CN108624666B - 用于构建测序文库的接头核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种用于构建测序文库的接头核酸分子。该核酸分子包括第一核酸链，所述第一核酸链包含PCR反应断点，所述PCR反应断点包括选自下列的至少之一：(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及(2)DNA聚合酶不识别位点。本申请所述的接头核酸分子可以应用于低起始量样品的建库，适应更宽的mRNA含量的变化。利用本申请所述的接头核酸分子进行构建测序文库，能够有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。

Description

用于构建测序文库的接头核酸分子
技术领域
本发明涉及生物测序领域，具体地，本发明涉及用于构建测序文库的接头核酸分子，更具体地，本发明涉及构建测序文库的接头核酸分子、构建测序文库的方法、测序文库、核酸样本测序方法、构建测序文库的设备以及用于对核酸样本进行测序的系统。
背景技术
Illumina公司的Truseq RNA librarykit做RNA测序具有很好灵敏度，能适应很多物种的RNA建库，但是由于不同物种、生理、发育、组织、分化等条件下，其总RNA的mRNA含量会不一样，实践中当遇到某些样品的mRNA含量很低时，此kit的建库产物就会出现一些奇怪的产物。现阶段的RNA检测技术又难以特异性地对mRNA含量进行定量，特别是对于总RNA量本来就很少的样品来说，还面临检测灵敏度不够的问题。
因此，如何提高建库产物的质量以及如何提高测序的灵敏度是科学工作者拭待解决的关键问题。
发明内容
本申请是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的。
为调查尖峰形成原因，发明人在实验中模拟不同的mRNA含量，分别用200ng、20ng的UHRR(RNA标准品)起始mRNA量进行建库。发明人发现，20ng文库经Hiseq平台上测序后，文库测序碱基波动很大，测序质量很差。后经对文库测序的reads序列进行分析发现，这些“锯齿”状的尖峰实则为DNA接头的互连、自连接产物，而因接头互连、自连个数、组合方式的不同，而形成长短不一的产物，Agilent2100检测后就呈“ladder”状显现。已知接头长度约62nt，而实测这些“ladder”状的尖峰的长度间距也接近62nt。这些尖锋是建库所使用的DNA接头的不同个数、不同组合的连续互连、自连的产物。
但在测序中，有明显“ladder”峰的通常视为不合格，如果冒险尝试上机，则碱基波动很大，测序质量不好，接头序列(被视为empty-reads)数据占比高达30％以上。如果“ladder”峰的大小不明显而隐藏在文库里面，也会使测序时的碱基波动很大，严重影响测序质量，增加数据中的接头序列比例，影响有效数据的产出(empty-reads占比)。因此，文库中的接头互连、自连产物严重影响了测序质量，发明人需要进一步有效消除此成分，以此来提高测序质量。
而现有的消除接头互连、自连产物的方法包括(1)利用DNA片段长短的差别，通过电泳切胶分离法，去除引物二聚体，进而选择在一定长度范围的目的片段；(2)利用DNA片段长短的差别，通过磁珠的吸附，筛选去除二聚体、选择在一定长度范围的目的片段。但现有的方法(1)切胶操作低效，所需时间长，如电泳要2小时，切胶及产物回收需30分钟；(2)DNA接头互连、自连的产物，会因接头连接个数、组合不同而长度不一，大小相差约为62nt，产物长度会与目的文库的片段长度重叠，掺杂在一起，难以用片段长度差异筛选的原理进行分选。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的发明人通过巧妙地设计接头序列，利用核酸消化酶特异性识别碱基位点的原理或DNA聚合酶不识别特异性碱基位点的原理，实现有效清除文库中的接头互连、自连产物，从而降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。该清除步骤过程相比于现有技术，更加快速、简单，不需要切胶，不产生EB污染，并且能够有效消除了文库Agilent2100质检的互连、自连产物存在的导致数据质量差的隐患。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于构建测序文库的接头核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子包括第一核酸链，所述第一核酸链包含PCR反应断点，所述PCR反应断点包括选自下列的至少之一：(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及(2)DNA聚合酶不识别位点。本申请所述的接头核酸分子可以应用于低起始量样品的建库，适应更宽的mRNA含量的变化。利用本申请所述的接头核酸分子进行构建测序文库，能够有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测序的DNA片段与接头连接，以便获得连接产物，所述接头为前面所述的核酸分子；以及对所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增处理中，基于所述PCR反应断点，去除接头自连或互连产物。利用根据本发明实施例的构建测序文库的方法，可有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是根据前面所述的构建测序文库的方法获得的。本申请所述的测序文库中接头互连、自连产物被有效清除，本申请所述的测序文库应用于测序，可有效控制碱基的波动，提高测序质量，降低测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种核酸样品测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：基于所述核酸样本，利用前面所述的方法，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。利用本申请所述的测序方法，可有效控制碱基的波动，提高测序质量，降低测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建测序文库的设备。根据本发明的实施例，所述设备包括：连接装置，所述连接装置用于将待测序的DNA片段与接头连接，以便获得连接产物，所述接头为前面所述的接头核酸分子；以及扩增装置，所述扩增装置用于对所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增处理中，基于所述PCR反应断点，去除长度不大于预定阈值的扩增区域。利用根据本发明实施例的构建测序文库的设备，可有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种用于对核酸样本进行测序的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：文库构建设备，所述文库构建设备如前所述，所述文库构建设备用于基于所述核酸样本，构建测序文库；测序设备，所述测序设备用于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。利用本申请所述的测序系统，可有效控制碱基的波动，提高测序质量，降低测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
需要说明的是，本申请所述的PCR反应断点为核酸消化酶特异性识别位点或DNA聚合酶不识别位点，即核酸消化酶能够特异性识别该位点，从而核酸消化酶能够在该位点将核酸片段打断，或DNA聚合酶不能识别该位点，从而DNA聚合酶所介导的DNA聚合作用在该位点终止。
附图说明
图1是根据本发明实施例的构建测序文库的设备的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的扩增装置的结构示意图；
图3是根据本发明再一实施例的扩增装置的结构示意图；
图4是根据本发明再一实施例的构建测序文库的设备的结构示意图；
图5是根据本发明实施例的获得待测序的DNA片段装置的结构示意图；
图6是根据本发明实施例的反转录单元的结构示意图；
图7是根据本发明再一实施例的构建测序文库的设备的结构示意图；
图8是根据本发明实施例的核酸样本进行测序的系统的结构示意图；以及
图9是根据本发明实施例的实施例1文库检测结果图；
图10是根据本发明实施例的实施例1文库检测结果图；
图11是根据本发明实施例的改进前文库检测结果图；
图12是根据本发明实施例的实施例1的碱基分布和测序质量结果图；
图13是根据本发明实施例的改进前的碱基分布和测序质量结果图；以及
图14是根据本发明实施例的实施例2的碱基分布和测序质量结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
接头核酸分子
在本发明第一方面，本发明提出了一种用于构建测序文库的接头核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子包括第一核酸链，所述第一核酸链包含PCR反应断点，所述PCR反应断点包括选自下列的至少之一：(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及(2)DNA聚合酶不识别位点。当PCR反应断点为核酸消化酶特异性识别位点时，接头自连或互联产物可在核酸消化酶的特异性消化处理下，在PCR反应断点处断裂，而形成长度不超过2倍接头长度的核酸片段；当PCR反应断点为DNA聚合酶不识别位点，DNA聚合酶不识别此PCR反应断点，进而DNA聚合酶的聚合作用终止，当DNA聚合酶是以接头自连或互联产物为模板进行的DNA聚合作用时，就会形成长度不超过2倍接头长度的核酸片段。
根据本申请实施例的接头核酸分子可以应用于低起始量样品的建库，适应更宽的mRNA含量的变化。利用本申请实施例的接头核酸分子进行构建测序文库，能够有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。
根据本发明的具体实施例，所述核酸分子总长度为60nt～65nt。本申请所述的作为接头使用的核酸分子满足“可提供公共引物结合区域进行有效扩增”的基本条件。
其中，核酸消化酶的选择不受特别限制，只要核酸消化酶能够特异性识别PCR反应断点即可。根据本发明的具体实施例，所述核酸消化酶包括选自下列的至少之一：UNG酶以及USER，优选地，所述核酸消化酶为USER酶。UNG酶被称为尿嘧啶N糖基化酶，可特性识别UU，将接头互联或自连产物在UU处打断；USER酶(尿嘧啶-特异性切除试剂)在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。USER酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶EndoⅧ的混合物。
其中，DNA聚合酶不识别位点的选择也不受特别限制，只要不被DNA聚合酶识别或使DNA聚合酶不发生DNA聚合功能即可。根据本发明的具体实施例，所述DNA聚合酶不识别位点包括选自下列的至少之一：至少一个U碱基，至少一个I碱基或至少一个甲基化修饰碱基。DNA聚合酶不识别U碱基、I碱基或甲基化修饰的碱基，当DNA聚合酶遇到U碱基、I碱基或甲基化修饰的碱基时，其DNA聚合作用终止，在此情形下，如果DNA聚合酶是以接头互联或自连产物为模板，则会形成长度不超过2倍接头长度的核酸片段。
根据本发明的具体实施例，DNA聚合酶为Pfu DNA聚合酶或deep vent DNA聚合酶，所述DNA聚合酶不识别位点为dITP(脱氧三磷酸次黄嘌呤核苷)。Pfu DNA聚合酶或deepvent DNA聚合酶不能识别dITP，Pfu DNA聚合酶或deep vent聚合酶所介导的DNA聚合作用在dITP处终止，在此情形下，如果Pfu DNA聚合酶或deep vent DNA聚合酶是以接头互联或自连产物为模板，则会形成长度不超过2倍接头长度的核酸片段。
根据本发明的具体示例，所述的核酸消化酶特异性识别位点位于PCR引物互补区域毗邻的第一核酸链的3’区域。
根据本发明的再一具体示例，所述的DNA聚合酶不识别位点位于PCR引物互补区域或者PCR引物互补区域毗邻的第一核酸链的3’区域。
根据本发明的实施例，所述接头核酸分子还可以进一步包括第二核酸链，所述第一核酸链与所述第二核酸链的至少一部分形成双链区，并且所述双链区的一端构成所述接头核酸分子的连接反应末端；所述的第二核酸链进一步包含PCR反应断点，第二核酸链包含的PCR反应断点包括选自下列的至少之一：
(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及(2)DNA聚合酶不识别位点。
根据本发明的再一具体实施例，所述第二核酸链包含的PCR反应断点为核酸消化酶特异性识别位点，核酸消化酶包括选自下列的至少之一：UNG酶以及USER，优选地，所述核酸消化酶为USER酶；优选的，所述第二核酸链包含的PCR反应断点位于所述第二核酸链的5’端。
根据本发明的再一具体实施例，所述接头核酸分子的两条核酸链全部形成双链区时，所述PCR反应断点位于双链接头分子的非连接反应末端，此PCR反应断点是由非连接反应末端的倒数第一或多个T替换为U形成的。发明人在实验中发现，U碱基属于RNA的碱基相对来说是比较容易降解，当PCR反应断点在第二核酸链的5’端或双链接头分子的非连接反应末端时，为了防止接头合成生产后其末端的U碱基在运输、储存、冻融等过程中发生意外脱落或丢失或降解，发明人在接头末尾加例如2个U，同时把接头原内部即靠近接头末尾的例如2个T(不一定连续)改为U，这样可以即可保证接头功能，同减少实际使用时的U碱基脱落，进一步保证了成功率。
根据本发明的再一具体实施例，所述接头核酸分子的两条核酸链包括双链区和单链区时，所述双链区的长度为12nt，任选地，所述单链区的长度为53nt或47nt。根据本发明的再一具体示例，上述单链区设置在所述双链区的同侧。如果单链区设置在双链区的两侧，则接头的两侧均为单链区，且发明人前期测序数据分析发现，单链区末端是接头自连的高发位点，因此，单链区设置在双链区的同侧可有效降低接头自连的几率。
根据本发明的具体实施例，所述PCR反应断点为UU。
根据本发明的具体实施例，所述第一核酸链具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述第二核酸链具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCUUGUU(SEQID NO：1)。
UUAAUGAUACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO：2)。
本申请实施例的上述的接头核酸分子可以应用于低起始量样品(可低至20ng)的建库，适应更宽的mRNA含量(mRNA在总RNA中的含量可在0.1％～5％范围内)的变化。利用本申请实施例的上述接头核酸分子进行构建测序文库，能够有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例(接头自连或互连产物的比例可控制在5％以下)。
构建测序文库的方法
在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测序的DNA片段与接头连接，以便获得连接产物，所述接头为前面所述的核酸分子；以及对所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增处理中，基于所述PCR反应断点，去除接头自连或互连产物。利用根据本发明实施例的构建测序文库的方法，可有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。
根据本发明的具体实施例，所述方法包括进一步包括对所述连接产物进行第一纯化处理和任选的第二纯化处理。第一或任选的第二纯化处理后，可减少连接反应酶或缓冲液对后续扩增处理的干扰，提高扩增处理的成功率。根据本发明的具体实施例，第一或任选的第二纯化处理可以采用Ampure XP Beads。
根据本发明的具体实施例，所述方法进一步包括对所述扩增产物进行第三纯化处理。对扩增产物进行第三纯化处理，可减少扩增处理过程中酶或缓冲液对后续测序的干扰，提高测序的准确度和灵敏度。根据本发明的具体实施例，所述第三纯化处理可以采用Ampure XP Beads。
根据本发明的实施例，所述PCR反应断点包括核酸消化酶特异性识别位点，所述扩增处理进一步包括：(1)利用所述核酸消化酶对所述连接产物进行消化处理，以便获得消化产物；(2)从所述消化产物中去除长度不大于预定阈值的核酸片段；以及(3)利用DNA聚合酶对经过步骤(2)处理的所述消化产物进行PCR扩增反应，以便获得所述扩增产物。需要说明的是，预定阈值与接头设计的长短及拟建立的文库片短大小有关，预定阈值长度为接头长度的整数倍n，理论上接头自连的个数可以为大于等于2的任意正整数，阈值选择要小于拟建立的文库大小，同时阈值大小＝n×接头长度，所以n的大小可根据文库大小及接头大小而定，优先n为2。如根据本发明实施例的接头的长度为62nt，预定阈值为124nt。
当所述PCR反应断点是核酸消化酶特异性识别位点时，采用上述扩增处理方式，扩增所得到的扩增产物排除了以接头自连或互联产物为模板的扩增产物，所得测序文库应用测序，有效控制了碱基的波动，提高了测序质量，降低了测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
根据本发明的具体实施例，所述核酸消化酶为USER酶和/或UNG酶。USER或UNG酶可特异性识别U碱基，进而利用USER或UNG酶对所述连接产物进行消化处理，可将接头自连或互联产物在U碱基处特异性打断，进而利用磁珠纯化等方式，可从所述消化产物中去除长度不大于预定阈值的核酸片段，如长度不大于124bp的核酸片段，纯化后所获得的消化产物作为PCR反应的模板，在DNA聚合酶作用进行PCR扩增，所获得的扩增产物即测序文库，接头互连、自连产物得到了有效消除。
根据本发明的具体实施例，所述从所述消化产物中去除长度不大于预定阈值的核酸片段是利用XP磁珠纯化实现的。XP磁珠纯化具有基于片段大小进行选择纯化的特性，进而通过XP磁珠纯化可特异性清除一定长度范围的片段而保留一定长度范围的片段。
根据本发明的具体实施例，所述PCR反应断点包括DNA聚合酶不识别位点，所述PCR扩增反应进一步包括：(a)利用DNA聚合酶对所述连接产物进行PCR扩增反应，以便获得PCR扩增粗产物；(b)从所述PCR扩增粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段，以便获得所述扩增产物。当PCR反应断点包括DNA聚合酶不识别位点时，DNA聚合酶当以接头自连或互连产物为模板进行DNA扩增时，DNA聚合酶的DNA聚合作用在PCR反应断点处终止，进而产生长度不大于预定阈值的片段，通过有效手段从粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段，剩余的扩增产物即为以“接头-待测序的DNA片段”连接产物为模板的扩增产物。
根据本发明的具体实施例，所述从所述PCR扩增粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段是利用XP磁珠纯化实现的。如前所述，XP磁珠纯化具有基于片段大小进行选择纯化的特性，进而通过XP磁珠纯化可特异性清除一定长度范围的片段而保留一定长度范围的片段。
根据本发明的具体示例，所述待测序的DNA片段是通过如下方式获得的：
1)将待测样品的RNA进行分离、纯化和打断处理；2)对经过步骤1)处理的RNA进行反转录，以便获得cDNA，所述cDNA为所述待测序的DNA片段。通过上述方式获得的cDNA作为待测DNA片段，可进一步提高测序所得有效数据的比例。
根据本发明的再一具体示例，所述反转录是通过如下方式进行的：(A)以经过步骤1)处理的RNA为模板，反转录合成DNA一链，以便获得RNA/DNA杂交链；(B)利用RNaseH对RNA/DNA杂交链中的RNA链进行消化处理；(C)以步骤(B)消化处理后的残余RNA链为引物，以所述DNA一链为模板，反转录合成DNA二链；(D)利用RNaseH对步骤(C)产物进行消化处理；以及(E)将步骤(D)处理产物进行末端补齐处理，以便获得所述cDNA。通过上述方式进行反转录，最大限度地保留了待测序列的信息，所获得的测序信息更加真实有效。
根据本发明的再一具体示例，所述将待测序的DNA片段与接头连接之前，进一步包括：将所述待测序的DNA片段进行3’末端加A处理。根据本发明的具体实施例，接头核酸分子的连接反应末端具有T碱基，待测序的DNA片段进行3’末端加A处理后，待测序DNA片段的加A末端可与接头核酸分子的具有T的连接反应末端通过碱基互补配对而有效结合。
测序文库
在本发明的第三方面，本发明提出了一种测序文库。根据本方明的具体实施例，所述测序文库是根据前面所述的方法获得的。根据本发明实施例的测序文库中接头互连、自连产物被有效清除，本申请所述的测序文库应用于测序，可有效控制碱基的波动，提高测序质量，降低测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
核酸样本测序方法
在本发明的第四方面，本发明提出了一种核酸样本测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：基于所述核酸样本，利用前面所述的方法，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。利用本申请所述的测序方法，可有效控制碱基的波动，提高测序质量，降低测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
根据本发明的具体实施例，所述测序是利用下列平台的至少之一进行的：
illumina测序平台；以及Bgiseq500 ion proton。采用illumina测序平台或Bgiseq500 ion proton测序平台，测序质量进一步提高。
构建测序文库的设备
在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建测序文库的设备。根据本发明的实施例，参考图1，所述构建测序文库的设备包括：连接装置100，所述连接装置100用于将待测序的DNA片段与接头连接，以便获得连接产物，所述接头为前面所述的接头核酸分子；以及扩增装置200，所述扩增装置200用于对所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述扩增处理中，基于所述PCR反应断点，去除接头自连或互连产物。利用根据本发明实施例的构建测序文库的方法，可有效清除测序文库中的接头互连、自连产物，降低接头互连、自连产物在测序数据的比例。
根据本发明的具体实施例，所述PCR反应断点包括核酸消化酶特异性识别位点，参考图2，所述扩增装置200进一步包括：消化单元210，所述消化单元210用于利用所述核酸消化酶对所述连接产物进行消化处理，以便获得消化产物；选择单元220，所述选择单元220用于从所述消化产物中去除长度不大于预定阈值的核酸片段；以及扩增单元230，所述扩增单元230用于利用DNA聚合酶对经过所述选择单元处理的所述消化产物进行PCR扩增反应，以便获得所述扩增产物。当所述PCR反应断点是核酸消化酶特异性识别位点时，扩增装置200进一步包括上述的消化单元210、选择单元220和扩增单元230，所述扩增装置200中适于采用根据本申请实施例的扩增处理方式，则扩增所得到的扩增产物排除了以接头自连或互联产物为模板的扩增产物，所得测序文库应用测序，有效控制了碱基的波动，提高了测序质量，降低了测序数据中的接头序列(empty-reads)的比例，提高有效数据的产出。
根据本发明的再一具体实施例，所述PCR反应断点包括DNA聚合酶不识别位点，参考图3，所述扩增装置200进一步包括：
PCR反应单元240，所述PCR反应单元240用于利用DNA聚合酶对所述连接产物进行PCR扩增反应，以便获得PCR扩增粗产物；
筛选单元250，所述筛选单元250用于从所述PCR扩增粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段，以便获得所述扩增产物。当PCR反应断点包括DNA聚合酶不识别位点时，扩增装置200进一步包括上述的PCR反应单元240、筛选单元250，所述扩增装置200中适于采用根据本申请再一具体实施例的扩增处理方式，DNA聚合酶当以接头自连或互连产物为模板进行DNA扩增时，DNA聚合酶的DNA聚合作用在PCR反应断点处终止，进而产生长度不大于预定阈值的片段，通过有效手段从粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段，剩余的扩增产物即为以“接头-待测序的DNA片段”连接产物为模板的扩增产物。
根据本发明的具体示例，参考图4，所述设备进一步包括：获得待测序的DNA片段装置300，所述获得待测序的DNA片段装置300用于获得所述待测序的DNA片段，并且所述获得待测序的DNA片段装置300包括，参考图5：RNA处理单元310，所述RNA处理单元310用于将待测样品的RNA进行分离、纯化和打断处理；以及反转录单元320，所述反转录单元320用于对经过所述RNA处理单元310处理的RNA进行反转录，以便获得cDNA，所述cDNA为所述待测序的DNA片段。在上述获得待测序的DNA片段装置300中获得的cDNA作为待测DNA片段，可进一步提高测序所得有效数据的比例
根据本发明的再一具体实施例，所述反转录单元320进一步包括，参考图6：DNA一链合成模块321，所述DNA一链合成模块321用于以经过所述RNA处理单元处理的RNA为模板，反转录合成DNA一链，以便获得RNA/DNA杂交链；第一消化模块322，所述第一消化消化模块322用于利用RNaseH对所述RNA/DNA杂交链中的RNA链进行消化处理；DNA二链合成模块323，所述DNA二链合成模块323用于以经过第一消化模块322消化处理后的残余RNA链为引物，以所述DNA一链为模板，反转录合成DNA二链；第二消化模块324，所述二消化模块324用于利用RNaseH对所述DNA二链进行消化处理；以及末端修饰模块325，所述末端修饰模块325用于将经过第二消化模块处324理的产物进行末端补齐处理，以便获得所述cDNA。经过上述反转录单元获得的cDNA，最大限度地保留了待测序列的信息，所获得的测序信息更加真实有效。
根据本发明的具体实施例，参考图7，所述的设备进一步包括加A装置400，所述加A装置400用于所述将待测序的DNA片段与接头连接之前，将所述待测序的DNA片段进行3’末端加A处理。根据本发明的具体实施例，接头核酸分子的连接反应末端具有T碱基，待测序的DNA片段进行3’末端加A处理后，待测序DNA片段的加A末端可与接头核酸分子的具有T的连接反应末端通过碱基互补配对而有效结合。
对核酸样本进行测序的系统
在本发明的第六方面，本发明提出了一种用于对核酸样本进行测序的系统。根据本发明的具体实施例，参考图8，所述系统包括：文库构建设备1000，所述文库构建设备1000如前所述，所述文库构建设备1000用于基于所述核酸样本，构建测序文库；测序设备2000，所述测序设备2000用于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。
根据本发明的具体实施例，所述测序是利用下列平台的至少之一进行的：
illumina测序平台；以及Bgiseq500 ion proton。采用illumina测序平台或Bgiseq500 ion proton测序平台，测序质量进一步提高。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1
本实施例以Illumina公司的测序平台的RNA建库为例。
1.在北京六合华大公司合成单链接头，序列如SEQ ID NO：1和2所示。
Adapter1.1
5’GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCUUGUU(SEQ ID NO：1)。
Adapter1.2
5’UUAAUGAUACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO：2)。
2.接头退火
(1)试剂
1M Tris-HCl(pH 7.8)；0.5M EDTA(pH 8.0)；5M NaCl；VWR water(Wash Buffer)；
(2)配制OAB(Oligo Annealing Buffer)，体系如表1所示：
表1：
试剂名称 体积(μL)
1M Tris-HCl(pH7.8) 100
0.5M EDTA(pH8.0) 20
5M NaCl 100
VWR water 9780
Total 10000
(3)溶解接头
a)Adapter浓度计算公式：
NμM＝(管内总nmole数/N)×1000μL；1μM＝1pmol/μL＝1nmol/mL
b)Adapter浓度及退火体积要求：
根据所需最终Adapter浓度来计算，Adapter终浓度范围在20μM-200μM。如果Adapter终浓度为200μM，Adapter 1.1和Adapter 1.2浓度均为400μM，以此类推。Adapter1.1和Adapter 1.2退火体积为1：1，退火体系在100μL(包括100μL)以内；
c)核对Adapter合成单上碱基序列、装Adapter管子上的碱基序列与我们需要的序列是否一致；
d)超净工作台准备，紫外灭菌30min，吹风20min，并用DNase ZIP处理；
e)4℃，14000rpm，离心5min；注意保证粉末聚集在管底部；
f)小心开启管盖，注意不要让粉末飘出，向管中加入已经计算好的相应体积的OAB溶解粉末；
g)全部溶解完后混匀并离心，﹣20℃保存，若长期不用，则需﹣80℃保存。
(4)退火准备
a)超净工作台准备，紫外灭菌30min，关掉紫外后吹风20min；
b)在工作台中取好相应的PCR管(凸盖)，并在管盖与管壁上写上清晰的标记；
c)往相应PCR管中加入等体积的Adapter 1.1和Adapter 1.2；
d)把加好的Adapter混匀并离心，置于PCR仪上进行退火。
(5)退火程序如表2所示：
表2：
Figure BDA0001247741850000121
按照以上方案，单链接头1：1的用量，退火成局部双链，末端分叉的粘性接头，退火后的接头结构如下所示。
Figure BDA0001247741850000122
3.建库
建库过程中分别用了两种酶(USER酶和UNG酶)进行测试，两种酶建库过程中反应体系和条件相同，建库结果基本相同，下面以USER酶为例进行说明。
以20ng的UHRR((RNA标准品))(Universal Human Reference RNA，catalog740000，厂家：agilent)和以改进后的接头Adaptor Index为材料替代TruSeq_RNA_SamplePrep_v2kit的接头进行建库，并且在PCR前进行USER消化处理。对照组以20ng的UHRR((RNA标准品))和以试剂盒原装接头为材料，不作USER消化处理。具体用法如表3所示：
表3：
Figure BDA0001247741850000123
Figure BDA0001247741850000131
Figure BDA0001247741850000141
Figure BDA0001247741850000151
实施例2
利用酶不识别原理的实施例操作步骤与上述接近，只是省了表3中消化接头自连接产物步骤。本实施例以Illumina公司的测序平台的RNA建库为例。
1.在北京六合华大公司合成单链接头，序列如SEQ ID NO：1和2所示。
Adapter1.1
5’GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACTGACCAATCTCGTATGCCGTCTTCTGCUUGUU(SEQ ID NO：1)。
Adapter1.2
5’UUAAUGAUACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO：2)。
2.接头退火
(1)试剂
1M Tris-HCl(pH 7.8)；0.5M EDTA(pH 8.0)；5M NaCl；VWR water(Wash Buffer)；
(2)配制OAB(Oligo Annealing Buffer)，体系如表4所示，
表4：
试剂名称 体积(μL)
1M Tris-HCl(pH7.8) 100
0.5M EDTA(pH8.0) 20
5M NaCl 100
VWR water 9780
Total 10000
(3)溶解接头
a)Adapter浓度计算公式：
NμM＝(管内总nmole数/N)×1000μL；1μM＝1pmol/μL＝1nmol/mL
b)Adapter浓度及退火体积要求：
根据所需最终Adapter浓度来计算，Adapter终浓度范围在20μM-200μM。如果Adapter终浓度为200μM，Adapter 1.1和Adapter 1.2浓度均为400μM，以此类推。Adapter1.1和Adapter 1.2退火体积为1：1，退火体系在100μL(包括100μL)以内；
c)核对Adapter合成单上碱基序列、装Adapter管子上的碱基序列与我们需要的序列是否一致；
d)超净工作台准备，紫外灭菌30min，吹风20min，并用DNase ZIP处理；
e)4℃，14000rpm，离心5min；注意保证粉末聚集在管底部；
f)小心开启管盖，注意不要让粉末飘出，向管中加入已经计算好的相应体积的OAB溶解粉末；
g)全部溶解完后混匀并离心，﹣20℃保存，若长期不用，则需﹣80℃保存。
(4)退火准备
a)超净工作台准备，紫外灭菌30min，关掉紫外后吹风20min；
b)在工作台中取好相应的PCR管(凸盖)，并在管盖与管壁上写上清晰的标记；
c)往相应PCR管中加入等体积的Adapter 1.1和Adapter 1.2；
d)把加好的Adapter混匀并离心，置于PCR仪上进行退火。
(5)退火程序如表5所示
表5：
Figure BDA0001247741850000161
Figure BDA0001247741850000171
按照以上方案，单链接头1：1的用量，退火成局部双链，末端分叉的粘性接头，退火后的接头结构如下所示。
Figure BDA0001247741850000172
3.建库
以20ng的UHRR((RNA标准品))和以改进后的接头Adaptor Index为材料替代TruSeq_RNA_SamplePrep_v2kit的接头进行建库。对照组与实施例1一样。具体如表6所示：
表6：
Figure BDA0001247741850000173
Figure BDA0001247741850000181
Figure BDA0001247741850000191
实施例3
在本实施例中，发明人对实施例1和实施例2的所得的测序文库进行Agilent2100检测，并进一步进行了上机测序，具体如下所述。
文库检测
用Agilent2100设备进行文库检测，检测实施例1结果如图9，实施例2结果如图10所示。
上机测序
Hiseq 4000平台PE 100策略测序。
结果分析比较
(1)其中图11为改进前的Agilent2100检测图，可见“ladder”状的尖峰已消除，且实施例1与2差别不大，
(2)碱基分布和测序质量结果(其中，图12为实施例1的碱基分布和测序质量结果图，图13为对照组(改进前)的碱基分布和测序质量结果图；图14为实施例2的碱基分布和测序质量结果图)。
图中不同线型的曲线代表不同碱基(GTAC，N代表读错)，横坐标是第几个测序反应，可以理解为待测序片段中的碱基的顺序位置，纵坐标是碱基占比，理论上来说，由于GTAC的随机等量分布的，对于任一片段位置，它的GTAC的各自占比应该接近25％，但如果被测序片段都相同的接头片段，那么就会打破这种平衡，使碱基比例出现巨大波动。图12、14相对图13，碱基分布集中于25％，图13出现严重波动，是接头比例较高，自连产物较多的一种现象。
由此可见，实施例1，2都能改善碱基波动问题，结果显示实例1(含消化操作)效果最好，实施例2(聚合酶不识别U碱基)的效果次之，改进前(对照组共用)最差。
(3)接头互连、自连数据比例显著降低。具体结果如表7所示。
表7：
READ1 READ2
实施例1 4.455％ 3.384％
实施例2 26.217％ 18.670％
对照组 52.272％ 49.131％
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因股份有限公司
<120> 用于构建测序文库的接头核酸分子
<130> PIDC3166619
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 接头核酸分子的第一核酸链的核苷酸序列
<400> 1
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cactgaccaa tctcgtatgc cgtcttctgc 60
uuguu 65
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 接头核酸分子的第二核酸链的核苷酸序列
<400> 2
uuaaugauac ggcgaccacc gagatctaca ctctttccct acacgacgct cttccgatct 60

Claims (11)

1.一种用于构建测序文库的接头核酸分子，其特征在于，包括：
第一核酸链，所述第一核酸链包含PCR反应断点，所述PCR反应断点包括选自下列的至少之一：
(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及
(2)DNA聚合酶不识别位点；
所述接头核酸分子进一步包含：
第二核酸链，所述第一核酸链与所述第二核酸链的至少一部分形成双链区，并且所述双链区的一端构成所述接头核酸分子的连接反应末端；
所述的第二核酸链进一步包含位于5’端的PCR反应断点，第二核酸链包含的PCR反应断点包括选自下列的至少之一：
(1)核酸消化酶特异性识别位点；以及
(2)DNA聚合酶不识别位点；
所述第一核酸链包含的核酸消化酶特异性识别位点位于PCR引物互补区域毗邻的第一核酸链的3’区域；
所述第一核酸链包含的DNA聚合酶不识别位点位于PCR引物互补区域或者PCR引物互补区域毗邻的第一核酸链的3’区域；
所述的核酸消化酶选自UNG酶或USER酶；
所述PCR反应断点为UU。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸消化酶为USER酶。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，DNA聚合酶为Pfu DNA 聚合酶或deepventDNA 聚合酶。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述第一核酸链为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
所述第二核酸链为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
5.一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：
将待测序的DNA片段与接头连接，以便获得连接产物，所述接头为权利要求1~4中任一项所述的核酸分子；以及
对所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，
其中，所述扩增处理中，基于所述PCR反应断点，去除接头自连或互连产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反应断点包括核酸消化酶特异性识别位点，所述扩增处理进一步包括：
（1）利用所述核酸消化酶对所述连接产物进行消化处理，以便获得消化产物；
（2）从所述消化产物中去除长度不大于预定阈值的核酸片段；以及
（3）利用DNA聚合酶对经过步骤（2）处理的所述消化产物进行PCR扩增反应，以便获得所述扩增产物，
所述核酸消化酶为USER酶和/或UNG酶，
所述从所述消化产物中去除长度不大于预定阈值的核酸片段是利用XP磁珠纯化实现的。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR反应断点包括DNA聚合酶不识别位点，所述PCR反应进一步包括：
(a)利用DNA聚合酶对所述连接产物进行PCR扩增反应，以便获得PCR扩增粗产物；
(b)从所述PCR扩增粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段，以便获得所述扩增产物，
所述从所述PCR扩增粗产物中去除长度不大于预定阈值的片段是利用XP磁珠纯化实现的。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测序的DNA片段是通过如下方式获得的：
1）将待测样品的RNA进行分离、纯化和打断处理；
2）对经过步骤1）处理的RNA进行反转录，以便获得cDNA，所述cDNA为所述待测序的DNA片段，
所述反转录是通过如下方式进行的：
（A）以经过步骤1）处理的RNA为模板，反转录合成DNA第一链，以便获得RNA/DNA杂交链；
（B）利用RNaseH对RNA/DNA杂交链中的RNA链进行消化处理；
（C）以步骤（B）消化处理后的残余RNA链为引物，以所述DNA第一链为模板，反转录合成DNA第二链；
（D）利用RNaseH对步骤（C）产物进行消化处理；以及
（E）将步骤（D）处理产物进行末端补齐处理，以便获得所述cDNA。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述将待测序的DNA片段与接头连接之前，进一步包括：将所述待测序的DNA片段进行3’末端加A处理。
10.一种核酸样本测序方法，其特征在于，包括：
基于所述核酸样本，利用权利要求5~ 9任一项所述的方法，构建测序文库；以及
对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述测序是利用下列平台的至少之一进行的：
illumina测序平台；以及
Bgiseq500 ion proton。
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