CN106591956A - 一种测序文库构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的测序文库构建方法，包括如下步骤：步骤1：使用ERAT反应体系一步完成样本DNA片段末端修复、片段5’端磷酸化和片段3’端加dA工作；步骤2：在步骤1获得的ERAT修复样本中加入接头、连接酶和连接酶缓冲液，根据文库需求保留样本中的小片段DNA；步骤3：使用1x至XP磁珠纯化回收连接产物；此处可根据需要进行磁珠比例等方面的调整进行片段筛选；步骤4：使用高保真酶进行7‑11个循环的PCR反应，扩增连接产物；步骤5：使用

Description

一种测序文库构建方法
技术领域：
本发明涉及高通量测序技术领域，特别涉及一种适用于针对各种DNA样本构建高通量测序文库的测序文库构建方法，该方法尤其适用于小片段DNA样本和微量DNA样本的高通量测序文库的构建。
背景技术：
二代测序和三代测序技术正逐步普及，在常见测序方法中，其主要涉及三个主要部分：样品制备、测序文库构建和测序分析。其中所涉及的测序文库构建水平对于测序能力的提升尤为关键。测序文库构建涉及样品DNA片段的末端修复、片段5’端磷酸化、片段3’端加dA、修复后样品片段与测序接头连接、连接片段扩增等步骤，步骤之间通常需要进行纯化，然而多步骤和步骤间的多次纯化过程既繁琐耗时耗材又容易引起样本不必要的损失，对于珍惜的微量DNA样本，如癌症患者血浆游离DNA样本而言，这种影响更加严重。虽然现在已经有较多的商用测序文库构建试剂盒，如KAPAbiosystems和Illumina等公司的测序文库构建试剂盒，但是这些试剂盒依然涉及较多的文库构建步骤和纯化次数，而且这些试剂盒都因为本身设计的缺陷不能有效保留小片段DNA样本，因而不能用于构建小片段DNA样本文库；另外这些试剂盒对于极微量的DNA样本(如1ng DNA样品量)的文库构建能力也有限。
以血浆游离DNA(cell-free DNA，简称cfDNA)为例，cfDNA是指以片段化形式游离于胞外的基因组DNA片段，其以细胞破碎、细胞凋亡和细胞主动释放等形式由胞内进入组织液中，尤其是血液中。在普通人群血液样本中的cfDNA，其含量极少，且其片段大小范围跨度大，主要约为160bp。在带有癌细胞的个体中，其cfDNA中包含有源自癌细胞的DNA片段，即为ctDNA(Circulating tumor DNA，循环肿瘤DNA)，这些ctDNA片段化程度比其它正常体细胞来源的cfDNA更高，平均片段约小30bp。在不同肿瘤和不同病情状态下的ctDNA片段化程度均不相同，一般肿瘤组织块越大或病灶越大，在其相应血液中检测到的ctDNA平均片段更小。目前，以ctDNA作为监测肿瘤病情的生物标记物已成为肿瘤液态活检的突破点之一，以与NGS技术相结合实现液态活检的方法也逐步被报道。其中样品制备主要为cfDNA的提取，目前通常使用QIAamp blood DNA mini kit、NucleoSpin Plasma XP kit、QIAampcirculating nucleic acid kit等方法试剂盒，不同的试剂盒提取效率和提取的NDA片段范围有所不同。而其测序文库的构建，常见的为KAPAbiosystems和Illumina的建库试剂盒，这些建库试剂盒通常涉及多次步骤间样品纯化过程，并基本采用磁珠吸附的方法，而磁珠吸附不能有效回收小于100bp的片段，因此在基于这些建库方法上获得的文库中均缺损小于100bp片段范围的cfDNA。而在现有的研究报道中显示，ctDNA在100bp以下相比与非ctDNA有更高的分布和占比，且在部分样品中，ctDNA主要分布于100bp以下的片段范围内。因此在利用ctDNA进行肿瘤液态活检时，小片段ctDNA具有不可忽视的检测价值。而对于以cfDNA等为样品的测序技术中，目前也缺少对样品小片段DNA的保留能力和对微量或痕量DNA的建库能力。
发明内容
本发明的目的针对上述测序文库构建所存在的问题而提供一种测序文库构建方法，起旨在保留传统测序文库构建优势的基础上，实现对小片段DNA样本的建库能力以及提高对微量DNA样本的建库能力，并可以有效用于ctDNA等特殊样品的测序文库构建中。
为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
测序文库构建方法，包括如下步骤：
步骤1：使用ERAT反应体系一步完成样本DNA片段末端修复、片段5’端磷酸化和片段3’端加dA工作，即无需先进行DNA片段修复再纯化再进行加dA的繁琐步骤；
步骤2：在步骤1获得的ERAT修复样本中加入接头、连接酶和连接酶缓冲液，即无需纯化直接使用连接酶开始连接反应，既减少纯化步骤同时根据文库需求保留样本中的小片段DNA；
步骤3：使用1x至2xXP磁珠纯化回收连接产物，此处可根据需要进行磁珠比例等方面的调整进行片段筛选。在本步骤，小片段DNA两端已经与相应接头结合，有效增加了片段长度，因此在此处采用磁珠吸附纯化的方法仍然可以保留小片段DNA；
步骤4：使用高保真酶进行7-11个循环的PCR反应，扩增连接产物；
步骤5：使用XP磁珠纯化回收PCR产物，质控检测完成文库构建。
在本发明的一个优选实施例中，步骤1中的ERAT反应体系和反应条件如下：
ERAT反应体系成分见表1：
表1
其中ERAT master成分见表2
表2
其中ERAT buffer 5x成分见表3
表3
在本发明的一个优选实施例中，步骤2中末端修复及加dA反应条件是：将上述10ul反应体系置于PCR仪中，设置20℃反应20分钟，72℃反应15分钟。
在本发明的一个优选实施例中，步骤2中接头-片段连接反应体系组分是采用商用KAPA连接酶缓冲液与连接酶用于样本-接头连接反应，并根据文库需求使用表4相应的接头以及相应的比例：
表4
反应条件：于PCR仪中，设置20℃反应15分钟。
在本发明的一个优选实施例中，步骤3中使用1x至2xXP磁珠纯化回收连接产物是：使用BECKMAN商用XP磁珠用于连接产物的纯化，纯化两次，最终使用20-25ul水洗脱溶解DNA，其他根据商用产品说明进行纯化回收，以及根据文库需求进行片段筛选。
在本发明的一个优选实施例中，步骤4中PCR扩增反应体系组分如下：
使用商用KAPA HiFi HotStart Ready Mix用于PCR反应，反应体系见表5：
表5
PCR扩增反应条件程序见表6
表6
在本发明的一个优选实施例中，步骤5中PCR产物磁珠纯化具体是：使用BECKMAN商用XP磁珠用于PCR产物的纯化，根据商用产品说明进行纯化回收，纯化一次，最终溶于20-25ul水中，随后进行文库检测质控，用于后续测序流程。
本发明可以有效保留DNA样本中的小片段DNA，包括小于100bp的DNA片段。因此，本技术发明除了适用于普通片段大小的DNA样品文库构建之外，也适用于对小片段DNA样品文库构建。
本发明可以有效构建微量DNA样本测序文库，可以有效用于1ngDNA样品量及以上样品量的文库构建。本发明减少了纯化次数，可以有效减少建库过程中DNA样本的损失；本发明减少建库步骤，更加省时省力，一次建库时间约为3.5小时至4小时；本发明使用了合适的反应体系和更少的建库步骤，可以有效降低建库成本。
附图说明
图1为本发明以常规片段化基因组DNA为样本构建的测序文库示意图。
图2为本发明以20bp DNA Marker为样本而构建的测序文库示意图。
图3为传统技术方法以20bp DNA Marker为样本构建的测序文库示意图。
图4本发明以1ng DNA为样本构建的测序文库示意图。
图5为癌症患者血浆游离DNA分析图。
图6为本发明以1.7ng癌症患者血浆游离DNA为样本构建的测序文库示意图。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
用于常规DNA样本测序文库的制备效果
在本实例中，以平均150bp片段化的人基因组DNA为样本，取50ng级别的样本量进行构建文库，具体步骤如下：
1)取50ng样本量的片段化基因组DNA为样品；
2)于10ulERAT反应体系中对DNA片段完成末端修复并加dA反应；
3)加入连接酶、连接缓冲液和接头，于50ul连接体系中完成连接反应；
4)使用1.0x AMpure磁珠纯化回收连接产物两次；
5)取20ul连接产物于50ulPCR体系中扩增7个循环；
6)使用1.0x AMpure纯化并检测质控。
7)使用picogreen荧光染料于TBS-380荧光计上检测文库量，最终获得334.8ng的文库；根据2100生物芯片分析结果显示(见附图1)，文库质量良好。
实施例2
用于小片段DNA文库构建的效果
在本实例中，20bp DNA Marker含有20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、300bp、400bp和500bp共13中不同大小的DNA片段，在文库构建中可以观察到本发明对于小片段DNA的保留效果和文库构建效果，本发明以此为DNA样本进行文库构建，并按如下步骤进行：
1)取30ng样本量的20bp DNA Marker为样品；
2)于10ulERAT反应体系中对DNA片段完成末端修复并加dA反应；
3)加入连接酶、连接缓冲液和接头，于50ul连接体系中完成连接反应；
4)使用1.4x AMpure磁珠纯化回收连接产物两次；
5)取20ul连接产物于50ulPCR体系中扩增11个循环；
6)使用1.4x AMpure纯化并检测质控。
7)使用picogreen荧光染料于TBS-380荧光计上检测文库量，最终获得1965.65ng的文库；根据2100生物芯片分析结果显示(见图2)，样本中小于100bp的片段，包括20bp、40bp、60bp、80bp和100bp的DNA片段都得到较好的扩增，均保留在了文库之中，分别为153bp、175bp、194bp、213bp和236bp。而在传统文库构建方法的结果(见图3)中，100bp的DNA片段有极大的丢失(图3 242bp)，小于100bp的片段基本完全丢失。由此相比，本发明可以高效保留样本中小片段DNA用，优势明显。
实施例3：
用于微量DNA样本的文库构建效果
在本实例中，以1ng的片段化基因组DNA为样本，按本发明进行建库：取1ng样本量的片段化基因组DNA为样品；
1)于10ulERAT反应体系中对DNA片段完成末端修复并加dA反应；
2)加入连接酶、连接缓冲液和接头，于50ul连接体系中完成连接反应；
3)使用1.4x AMpure磁珠纯化回收连接产物两次；
4)取20ul连接产物于50ulPCR体系中扩增11个循环
5)使用1.4x AMpure纯化并检测质控，最终获得95.6ng的文库
6)使用picogreen荧光染料于TBS-380荧光计上检测文库量，最终获得95.6ng的文库；根据2100生物芯片分析结果显示(见图4)，本实施例可以以极低样本量(1ng)有效构建足量用于后续测序的文库。
实施例4
用于以癌症病人血浆游离DNA为样本构建测序文库的效果
在本实例中，以一位癌症病人的血浆游离DNA为样本构建测序文库，该样本经2100生物芯片分析显示(见图5)，其主要片段分布在176bp左右和353bp左右，利用本发明采用1.7ng的样本DNA量进行建库，步骤如下：
1)取1.7ng样本量的癌症病人血浆游离DNA为样品；
2)于10ulERAT反应体系中对DNA片段完成末端修复并加dA反应；
3)加入连接酶、连接缓冲液和接头，于50ul连接体系中完成连接反应；
4)使用1.4x AMpure磁珠纯化回收连接产物两次；
5)取20ul连接产物于50ulPCR体系中扩增11个循环；
6)使用1.4x AMpure纯化并检测质控。
7)使用picogreen荧光染料于TBS-380荧光计上检测文库量，最终获得198ng的文库；根据2100生物芯片分析结果显示(见图6)，其血浆游离DNA中176bp片段峰和353bp片段峰分别为文库中304bp和473bp片段峰，采用本实施例技术方法两者都被高效构建，本发明可以有效用于以ctDNA为标记物的癌症液态活检中。

Claims (7)

1.测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：使用ERAT反应体系一步完成样本DNA片段末端修复、片段5’端磷酸化和片段3’端加dA工作；
步骤2：在步骤1获得的ERAT修复样本中加入接头、连接酶和连接酶缓冲液，根据文库需求保留样本中的小片段DNA；
步骤3：使用1x至2xXP磁珠纯化回收连接产物，此处可根据需要进行磁珠比例等方面的调整进行片段筛选；
步骤4：使用高保真酶进行7-11个循环的PCR反应，扩增连接产物；
步骤5：使用XP磁珠纯化回收PCR产物，质控检测完成文库构建。
2.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，步骤1中的ERAT反应体系和反应条件如下：
ERAT反应体系成分见表1：
表1
其中ERAT master成分见表2
表2
其中ERAT buffer 5x成分见表3
表3
3.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，步骤2中末端修复及加dA反应条件是：将上述10ul反应体系置于PCR仪中，设置20℃反应20分钟，72℃反应15分钟。
4.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，步骤2中接头-片段连接反应体系组分是采用商用KAPA连接酶缓冲液与连接酶用于样本-接头连接反应，并根据文库需求使用表4相应的接头以及相应的比例：
表4
反应条件：于PCR仪中，设置20℃反应15分钟。
5.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，步骤3中使用1x至2xXP磁珠纯化回收连接产物是：使用BECKMAN商用 XP磁珠用于连接产物的纯化，纯化两次，最终使用20-25ul水洗脱溶解DNA，其他根据商用产品说明进行纯化回收，以及根据文库需求进行片段筛选。
6.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，步骤4中PCR扩增反应体系组分如下：
使用商用KAPA HiFi HotStart Ready Mix用于PCR反应，反应体系见表5：
表5
PCR扩增反应条件程序见表6
表6
7.如权利要求1所述的测序文库构建方法，其特征在于，步骤5中PCR产物磁珠纯化具体是：使用BECKMAN商用XP磁珠用于PCR产物的纯化，根据商用产品说明进行纯化回收，纯化一次，最终溶于20-25ul水中，随后进行文库检测质控，用于后续测序流程。
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