CN110484532A - Dna二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒 - Google Patents

Dna二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒。其中，该构建方法包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。应用本发明的技术方案，基于酶切进行片段化并联用单链建库的方法来构建FFPE样本NGS测序文库，简单阐述为：使用酶切的方法对FFPE DNA进行片段化，之后无需对反应产物进行纯化，直接利用单链建库方法构建测序文库，该方法能够对低起始量、样本降解严重的FFPE样本进行建库，提高建库成功率以及原始模版检出数量。

Description

DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒。
背景技术
FFPE(formalin-fixed paraffin embedded，福尔马林固定和石蜡包埋)样本存在样本量低，样本中DNA降解严重等特点，这些特点使得FFPE样本极易建库失败。在常规的双链建库中，损伤的DNA在接头连接后进行PCR扩增的过程中会丢失，从而使得大量模版丢失。而单链建库首先将双链DNA进行变性形成单链，在这个过程中损伤DNA也可以形成片段化的单链DNA，然后进行单链接头的连接，进而最大程度的减少原始模版的损失。
目前的文库构建，由于测序仪器的读长限制，需要文库的插入片段长度有一定的限制，这就要求对原始模版进行片段化。目前片段化的方法主要有两种：一种是利用超声打断的方式获得片段化的DNA，一种是利用酶切的方法对DNA进行切割。这两种方法都是对DNA进行处理，处理后都需要进行纯化。而任何纯化/操作都将损失部分原始DNA。
KAPA公司有一款基于酶切的方法进行文库构建的试剂盒，该试剂盒可以对DNA进行酶切，并无需对酶切产物进行纯化，之后直接进行双链建库。该方法在一定程度上减少原始模版片段化的损失，但是无法避免损伤的DNA分子在建库中的丢失。
目前常用的测序文库构建方法均是双链建库。另外基于插入片段的打断方法，原始模版在片段化后都需要进行纯化以获得所需的目的片段大小的DNA，这一过程会损失一定量的DNA，对于FFPE样本，DNA模版损失越多，建库失败概率越大。
发明内容
本发明旨在提供一种DNA二代测序文库及其构建方法、构建试剂盒，以解决现有技术中降解严重FFPE样本建库极易因DNA数量低而失败的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种DNA二代测序文库的构建方法。该构建方法包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。
进一步地，DNA样本为FFPE样本提取的DNA。
进一步地，基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库为swift单链建库方法。
进一步地，swift单链建库方法包括模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和index PCR扩增及产物纯化。
根据本发明的另一方面，提供了一种DNA二代测序文库。该DNA二代测序文库通过上述任一种DNA二代测序文库的构建方法构建得到。
根据本发明的再一方面，提供了一种DNA二代测序文库的构建试剂盒。该构建试剂盒包括酶切相关的试剂和基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库的试剂。
应用本发明的技术方案，基于酶切进行片段化并联用单链建库的方法来构建FFPE样本NGS测序文库，简单阐述为：使用酶切的方法对FFPE DNA进行片段化，之后无需对反应产物进行纯化，直接利用单链建库方法构建测序文库，该方法能够对低起始量、样本降解严重的FFPE样本进行建库，提高建库成功率以及原始模版检出数量。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明一实施方式的DNA二代测序文库构建方法的流程示意图；以及
图2示出了实施例1的C级两个FFPE样本不同方法的结果比较示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中降解严重FFPE样本建库极易因DNA数量低而失败的技术问题，本申请提出了下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种DNA二代测序文库的构建方法。该方法包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。
本发明联用酶切片段化DNA的方法和单链建库的方法，最大程度的保护原始DNA模版，使得低起始量以及降解严重的FFPE样本能够有更高的建库成功率以及更高的原始模版检出率。
典型的，本发明用于NGS测序文库构建的主要步骤如下：1)对FFPE DNA进行酶切片段化；2)单链文库构建。其中，典型的，基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库为swift单链建库方法。swift单链建库方法包括模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和index PCR扩增及产物纯化。当然，此步骤也可以通过其他类似的方法实现。
在本申请中，各试剂可采用本领域的商业化试剂，例如，酶切可以使用KAPA Fragkit中的酶进行反应，获得片段化的DNA。对酶切后的反应体系不进行纯化，避免片段化的DNA模版损失，直接进行后续的建库。建库方法中对模版DNA进行变性，获得单链DNA并进行单链接头连接等步骤，最后构建可用于常规测序的双链文库。
在本发明一种典型的实施方式中，具体步骤详见图1：DNA片段化(酶切方法打断DNA)、终止酶切反应、swift单链建库以及panel捕获(注：1、虚线所示部分为本实验优化的步骤，表示不进行反应液的纯化，直接进行后续实验步骤。2、panel捕获为验证NGS测序文库建库效果而进行的)，其中，swift单链建库主要包括：模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和index PCR扩增及产物纯化。
本方法结合了酶切片段化DNA及单链建库的文库构建方法，提供了一种可供选择的建库流程，能够对FFPE样本进行文库构建并获得更高的建库成功率及更高的原始模版检出率。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA二代测序文库。该DNA二代测序文库通过上述DNA二代测序文库的构建方法构建得到。
根据本发明一种典型的实施方式，一种DNA二代测序文库的构建试剂盒。该试剂盒包括酶切相关的试剂和基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库的的试剂。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
在本实施例中，主要工作分为两部分，即第一部分实验部分和第二部分数据分析部分。在第一部分中，待检的样本是FFPE判定为C级的样本(等级判定方法如下：A级，有主带或降解均匀且降解区域主要集中在5000bp以上；B级，无主带，降解均匀且降解区域主要集中在1500-5000bp之间；C级，无主带，降解均匀且降解区域主要集中在500-1500bp之间；D级，无主带，降解区域弥散在250-1000bp或集中在500bp以下)。
在本实施例中，主要试剂用品是市售的，信息如下表1所示：
表1
操作步骤如下：
一：DNA片段化(参考KAPA Frag kit说明书)
1.片段化处理25ng样本使用0.5×反应体系，10ng样本使用0.3×反应体系，配置反应体系如下表2。
表2
试剂 0.5×反应体系 0.3×反应体系
DNA样品 25ng 10ng
片段化缓冲液(10×) 2.5μL 1.5μL
片段化酶(10×) 5μL 3μL
无核酸酶水 补齐至25μL 补齐至15μL
2.混匀样品后进行如下表3中的反应：
表3
3.反应结束后置于预热的65℃ PCR仪上反应30min，进行酶失活。
4.反应结束使用真空浓缩仪将样本体积浓缩至15μL后进行后续单链建库的实验操作。
二：单链建库(参考ACCEL-1S PLUS DNA LIBRARY KIT说明书)
(一)变性
1.由于变性时间很短，所以应先配好下一步所用的试剂(配好后放置在冰上)，再进行以下实验。
2.预热PCR仪到95℃，将片段化好的DNA转移到0.2mL的PCR管中，如果体积不合适，则利用低EDTA TE将样品体积补齐至15μL。
3.95℃孵育2min(热盖开启)。
4.完成后迅速置于冰上2min。。
(二)单链连接
1.将PCR仪设置为以下表4中的程序，并在预热到37℃时暂停在该步骤。
表4
2.向每个管中加入预混好的接头反应混合液如表5所示，轻柔混匀。轻甩后放入PCR仪中进行反应(热盖开启)。
表5
试剂 体积
低EDTA TE 11.5μL
缓冲液G1 4μL
缓冲液G2 4μL
缓冲液G3 2.5μL
酶G4 1μL
酶G5 1μL
酶G6 1μL
(三)延伸及产物纯化
1.将PCR仪设置为以下表6中的程序，并在预热到98℃时暂停在该步骤。
表6
2.向含有40μl的反应液中加入47μl预混好的混合液(体系如下表7)：
表7
3.轻轻混匀，轻甩后放入PCR仪中进行反应(热盖ON)。
4.将反应结束的样品转移到1.5mL的离心管中，进行1.2×磁珠清洗(常规操作)。
若不立即进行后续实验则4℃保存。
(四)二链接头连接及产物纯化
1.向新洗脱的反应液中加入20μL预混好的混合液(表8)。注意：酶B3在使用前加入。
表8
试剂 体积
低EDTA TE 4μL
缓冲液B1 4μL
试剂B2 10μL
酶B4 2μL
2.轻柔混匀，轻甩后放入PCR仪中，进行如下反应(热盖开启)。
25℃，15分钟，
4℃，保温
3.将反应结束的样品转移到1.5mL的离心管中，进行1.0×磁珠清洗(常规操作)。
若不立即进行后续实验则4℃保存。
(五)Index PCR扩增及产物纯化
1.向洗脱反应液中加入5μl合适的index PCR引物。
2.向反应液中加入25μl预混好的PCR反应混合液(表9)。注意：酶W4在使用前加入。
表9
试剂 体积
低EDTA TE 10μL
试剂W2 4μL
缓冲液W3 10μL
酶W4 1μL
3.轻柔混匀，轻甩后放入PCR仪中，进行如下表10所示的反应(热盖开启)。
表10
4.将反应结束的样品转移到1.5ml的离心管中，进行0.85×磁珠清洗(常规操作)。使用51μl EB洗脱。
5.取1μl中间文库Qubit测定浓度。
三：杂交捕获
1.取出500ng扩增产物，使用浓缩仪将扩增产物体积浓缩到4.4μL，然后进行封闭和探针杂交，杂交反应体系如下表11所示。
表11
杂交反应条件如下表12所示：
表12
2.使用链霉亲合素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将50μL T1磁珠加入1.5mL离心管，置于磁力架上，弃上清，用200μL结合缓冲液清洗三遍后，使用200μL结合缓冲液重悬磁珠，将与探针杂交的样品加入磁珠，混匀仪上颠倒混匀30min，置于磁力架上，弃上清，用W1清洗1遍，然后用预热到65℃的W2清洗3遍，期间保证磁珠和W2的温度在65℃。最后置于磁力架上，弃上清，加入38μL NFW，重悬磁珠。
3.将磁珠捕获到的DNA片段进行PCR扩增，扩增体系见下表13，得到足量的加上接头的DNA片段，基本步骤如下：先在98℃预变性2min，其次在98℃变性30s，然后在60℃退火30s，72℃延伸1min；重复变性退火延伸过程14次；最后在72℃延伸5min，结束反应。
表13
试剂 体积
高保真DNA聚合酶 1μL
扩增引物 1μL
高保真DNA聚合酶反应混和液 10μL
单核苷酸混合液 0.5μL
磁珠上的目标区域DNA 37.5μL
4.将得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，然后利用qPCR定量，利用2100进行片段大小检测。
5.测序，在x-ten基因测序仪上完成测序。
第二部分，数据分析
样本检测结果为：图2示出了C级两个FFPE样本(样本1和样本2)不同方法的结果比较(panel为NovoPM1.0,诺禾致源)。比较了其他方法(covaris打断纯化DNA模版之后进行swift单链建库)与本发明方法建库之后同一数据量下的测序深度。可以明显看出，25ng起始量下，本发明方法的平均测序深度更高。
表14示出了C级两个FFPE样本不同起始量建库结果(WES)。
表14
说明使用本发明的方法，能够对C级FFPE样本成功建库并应用于后续WES的测序分析。
表15示出了超低起始量C级FFPE样本建库结果比较。
表15
说明本发明的方法可以对超低起始量DNA进行成功建库，其中间文库较covaris打断纯化后再进行swift单链建库具有更高的产量。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明联用酶切片段化DNA的方法和单链建库的方法，最大程度的保护原始DNA模版，使得低起始量以及降解严重的FFPE样本能够有更高的建库成功率以及更高的原始模版检出率。
本发明经过C级FFPE样本进行验证，分别使用25ng/10ng/1ng/0.5ng起始量进行验证，与其他方法(超声打断回收)相比，该发明的方法具有更高的文库产出量以及更高的原始模版检出。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种DNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将DNA样本通过酶切的方法获得片段化的原始模版DNA，然后无需纯化酶切反应液，直接将酶切产物进行基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述DNA样本为FFPE样本提取的DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库为swift单链建库方法。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述swift单链建库方法包括模版变性、单链接头连接、延伸及产物纯化、二链接头连接及产物纯化和index PCR扩增及产物纯化。
5.一种DNA二代测序文库，其特征在于，通过如权利要求1至4中任一项所述的DNA二代测序文库的构建方法构建得到。
6.一种DNA二代测序文库的构建试剂盒，其特征在于，包括酶切相关的试剂和基于单链接头连接的方法构建DNA二代测序文库的试剂。
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