX表示标签接头序列，选自SEQ ID NO:2-49。
6.根据权利要求1所述的基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(5)中PCR扩增所使用的引物序列为：
Primer 1如SEQ ID NO:50所示:5’AATGATACGGCGACCACCGAGATATACAC3’
Primer 2如SEQ ID NO:51所示:5’CAAGCAGAACACGGCATACGAGAT3’。
7.一种小片段DNA文库，其特征在于，由权利要求1-6中任一项所述的方法构建。
8.一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的末端修复反应试剂，其特征在于，所述末端修复反应试剂的pH值为7.5，成分为去离子水、50mM Tris-Hcl、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mMγ-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNAPolymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶。
9.一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的接头反应试剂，其特征在于，所述接头反应试剂pH值为7.6，成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ulT4 DNA连接酶、10mM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt％甘油、1mM ATP、5mM dNTPs。
10.一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的PCR扩增反应试剂，其特征在于，所述PCR扩增反应试剂的pH值为7.6，成分为去离子水、100mM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA聚合酶和12.5mM引物混合液。
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2015
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