CN112614548A - 一种计算样本建库投入量的方法及其建库方法 - Google Patents
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Abstract
一种计算样本建库投入量的方法及其建库方法,算样本建库投入量的的方法包括:根据如下公式计算样本建库投入量Input:Input=Z*(X/Y)…(I),其中,Z为投入系数,X为样本中m1bp~m2bp片段的面积积分值,Y为m3bp~m4bp片段的面积积分值,m1<m2,m3<m4,m2>m4。通过提高建库投入量,将cfDNA的投入比例提高,避免了片段筛选带来的丢失,提高了cfDNA检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体涉及一种计算样本建库投入量的方法及其建库方法。
背景技术
随着人口的老龄化和快速增长,全球的癌症发病数和死亡数也正在快速增长。癌症将成为21世纪死亡的首要原因,并且将是世界各国提高预期寿命的最重要障碍。2018年全球新增癌症患者达1810万人,因为癌症死亡人数为960万人。我国是人口大国,也是癌症高发国家,2018年我国新发病例数380.4万例,占全球癌症新发病人数的20%以上,其中恶性肿瘤发病率为278.07/10万,死亡率为167.89/10万;肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、女性乳腺癌是我国主要的常见恶性肿瘤,约占全部新发病例的77%然而,在中国,最近五年的存活率仅为40.5%,远低于日本的64.1%。过去五年,中国每年癌症死亡人数由2014年的约230万人增至2018年的约260万人,估计2024年将达约300万人。伴随着各种治疗手段的不断兴起,现在的治疗手段正逐渐向着精准化、个性化的方案靠近,加之肿瘤细胞的异质性,癌症基因的基因检测技术成为了对特定靶向人群筛选的不可或缺的临床治疗辅助手段。
Mandel和Metais于1947年发现(Les acides nucl´;eiques du plasmasanguin chez l’homme[J].C R Hebd Seances Acad Sci(Paris),1948,142(3):241-3),细胞会释放循环游离DNA(cfDNA)进入血液系统,源自于肿瘤细胞的循环游离DNA则被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)ctDNA携带着与癌症相关的分子特征,包括体细胞突变、癌症相关病毒序列、拷贝数异常和DNA差异甲基化等。通过检测ctDNA的癌症分子特征有助于了解癌症的发生和发展。因此,ctDNA在基于液体活检的癌症早期研究中有着重要应用前景。
针对cfDNA的片段筛选,目前使用最多的是磁珠筛选法。磁珠筛选DNA是在较高浓度的PEG和NaCl溶液中,PEG夺取DNA分子外面水化层的水,导致水化层被破坏,DNA分子发生聚集沉淀,带负电的磷酸基团裸露出来,通过钠离子与磁珠表面的羧基形成“盐桥”,或者也叫“电桥”,使得DNA吸附到磁珠表面。DNA越长,表面裸露出来带负电的磷酸基团越多,整条分子带的负电就更强,更容易吸附到磁珠,只需要较低浓度的PEG和NaCl,就可以回收;DNA越短,就需要更高浓度的PEG和NaCl,将其表面的水化层破坏得更彻底,裸露出来足够多带负电的磷酸基团,才能被磁珠吸附住,从而回收回来。但是,市售磁珠品牌均无法做到100%的回收率,加之cfDNA含量本身较低,片段筛选后一部分cfDNA势必会丢失。
发明内容
根据第一方面,一种实施例中提供一种计算样本建库投入量的方法,包括:根据如下公式计算样本建库投入量Input:
Input=Z*(X/Y)…(I)
其中,Z为投入系数,X为样本中m1 bp~m2 bp片段的面积积分值,Y为m3 bp~m4 bp片段的面积积分值,m1<m2,m3<m4,m2>m4。
根据第二方面,一种实施例中提供一种建库方法,包括对游离DNA样本进行质量控制,检测得到样本中m1 bp~m2 bp片段的面积积分值X,m3 bp~m4 bp片段的面积积分值Y,m1<m2,m3<m4,m2>m4,使用第一方面所述方法计算样本建库投入量,根据计算得到的样本建库投入量,确定后续文库构建的起始投入量,然后按照该起始投入量构建得到可用于上机测序的文库。
依据上述实施例的计算样本建库投入量的方法及其建库方法,通过提高建库投入量,将cfDNA的投入比例提高,避免了片段筛选带来的丢失,提高了cfDNA检测的准确性。
附图说明
图1为实施例1的LabChip生物分析仪设置界面示意图;
图2为实施例1的Aglient 2100生物分析仪设置界面示意图;
图3-图8为实施例1的部分样本LabChip质控峰图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下,本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述,这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没,而对于本领域技术人员而言,详细描述这些相关操作并不是必要的,他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”,如无特别说明,均包括直接和间接连接(联接)。
cfDNA主要来源于核基因组,其片段长度集中在166bp左右,不同细胞释放到血液中的cfDNA的长度有所不同。研究者们从200个癌症病人中收集了344份血浆样本(包括18种不同类型的癌症),并收集了65个健康人的血清样本作为对照。提取这些血浆样本中的cfDNA后,分析发现癌症突变的ctDNA片段普遍比核小体DNA片段(167bp)短20-40bp,在90-150bp区间富集,还有些在250-320bp之间富集(这可能是肿瘤细胞的双核小体片段)。通过测序发现在90-150bp区间中,ctDNA的丰度明显提高。这说明可以通过富集短片段的方法提高ctDNA的丰度,进而能提高检测的灵敏度和准确性。用这种片段选择性测序的方法检测癌症病人的肿瘤进展,发现比CT成像提前了60天检测了肿瘤进展,而比未经过片段选择性的液体活检提前了89天。通过片段特异富集进行液体活检的方法,可以更早更灵敏地检测肿瘤,这对于肿瘤的治疗有重要意义。目前,绝大多数提取cfDNA的样本均为血浆,但是样本的保存和cfDNA检测试剂盒是分离的,而样本的保存好坏是直接影响检测结果的重要因素。cfDNA降解破坏、血液中血细胞的破损导致基因组DNA对cfDNA的污染都会直接导致检测结果不准确。
本文中,cfDNA简称循环核酸(circulating free DNA),亦称游离DNA,是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。
根据第一方面,在一些实施例中,提供一种计算样本建库投入量的方法,包括:根据如下公式计算样本建库投入量Input:
Input=Z*(X/Y)…(I)
其中,Z为投入系数,X为样本中m1 bp~m2 bp片段的面积积分值,Y为m3 bp~m4 bp片段的面积积分值,m1<m2,m3<m4,m2>m4。
在一些实施例中,所述m1为50-100。
在一些实施例中,所述m2为30000-40000。
在一些实施例中,所述m3为50-100。
在一些实施例中,所述m4为300-600。
在一些实施例中,所述Z的取值为45~55,Z值为经验值,通常可根据大量样本实验后确定。Z的取值可以包括但不限于45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55等等,优选为50。
在一些实施例中,所述X、Y是通过毛细管电泳分析得到。
在一些实施例中,所述X、Y为对应片段的浓度。浓度是有生物分析仪根据片段的面积积分值换算得到,X、Y为对应片段的浓度时,X与Y的比值等同于X、Y为对应片段的面积积分值时的比值。在一些实施例中,所述X、Y是由生物分析仪通过毛细管电泳分析得到。
在一些实施例中,所述生物分析仪包括但不限于Aglient和Caliper公司联合生产的LabChip生物分析仪或者Aglient公司生产的2100生物分析仪。
在一些实施例中,所述样本为游离DNA样本。
在一些实施例中,所述游离DNA样本来源于体液样本。
在一些实施例中,所述体液样本包括但不限于血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液、囊液(囊肿组织中的积液)中的至少一种。通常是使用商业化的试剂盒从体液样本中分离出游离DNA,获得游离DNA样本。
根据第二方面,在一些实施例中,提供一种建库方法,包括对游离DNA样本进行质量控制,检测得到样本中m1 bp~m2 bp片段的面积积分值X,m3 bp~m4 bp片段的面积积分值Y,m1<m2,m3<m4,m2>m4,使用第一方面所述方法计算样本建库投入量,根据计算得到的样本建库投入量,确定后续文库构建的起始投入量,然后按照该起始投入量构建得到可用于上机测序的文库。
在一些实施例中,如果计算得到的投入量≤建库投入量最大值,且游离DNA样本量<计算得到的投入量,则以所有的游离DNA样本量作为后续文库构建的起始投入量,将所有的游离DNA样本投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库。
在一些实施例中,如果计算得到的投入量≤建库投入量最大值,且游离DNA样本量≥计算得到的投入量,则以计算得到的投入量作为后续文库构建的起始投入量,从游离DNA样本中选取对应量的游离DNA样本,投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库。此处的对应量是指计算得到的投入量。
在一些实施例中,如果计算得到的投入量>建库投入量最大值,且游离DNA样本量≥计算得到的投入量,则以建库投入量最大值作为后续文库构建的起始投入量,从游离DNA样本中选取对应量的游离DNA样本,投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库。
在一些实施例中,如果计算得到的投入量>建库投入量最大值,且游离DNA样本量<计算得到的投入量,则以所有的游离DNA样本量作为后续文库构建的起始投入量,将所有游离DNA样本全部投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库。
在一些实施例中,所述建库投入量最大值与建库试剂和/或建库体系所允许的最大投入量一致。建库试剂或者建库体系所允许的最大投入量是指从提取游离DNA到构建得到可用于上机测序的文库这一过程中,各个环节的建库试剂和/或建库体系所允许的最大投入量。
在一些实施例中,所述建库投入量最大值为80ng。
通常,提取的游离DNA样本量都大于计算得到的投入量,也即是说,提取的游离DNA样本量大于建库需求量。
在一些实施例中,所述游离DNA样本是由体液样本分离得到。
在一些实施例中,从体液样本中分离得到游离DNA样本的方法包括:对体液样本进行离心处理,收集上清液,然后使用提取试剂盒从所述上清液中提取得到游离DNA样本。提取试剂盒可从市场上购买得到,包括但不限于MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit(购自Thermo Fisher公司)试剂盒,提取后的游离DNA回溶于无核酸酶的纯水中,然后进行定量检测、文库构建等步骤。
在一些实施例中,从所述上清液中分离得到游离DNA样本的方法包括但不限于氯仿苯酚抽提法、磁珠提取法等等,从所述上清液中分离得到游离DNA样本的方法为本领域的常规方法,本领域技术人员可以根据需要选择合适的分离方法。通常使用商业化的试剂盒从所述上清液中分离得到游离DNA样本。
在一些实施例中,确定后续文库构建的起始投入量后,按照该起始投入量构建得到可用于上机测序的文库的方法依次包括:末端修复及加“A”、接头连接、PCR扩增、杂交捕获、洗脱、产物纯化,获得可用于上机测序的文库。此处仅仅是示例性列举,本领域技术人员可以在此基础上增加、减少、改变部分操作环节。
针对现有技术存在的问题,在一些实施例中,本发明提供了一种针对存在大片段污染的cfDNA的建库方法。该方法针对大片段污染的cfDNA在建库前,无需对cfDNA进行片段筛选处理。在不丢失cfDNA片段的情况下,完成cfDNA的测序,实现对所检测cfDNA所属的个体的生理状态的判断。
在一些实施例中,为了实现上述方案,本发明对提取得到的cfDNA进行LabChip分析,得到80bp-40000bp片段的面积积分值X,得到80bp-510bp片段面积积分值Y。则在建库时投入量Input计算公式如下所示:
Input=Z*(X/Y)…(I)
其中,Z为投入系数,Z的取值范围在45-55之间。若提取总量小于Input量,则将所有的提取DNA投入建库;建库投入量最大值为80ng,若Input计算值大于80ng,建库投入量按80ng进行建库。通过提高建库投入量,将cfDNA的投入比例提高,避免了片段筛选带来的丢失,提高了cfDNA检测的准确性。
在一些实施例中,包括以下步骤:
1)样本处理;
2)游离DNA的分离;
3)LabChip质控;
4)计算建库投入量。
其中,步骤1)中所述样本类型包括:血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液、囊液。上述样本需放入离心机,1600ng转速下离心10分钟,取得到的上清溶液,将上清溶液转移至新5mL离心管中,再次放入离心机,16000g转速下离心10分钟,得到上清可用于下一步的提取。
其中,步骤2)中所述游离DNA的分离为运用各种方式的血液游离DNA的分离,如传统的氯仿苯酚抽提法、磁珠提取法等,使用各种提取试剂盒,比如QIAamp RNA Blood MiniKit(QIAGEN)、QIAamp DSP DNABlood Mini Kit(QIAGEN)等,在一实施例中,可采用MagMAXCell-Free DNA Isolation Kit(Thermo Fisher)试剂盒进行游离DNA的提取。
其中,步骤(3)中使用Aglient和Caliper公司联合生产的LabChip生物分析仪或者Aglient公司生产的2100生物分析仪进行毛细管电泳。通过毛细管电泳分析得到不同片段长度的DNA的片段分布及其含量。通过设置软件参数可以得到80bp-40000bp片段的面积积分值X,以及80-510bp片段面积积分值Y。
其中,步骤(4)中计算公式如上所述,计算得到建库投入量,投入量范围在50ng-80ng之间。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明
实施例1
本实施例提供基于cfDNANGS的肿瘤检测方法。
实验材料和方法如下:
样本收集:在福建省肿瘤医院医院的帮助下共得到10份全血样本(各全血样本体积均为10mL),从湖南肿瘤医院得到两例脑脊液(两例样本的体积均为10mL)样本,北京肿瘤医院得到一例腹水上清样本(10mL),样本类型及编号见表1。
表1样本编号及送检单位统计表
送检医院 | 样本编号 | 送检医院 | 样本编号 | 送检医院 | 样本编号 |
广东省人民医院 | 209019329 | 广东省人民医院 | 209019334 | 湖南省肿瘤医院 | 200024986 |
广东省人民医院 | 209019330 | 广东省人民医院 | 209019335 | 湖南省肿瘤医院 | 200030784 |
广东省人民医院 | 209019331 | 广东省人民医院 | 209019336 | 北京肿瘤医院 | 190039774 |
广东省人民医院 | 209019332 | 广东省人民医院 | 209019337 | ||
广东省人民医院 | 209019333 | 广东省人民医院 | 209019338 | ||
广东省人民医院 | 209019334 | 广东省人民医院 | 209019339 |
上述样本在1600×g的离心力(即向心加速度为1600倍的重力加速度)下离心10分钟,取得到的上清溶液,上清溶液采用MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit(购自ThermoFisher公司)试剂盒进行游离DNA的提取,最后将游离DNA回溶于60μL无核酸酶的纯水中。
利用LabChip生物分析仪或Aglient 2100生物分析仪进行游离DNA片段大小的质检,本实施例是使用LabChip生物分析仪进行质量控制,通过设置软件统计参数,得到80bp-40000bp片段的面积积分值X,以及80-510bp片段面积积分值Y,如图1所示为LabChip生物分析仪设置界面示意图,图2为Aglient 2100生物分析仪设置界面示意图,Aglient 2100生物分析仪的检测原理与LabChip生物分析仪相同。
图3-图8为本实施例部分样本LabChip质控峰图,具体地,图3为样本209019329的LabChip质控峰图;图4为样本209019330的LabChip质控峰图;图5为样本209019335的LabChip质控峰图;图6为样本209019337的LabChip质控峰图;图7为样本200030784的LabChip质控峰图;图8为样本190039774的LabChip质控峰图;图3-图8中,横坐标为片段长度(bp),纵坐标为荧光值(Fluorescence)。
利用式(I)所示公式,本实施例的Z的取值为50,计算游离DNA建库投入量,数值如下表2所示。
表2游离DNA建库投入量统计表(LabChip)
按照表2中的建库实际投入量,进行后续的建库步骤,建库步骤具体如下:
(1)末端修复及加“A”
提前将NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer和NEBNext Ultra II EndPrep Enzyme Mix置于冰盒,待试剂溶解后振荡混匀并离心。按照表3配制末端修复及加“A”反应体系(Mix1),振荡混匀并离心。
表3Mix1配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer | 7 |
NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix | 3 |
总体积 | 10 |
Mix1体系是置于冰盒上配制。
配置后的Mix1按照每个反应10μL,依次分装至50μL DNA样本中,振荡混匀并离心。按照表4反应条件在恒温混匀仪或PCR仪上孵育。孵育完成后,降至室温,高速离心机短暂离心,将蒸发起的液滴收集入管内。
表4末端修复及加“A”反应程序
(2)接头连接
将溶解后的NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、NEBNext LigationEnhancer及MGI(深圳华大智造科技股份有限公司,简称“华大智造”,英文名称为MGI)通用接头振荡混匀并离心。向样本中单独加入2μL接头工作液并吹打混匀。按照表5配制接头连接反应体系(Mix 2),充分振荡混匀并离心后按照每个反应31μL于冰上分装至各反应管,振荡混匀并离心后将反应管置于恒温混匀仪20℃,孵育15min。
接头寡核苷酸链1(正向接头序列,5’-3’):
GGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNST(SEQ ID NO.1);
接头寡核苷酸链2(反向接头序列,5’-3’):
/5hos/SNNNNNAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAA(SEQ ID NO.2)。
上述序列中,“/5Phos/”表示5’端磷酸化修饰,“S”表示G/C两种碱基中的任一种碱基”,“N”表示A、T、G、C四种碱基中的任一种碱基;“NNNNN”表示正义分子标签以及与正义分子标签互补的反义分子标签。
表5Mix2配制表
Mix2体系是置于冰盒上配制而成。
(3)连接反应后纯化
向每个反应管中加入87μL AMPure XP磁珠,振荡混匀后,室温孵育10min。孵育结束,将离心管短暂离心并置于磁力架上至澄清,弃上清。保持离心管于磁力架上,向各离心管中依次加入400μL体积分数为80%的乙醇水溶液,关紧管盖颠倒漂洗3次,弃上清,重复漂洗一次。第二次漂洗弃上清后,将离心管短暂离心,用20μL移液器吸去离心管中残余液体。将离心管打开盖子置于磁力架上晾干至磁珠表面哑光。从磁力架上取下离心管,加入22μLTE缓冲液(pH 8.0),用移液器将磁珠与TE吹打混匀,室温下孵育5min。孵育结束,将离心管短暂离心,置于磁力架上至完全澄清。将上清纯化产物(即Adapter-Ligated library)转移到新的1.5mL离心管中备用。
(4)捕获前PCR(Non-C-PCR)
提前将含有双index接头引物的工作液及2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix置于室温解冻,解冻后试剂振荡混匀并离心。按照表6,依次向PCR管中添加对应反应组分并混匀离心。将样本置于PCR仪中,按照表7程序进行PCR扩增。对比例与实施例中同一样本使用相同的双index接头引物工作液。
表6Non-C-PCR Mix配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
含有正向接头引物的工作液(10μM) | 2.5 |
含有反向接头引物的工作液(10μM) | 2.5 |
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
Adapter-Ligated library | 20 |
总体积 | 50 |
表7Non-C-PCR反应程序
(5)Non-C-PCR产物纯化
使用45μL AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化,最终溶解在31μL TE缓冲液(pH8.0)中(操作流程同步骤(3))。将纯化产物转移至全新的1.5mL离心管中用于文库质控、杂交或置于-20℃保存。本实施例所使用的TE缓冲液的组成如下:1mM Tris-HCl、1mM EDTA,余量为水,pH=8.0。mM是指mmol/L。
(6)蒸干Mix配制
将含双index接头封阻序列的工作液、Cot-1 DNA(Human Cot-1 DNATM-Fluorometric QC InvitrogenTM)和待杂交文库置于4℃解冻。融化后震荡混匀并离心,按照表8加入1.5mL离心管中,震荡混匀并离心。
表8蒸干Mix配制表
具体的双index接头封阻序列的设计方法参见申请号为202011061421.7的中国发明专利《特异分子标签UMI组、混合特异分子标签接头及应用》的实施例4,或者参见申请号为202010334969.8的中国发明专利《基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系》的实施例3。
设计的双index接头封阻序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
蒸干Mix管盖扎洞,置于真空浓缩仪中60℃浓缩蒸干,蒸干后使用封口膜封闭管盖上的孔。蒸干过程中将待杂交探针置于4℃解冻。将xGen 2X Hybridization Buffer、xGenHybridization Buffer Enhancer置于室温溶解,并振荡离心。
(7)按照表9配制变性体系(Mix),振荡混匀后分装至蒸干的混合物中,充分振荡混匀并离心,置于恒温混匀仪上95℃变性10min。
表9变性体系配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
xGen 2X Hybridization Buffer | 8.5 |
xGen Hybridization Buffer Enhancer | 2.7 |
Nuclease-Free Water | 1.8 |
总体积 | 13 |
样本文库变性完成前2-3分钟,将溶解的探针分装至0.2mL PCR管中,每个反应探针用量4μL;变性完成后,将样本文库用高速离心机全速离心1min,后快速转移至PCR管中,振荡离心。
(8)将PCR管置于PCR仪上65℃杂交过夜(热盖温度75℃)。
(9)过夜孵育后进行洗脱实验。洗脱实验前,提前至少30分钟从-20℃冰箱中取出Wash BufferⅡ、Ⅲ、Stringent Wash Buffer和Bead Wash Buffer原液,室温解冻,按照表10中单反应体系用量配制浓度为1×的洗脱工作液并置于对应温度环境下提前预热。将M-270磁珠和AMPure XP磁珠置于室温平衡。
表10 1×洗脱工作液配制量
组分 | 单反应体系使用量(μL) |
xGen 10×Stringent Wash Buffer | 400(65℃) |
xGen 10×Wash BufferⅠ | 100(65℃)+200(RT) |
xGen 10×Wash BufferⅡ | 200 |
xGen 10×Wash BufferⅢ | 200 |
xGen 2×Bead Wash Buffer | 500 |
(10)平衡至室温的M-270磁珠充分振荡混匀后,吸取20μL到新的1.5mL离心管中,上磁力架吸弃上清。从磁力架上取下,使用200μL 1×Bead Wash Buffer漂洗磁珠3次,最后一次吸弃上清后加100μL 1×Bead Wash Buffer重悬磁珠并转移至新的0.2mL PCR管中备用。
(11)将装有磁珠的PCR管上磁力架吸弃上清,将过夜孵育的杂交体系转移至磁珠管中震荡混匀并置于65℃PCR仪(热盖75℃)中孵育45分钟。孵育期间每隔15分钟取出反应管快速震荡混匀1次。
(12)按照表11试剂顺序、用量和次数进行磁珠漂洗。
表11磁珠漂洗顺序及方法
组分 | 单管反应体积(μL) |
1×Wash BufferⅠ(65℃) | 加100μL,吹打混匀,转1.5mL离心管,弃上清 |
1×Stringent Wash | 加200μL,振荡混匀后65℃孵育5min,弃上清;洗涤两次 |
1×Wash BufferⅠ(RT) | 加200μL,RT振荡孵育2min,弃上清 |
1×Wash BufferⅡ(RT) | 加200μL,RT振荡孵育1min,弃上清 |
1×Wash BufferⅢ(RT) | 加200μL,RT振荡孵育30s,弃上清 |
Nuclease-Free Water | 21μL重悬磁珠 |
(13)提前将2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix和杂交后PCR引物置于4℃解冻,并充分振荡混匀离心。按照表12配制杂交后PCR Mix备用。
表12杂交后PCR Mix配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
GF Primer(10μM) | 2.5 |
GR Primer(10μM) | 2.5 |
总体积 | 30 |
PCR引物具体如下:
GF Primer:/5Phos/TCTCAGTACGTCAGCAGTT(SEQ ID NO.3);
GR Primer:GGCATGGCGACCTTATCAG(SEQ ID NO.4)。
(14)将20μL漂洗后重悬磁珠转移至杂交后PCR Mix中,移液器吹打混匀后置于PCR仪中,运行表13程序进行杂交后PCR。
表13杂交后PCR反应程序
(15)使用60μL AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化,最终溶解在31μL TE缓冲液(pH8.0)中(操作流程同步骤3)。纯化后的文库用于文库质控、测序或置于-20℃保存。
对比例1
实验材料和方法如下:
样本收集:选择与实施例1相同的样本
上述样本在1600ng转速下离心10分钟,取得到的上清溶液,上清溶液采用MagMAXCell-Free DNA Isolation Kit(购自Thermo Fisher)试剂盒进行游离DNA的提取,最后将游离DNA回溶于60μL无核酸酶的纯水中。
本对比例中所有样本建库投入量均为固定值50ng。建库方法均与实施例1完全相同。
实施例1与对比例1均由MGI平台T7测序,在截取相同数据量后计算两者的平均测序深度和基因突变检出个数,比较两种方案对应指标的差异。对比数据如下表所示。
表14对比例1与实施例1测序深度及基因检出个数对比
表14中,测序深度是指基因组的某一区域被重复检测的次数。深度越高,检测结果越可信。
从表14的实验结果可以发现,比较实施例1与对比例1的平均深度、基因检出个数,本发明实施例1进行文库投入计算后再进行建库,总体而言,实施例1的平均深度大于对比例1,基因检出个数也多于对比例1,因此,在平均测序深度和基因检出个数方面,实施例1均显著优于对比例1的文库体系。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
<110> OrganizationName : 北京吉因加医学检验实验室有限公司
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<120> Title : 一种计算样本建库投入量的方法及其建库方法
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Claims (10)
1.一种计算样本建库投入量的方法,其特征在于,包括:根据如下公式计算样本建库投入量Input:
Input=Z*(X/Y)…(I)
其中,Z为投入系数,X为样本中m1 bp~m2 bp片段的面积积分值,Y为m3 bp~m4 bp片段的面积积分值,m1<m2,m3<m4,m2>m4。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述m1为50~100,所述m2为30000~40000,所述m3为50~100,所述m4为300~600。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Z的取值为45~55。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述Z的取值为50。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述X、Y是由生物分析仪通过毛细管电泳分析得到;
和/或,所述X、Y为对应片段的浓度;
和/或,所述生物分析仪选自LabChip生物分析仪、Aglient 2100生物分析仪中的至少一种。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本为游离DNA样本;
和/或,所述游离DNA样本来源于体液样本;
和/或,所述体液样本选自血液、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液、囊液中的至少一种。
7.一种建库方法,其特征在于,包括对游离DNA样本进行质量控制,检测得到样本中m1bp~m2 bp片段的面积积分值X,m3 bp~m4 bp片段的面积积分值Y,m1<m2,m3<m4,m2>m4,使用权利要求1-6任意一项所述方法计算样本建库投入量,根据计算得到的样本建库投入量,确定后续文库构建的起始投入量,然后按照该起始投入量构建得到可用于上机测序的文库。
8.如权利要求7所述的建库方法,其特征在于,如果计算得到的投入量≤建库投入量最大值,且游离DNA样本量<计算得到的投入量,则以所有的游离DNA样本量作为后续文库构建的起始投入量,将所有的游离DNA样本投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库;
和/或,如果计算得到的投入量≤建库投入量最大值,且游离DNA样本量≥计算得到的投入量,则以计算得到的投入量作为后续文库构建的起始投入量,从游离DNA样本中选取对应量的游离DNA样本,投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库;
和/或,如果计算得到的投入量>建库投入量最大值,且游离DNA样本量≥计算得到的投入量,则以建库投入量最大值作为后续文库构建的起始投入量,从游离DNA样本中选取对应量的游离DNA样本,投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库;
和/或,如果计算得到的投入量>建库投入量最大值,且游离DNA样本量<计算得到的投入量,则以所有的游离DNA样本量作为后续文库构建的起始投入量,将所有游离DNA样本全部投入建库反应体系中,构建得到可用于上机测序的文库。
9.如权利要求7所述的建库方法,其特征在于,所述建库投入量最大值与建库试剂和/或建库体系所允许的最大投入量一致;
和/或,所述建库投入量最大值为80ng;
和/或,所述游离DNA样本是由体液样本分离得到;
和/或,从体液样本中分离得到游离DNA样本的方法包括:对体液样本进行离心处理,收集上清液,然后使用提取试剂盒从所述上清液中提取得到游离DNA样本。
10.如权利要求7所述的建库方法,其特征在于,确定后续文库构建的起始投入量后,按照该起始投入量构建得到可用于上机测序的文库的方法依次包括:末端修复及加“A”、接头连接、PCR扩增、杂交捕获、洗脱、产物纯化,获得可用于上机测序的文库。
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