CN102296065A - 用于构建测序文库的系统与方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了用于构建测序文库的系统与方法。所述系统与方法包括接头元件及其应用于构建测序文库的方法。接头元件是从5’到3’端依次包含分叉区与配对区的分叉型双链核酸接头，其分叉区的两条单链各包含至少一个扩增引物结合位点，配对区包含至少一个酶切识别位点。本发明的接头元件在文库构建过程中能够避免接头元件自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物的出现。

Description

用于构建测序文库的系统与方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种接头元件及一种构建测序文库的方法。

背景技术

在现阶段，用于高通量基因测序的DNA片段都会首先制备成测序文库。测序文库的制备包括以下几个步骤，首先随机切割样品基因组，获得大量DNA片段，然后接上接头进行扩增反应。在构建文库过程当中，最大问题在于连接接头时很容易出现接头自连现象，同时由于接头连接的随意性，容易出现DNA片段两端连接上同一接头的非目标接头元件-DNA片段复合物，既浪费了原材料又增加了产物分离提纯的复杂程度。

对于一些简单的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)/DNA的插入/缺失(Indel)筛选，单端(single read)测序和双端(paired-end)测序均能满足要求，而结构变异筛选则需要pair-end或者mate-pair测序。目前应用最广的454DNA测序方法中一种构建测序文库的方法的基本步骤为：(1)片段化大核酸分子，以产生目标核酸；(2)将捕捉元件连接至目标核酸，以形成第一环形核酸分子；(3)用切割目标核酸但不切割捕捉元件的限制性内切核酸酶消化第一环形核酸，以产生含目标核酸的两个末端的线性核酸，所述两个末端由捕捉元件分隔；(4)将线性核酸与分隔元件连接，已形成第二环形核酸；(5)将第二环形核酸变为环形单链核酸；(6)使第一寡核苷酸与环形单链核酸退火，并通过滚环扩增来扩增环形单链核酸，以产生单链滚环扩增产物；(7)使第二寡核苷酸与单链滚环扩增产物退火，以在单链滚环扩增产物中形成多个双链区；(8)使用切割多个双链区的限制性内切酶将单链滚环扩增产物消化为小片段，以产生含目标核酸的两个末端区里的DNA构建物。该方法需要进行二次环化，同时由于环化的效率较低需要进行复杂的滚环扩增步骤，因此整个流程耗时长，操作复杂，成本高。

针对上述问题，需要一种能够在建库过程中避免自连的接头元件，同时需要建立一种在建库过程中能够避免出现接头自连及非目标接头元件-DNA片段复合物，而且耗时短、操作简便的建库新方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种接头元件，旨在解决现有技术在建库过程中出现接头自连的问题。

为了实现发明目的，所述接头元件是：

从5’到3’端依次包含分叉区和配对区的分叉型双链核酸接头，所述分叉区双链之间的碱基序列不能互补配对，所述分叉区的双链各包含至少一个引物结合位点；所述配对区包含至少一个酶切识别位点。

上述提供的分叉型双链核酸接头，其分叉设计能够在建库过程避免接头自连现象的出现；所述分叉区上包含的扩增引物结合位点，可以直接用于结合扩增引物，进行扩增反应；而酶切识别位点则可以在建库过程中酶切形成末端，便于进行后续的操作。

其中，所述接头元件的分叉区每条链含有N个核苷酸，其中9≤N≤30，两链之间的核苷酸不能配对。

其中，所述接头元件的配对区含有7～15对互补配对的核苷酸。

其中，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端或平末端。

进一步的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端时，其突出末端与DNA片段的粘性末端互补配对。

更进一步的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T。

更进一步的，所述接头元件配对区的3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

本发明的目的之一在于提供一种构建测序文库的方法，旨在解决建库过程中出现接头自连及非目标接头元件-DNA片段复合物的问题。

为了实现发明目的，所述一种构建测序文库的方法包括：

A.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

B.目的DNA片段两端连接上述接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增得到扩增引物；

C.对扩增产物进行富集回收，形成测序文库。

所述方法利用分叉型双链核酸接头，能够在建库过程中避免出现接头之间自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物。

其中，在所述片段化处理步骤之后还包括目的DNA片段的分离纯化以及末端修饰的步骤。

其中，所述接头元件至少包括本发明所述接头元件中的一种。

其中，所述扩增引物是生物素化的扩增引物，该扩增引物可以是聚合酶链式反应引物，或是带有RNA转录酶初始序列的转录引物。

进一步的，若扩增引物是聚合酶链反应引物，则后续利用聚合酶链式反应进行扩增；若扩增引物是带有RNA转录酶初始序列的转录引物，则后续利用转录法进行扩增。

其中，所述步骤C中扩增产物利用经过亲和素或链霉亲和素修饰的磁珠吸附，然后通过磁铁将其分离出来。

本发明的目的之一在于提供一种构建测序文库的方法，旨在解决建库过程中出现接头自连及非目标接头元件-DNA片段复合物，以及耗时长操作复杂的问题。

为了实现本发明目的，所述方法包括以下步骤：

A.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

B.目的DNA片段两端连上第一接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增，得到扩增产物；

C.酶切扩增产物得到酶切产物，环化酶切产物得到环化产物；

D.酶切环化产物得到DNA构建物；

E.在DNA构建物两端连接第二接头元件形成配对末端片段；

F.解旋形成单链，得到配对末端测序文库。

所述方法在目的DNA片段接上接头元件之后先进行扩增，然后再酶切环化，避免了操作复杂而又耗时较长的滚环扩增，也不需要进行二次环化，操作简便耗时短。同时，若所述方法利用分叉型双链核酸接头，能够在建库过程中避免出现接头自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物。

其中，所述源DNA片段化处理步骤之后还包括目的DNA片段的分离纯化以及末端修饰的步骤。

其中，所述步骤B中扩增引物是生物素化的扩增引物。

进一步的，所述扩增引物上至少包含一个特异性酶切识别位点，酶切识别位点选用尿嘧啶碱基或限制性内切酶识别位点。

更进一步的，若扩增引物上所带的特异性酶切识别位点是尿嘧啶碱基，则步骤C利用尿嘧啶特异性切除试剂进行酶切；

若扩增引物所带特异性酶切识别位点为限制性内切酶识别位点，则步骤C利用限制性内切酶进行酶切。

其中，所述步骤C中酶切产物环化之后需要进行纯化回收步骤，即去除未环化的DNA片段。

其中，所述步骤D中利用能够识别第一接头元件上的酶切识别位点，切割目的DNA片段但不切割接头元件的II类限制性内切酶(typeIIs酶)酶切环化产物，从而得到接头元件两端连接有目的DNA片段末端的DNA构建物。

其中，所述步骤E中的第二接头元件优选包含分叉区与配对区的双链核酸分子，其中分叉区的每条链包含N个核苷酸，9≤N≤30，每条单链上各有一个扩增引物结合位点；配对区含有7～15对互补配对的核苷酸。

其中，所述步骤F之后还可以包括步骤G：

对所述的配对末端测序文库进行扩增，以得到更高拷贝数的配对末端测序文库。

其中，所述步骤G中扩增优选通过微乳液PCR(emulsion PCR，E-PCR)进行扩增，也可通过普通PCR进行扩增。

由上可知，本发明提供了一种接头元件以及一种构建测序文库的方法，利用接头元件的分叉设计，避免了在建库过程中出现接头之间自连以及DNA片段两端连接同一接头的现象；此外先扩增再环化，避开了滚环扩增以及二次环化的操作，能够快速简便的建立测序文库。

附图说明

图1是本发明一个实施例中用于构建测序文库的接头元件的结构示意图；

图2是本发明另一个实施例中用于构建测序文库的接头元件的结构示意图；

图3是本发明一个实施例中构建测序文库的方法流程图；

图4是本发明另一个实施例中构建测序文库的方法流程图；

图5是本发明图4实施例中构建测序文库的方法中第二接头元件的结构示意图；

图6是本发明一个实施例中构建测序文库的方法示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

为了解决现有技术在建库过程中出现接头自连的问题，本发明所提供的接头元件结构为：

从5’到3’端依次包含分叉区和配对区的分叉型双链核酸接头，所述分叉区双链之间的碱基序列不能互补配对，所述分叉区的双链各包含至少一个引物结合位点；所述配对区包含至少一个酶切识别位点。

上述分叉型双链核酸接头的分叉设计能够在建库过程避免接头自连现象的出现；所述分叉区上包含的扩增引物结合位点，可以直接用于结合扩增引物，进行扩增反应；而酶切识别位点则可以在建库过程中酶切形成末端，便于进行后续的操作。

优选的，上述接头元件的分叉区的每条链含有N个核苷酸，其中9≤N≤30，两链之间的核苷酸不能配对。

优选的，所述接头元件的配对区含有7～15对互补配对的核苷酸，更优选为9-13对互补配对的核苷酸。

优选的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端或平末端。

优选的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端时，其突出末端与DNA片段的粘性末端互补配对。

更优选的，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T。

更优选的，所述接头元件配对区的3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

对于本发明所提供的接头元件的结构，其包含的各种技术方案将在下述提供的实施例中进行详细阐述。

图1示出了本发明的一个实施例中用于构建测序文库的接头元件的结构。该接头元件包括：

从5’到3’端依次包含分叉区和配对区的分叉型双链核酸接头。其中，分叉的每条单链上各含有一个扩增引物结合位点；分叉区的双链所包含的核苷酸个数各为18个；配对区含有一个酶切识别位点，包含12对互补配对的核苷酸，而且配对区3’末端为突出末端，其DNA序列多出一个T碱基。

本实施例中，采用分叉型双链核酸接头元件，可以在建库过程中避免出现接头之间自连的现象；而突出末端多出的T碱基，则可以更方便的与目的DNA片段进行连接。

应当说明，本实施例仅是本发明所提供的接头元件的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图2示出了本发明的另一个实施例中用于构建测序文库的接头元件的结构。该接头元件包括：

从5’到3’端依次包含分叉区和配对区的分叉型双链核酸接头。其中，分叉的每条单链上各包含一个扩增引物结合位点；分叉区的两链所含的核苷酸个数分别为9和19；而配对区含有一个酶切识别位点，含有10个互补配对的核苷酸；配对区3’末端的DNA序列最后一个碱基为双脱氧碱基。

在本实施例中，采用分叉型双链核酸接头元件，可以在建库过程中避免出现接头之间自连现象的出现；配对区3’末端的DNA序列最后一个碱基为双脱氧碱基，则可以更进一步的控制接头元件与目的DNA片段之间连接的方向性。

需要说明的是：与本接头元件配合使用的，可以对目的DNA片段进行末端去磷酸化操作，可以进一步的避免在连接过程中出现目的DNA片段之间的自连现象，更能凸显本发明提供的接头元件的优越性。

应当说明，本实施例仅是本发明提供的接头元件的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图3示出了本发明的一个实施例中构建测序文库的方法流程。该方法包括：

S101.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

S102.目的DNA片段两端连上接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增，得到扩增产物；

S103.对扩增产物进行富集回收，形成测序文库。

本发明的技术方案优点在于：利用分叉型双链核酸接头，能够在建库过程中避免出现接头之间自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物。

需要说明的是：

步骤S101所述源DNA可来源于任意DNA，包括已知和未知序列的DNA，如基因组DNA、大片段DNA、cDNA、质粒DNA和线粒体DNA等。对于已知序列的源DNA，可用于进行基因组多态性筛选以及基因疾病关联的对比分析研究。

所述源DNA片段化处理的方法，可以根据所需片段的大小，通过常用方法中的任一种进行片段化，所述方法包括但不限于雾化、超声破碎、机械剪切破碎片段化、酶切片段化、化学以及热诱导片段化。

在所述片段化处理之后还可包括目的DNA片段的分离纯化以及末端修饰的步骤。根据测序的片段长度需要，对于片段化得到的DNA片段，需要进行目的DNA片段的分离纯化，分离方法可以采用常用方法，如凝胶方法、蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离等。根据所使用的片段化方法，所得的目的DNA片段可能需要进一步的末端修饰，例如进行磷酸化或去磷酸化、末端补平等，以便于后续的接头元件连接。

在步骤S102中，所述的接头元件至少包括本发明所述接头元件中的一种。

若使用的接头元件是配对区3’末端为突出末端的，通过其突出末端与DNA片段的粘性末端互补配对进行连接。

优选的，若DNA片段化采用能切出粘性末端的内切酶随机酶切破碎方法，接头元件的突出末端序列与该内切酶切出的粘性末端序列互补；若采用其他方法如超声破碎法进行片段化，则对DNA片段进行末端补平并加上A尾，而接头元件的突出末端最后一个碱基为T。

若使用的接头元件是配对区3’末端为平末端的，则接头元件与DNA片段直接通过平末端连接方式连接。

使用的接头元件时配对区3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

更优选的，使用前面所述配对区3’末端为平末端的接头元件时，对DNA片段进行去磷酸化处理，能够避免DNA片段之间形成自连结构。

所述扩增引物是生物素化的扩增引物，该扩增引物可以是聚合酶链式反应引物，或是带有RNA转录酶初始序列的转录引物。

在步骤S103中，扩增产物利用经过亲和素或链霉亲和素修饰的磁珠吸附，然后通过磁铁将其分离出来。

对于图3所示本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

在步骤S101的一个实施例中，步骤S101具体如下：。

以Lambda DNA(λDNA)作为源DNA，利用超声破碎方式进行片段化处理。具体操作为：将200μLλDNA放入400μL TE buffer溶液中，430W功率条件下超声4s，反复5次。得到的片段混合物利用1％琼脂糖凝胶进行分离纯化，选择400-600bp大小的片段切胶回收，得到目的DNA片段。

应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S101中的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S102的一个实施例中，步骤S102具体实现如下：

在连接接头元件之前，要对目的DNA片段进行末端修饰，以便于接头元件的连接。本实施例中对目的DNA片段进行磷酸化以及末端补平修饰，然后根据所选择的分叉A-T接头，即该接头元件配对区的3’末端未突出末端，且突出末端最后一个碱基为T的分叉型双链核酸接头，对目的DNA片段进行了加A尾的操作。

本实施例中，磷酸化以及末端补平反应体系为：DNA片段样品，20μL；10mM dNTP，1.5μL；T4DNA聚合酶，1μL；Klenow DNA聚合酶，0.1μL；T4多核苷酸激酶，0.5μL；10m MATP，1.5μL；T4DNA连接缓冲液，10μL；加ddH₂O至100μL，20℃孵育20min，反应结束后利用回收试剂盒进行纯化回收。加A尾的反应体系为：目的DNA片段样品，60μL；Klenow缓冲液，10μL；10mM dATP，2μL；Klenow酶，1μL；加ddH₂O至100μL，37℃孵育30min，纯化试剂盒纯化回收。

目的DNA片段与接头元件连接形成接头元件-DNA复合物，连接体系内为：目的DNA片段，50μL；接头元件，2μL；10mM ATP，5μL；T4DNA连接酶，1μL；10×T4连接酶缓冲液，10μL；加ddH₂O至100μL，然后连接体系14℃孵育2h以上，纯化试剂盒纯化回收连接产物。

连接产物内加入生物素化的扩增引物，对其进行扩增。扩增体系为：40μL连接产物；上、下游两端扩增引物各10μL；dNTP10μL；Taq酶10μL；10×buffer，100μL；加ddH₂O至1000μL，扩增反应程序为94℃2min；94℃10s，57℃10s，72℃1～2min 12cycles；72℃5min。

应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S102中的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S103的一个实施例中，步骤S103具体实现如下：

根据加入的生物素化扩增引物，利用亲和素或链霉亲和素修饰的磁珠对扩增产物进行富集回收，然后清洗，TE溶液重悬扩增产物，形成测序文库。

应当说明的是，本实施例仅是本发明的步骤S103中的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

图4示出了本发明的一个实施例中构建测序文库的方法流程。该方法包括：

S201.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

S202.目的DNA片段两端连上第一接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增，得到扩增产物；

S203.酶切扩增产物得到酶切产物，环化酶切产物得到环化产物；

S204.酶切环化产物得到DNA构建物；

S205.在DNA构建物两端连接第二接头元件形成配对末端片段；

S206.解旋形成单链，得到配对末端测序文库；

本方法的优点在于：在目的DNA片段接上接头元件之后先进行扩增，然后再酶切环化，避免了操作复杂而又耗时较长的滚环扩增，也不需要进行二次环化，操作简便耗时短。同时，若所述方法利用分叉型双链核酸接头，能够在建库过程中避免出现接头自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物。

需要说明的是：

步骤S201中，源DNA与步骤S101中所述一样可以是任意来源的DNA，包括已知和未知序列的DNA；片段化的方法采用常用方法中的任一种方法进行，根据测序的片段长度需要选用适合的方法；源DNA片段化处理步骤之后还可包括目的DNA片段的分离纯化以及末端修饰的步骤。

步骤S202中，第一接头元件可以是各种形式的接头元件，包括但不限于不分叉的普通接头元件、分叉型接头元件或带有茎环结构的接头元件。

优选的，第一接头元件是分叉型或带有茎环结构的双链核酸接头元件，能够避免接头自连现象以及非目标接头元件-DNA片段复合物的形成。

进一步优选的，若使用的分叉型双链核酸接头元件是配对区3’末端为突出末端的，通过其突出末端与目的DNA片段的粘性末端互补配对进行连接。若源DNA片段化采用能切出粘性末端的内切酶随机酶切破碎方法，接头元件的突出末端序列与该内切酶切出的粘性末端序列互补；若采用其他方法如超声破碎法进行片段化，则对DNA片段进行末端补平并加上A尾，而接头元件的突出末端最后一个碱基为T。

进一步优选的，若使用的分叉型双链核酸接头元件是配对区3’末端为平末端的，则接头元件与DNA片段直接通过平末端连接方式连接。

更进一步优选的，使用的接头元件配对区3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

更进一步优选的，使用配对区3’末端为平末端的接头元件时，对DNA片段进行去磷酸化处理，能够避免DNA片段之间形成自连结构。

步骤S203中，扩增引物是生物素化的扩增引物。

优选的，扩增引物上至少包含一个特异性酶切识别位点，酶切识别位点选用尿嘧啶碱基或限制性内切酶识别位点。

进一步优选的，若扩增引物上所带的特异性酶切识别位点是尿嘧啶碱基，则步骤S203利用尿嘧啶特异性切除试剂进行酶切；

若扩增引物所带特异性酶切识别位点为限制性内切酶识别位点，则步骤S203利用限制性内切酶进行酶切。

步骤S204中，酶切环化产物是利用能够识别第一接头元件上的酶切识别位点，切割目的DNA片段但不切割接头元件的II类限制性内切酶(typeIIs酶)实现。

步骤S205中，第二接头元件优选包含分叉区与配对区的双链核酸分子，其中分叉区的每条链包含N个核苷酸，9≤N≤30，每条单链上各有一个扩增引物结合位点。

进一步优选的，所述第二接头元件的配对区包含7～15对互补配对的核苷酸，更进一步优选的，包含9～13对互补配对的核苷酸。

对于图4所示本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

在步骤S201的一个实施例中，步骤S201具体实现如下：

对于源DNA的片段化直接利用超声破碎成随机片段，超声破碎的条件为430W功率条件下超声4s，反复5次。以1％的凝胶进行片段的大小分级分离，然后从凝胶中选择400-600bp大小的片段进行切胶回收，得到目的DNA片段。

应当说明的是，本实施例仅是本发明中步骤S201的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S202的一个实施例中，步骤S202具体实现如下：

连接接头元件之前，根据所用的接头元件要对目的DNA片段进行末端修饰，以便于接头元件的连接。本发明的一个实施例中选用的接头元件为分叉A-T接头，对目的DNA片段需要进行磷酸化、末端补平以及加A尾处理；本发明的另一个实施例中选用的接头元件为分叉双脱氧接头，所述分叉双脱氧接头为配对区得3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基核苷酸的分叉双链核酸接头，对目的DNA片段需要进行去磷酸化和末端补平处理。同时由于末端双脱氧碱基的存在以及去磷酸化的处理，连接之后出现“缺口”现象，需要利用链置换DNA聚合酶进行填补修复，所述链置换DNA聚合酶在生化领域内常见的有phi29聚合酶、Bst DNA聚合酶以及Klenow聚合酶。

本实施例中优选分叉双脱氧接头，连接以及填补“缺口”的反应体系包含：50μL目的DNA片段、6μL扩增引物、10μL dNTP、5μL ATP，然后加入缓冲液至100μL，60℃恒温5min，然后降温到37℃，加入0.3ul Taq酶and 0.5ul T4DNA连接酶，37℃孵育30min。反应结束后纯化试剂盒提纯回收，TE重悬连接产物。

连接产物中加入扩增引物进行扩增，得到扩增产物。所选用引物上带有特异性酶切识别位点，而且为了便于扩增产物纯化回收进行后续操作，引物上设计带有生物素或者其他抗性标记，包括但不限于氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、博来霉素和氯霉素。同时，还可以选用不同类型的扩增引物，如聚合酶链式扩增引物或T7RNA转录扩增引物等，这决定了后续的扩增方式。加入扩增引物后，建立扩增体系，40μL连接产物、10μL dNTP、上下游两端扩增引物各10μL、Taq酶20μL，加入PCR缓冲液至1000μL，扩增程序为94℃2min；94℃ 10s，57℃ 10s，72℃ 1-2min，12cycles；72℃ 5min。

应当说明的是，上述实施例仅是本发明中步骤S202中的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S203的一个实施例中，步骤S203具体实现如下：

对于上一步骤中的扩增产物直接采用试剂盒进行回收。为使得酶切产物能够顺利的互补成环，提高效率，在酶切之前对扩增产物进行去A尾反应。酶切反应时，根据扩增引物上所带的酶切识别位点，选择不同的酶进行酶切。为提高成环效率，本实施例优选扩增引物上携带尿嘧啶碱基，利用尿嘧啶特异性切除试剂User酶进行酶切，形成较长的突出末端，便于互补成环，提高成环的效率。此外，也可以选择限制性内切酶识别位点，利用限制性内切酶进行酶切。利用User酶进行酶切的酶切体系以及条件为：扩增产物100μL、缓冲液20μL、User酶10μL，然后加入ddH₂O至200μL，37℃孵育30min，反应结束后纯化试剂盒提纯回收。

对扩增产物酶切并提纯回收产物之后，进行环化反应。环化时，利用环化缓冲液将酶切产物稀释到终浓度为2ng/μL，55℃恒温处理5～10min，缓慢降温到20℃，保持10min，然后加入终浓度为1mM的ATP，终浓度为5wiss/1000μL的T4DNA连接酶(30wiss)，ddH₂O加至1000μL，20℃孵育2h以上。反应结束后，试剂盒纯化回收环化产物。

为保证环化产物的纯度，减少后续操作中的酶用量，因此清除未环化的酶切产物。利用能对未环化的DNA片段作用而对环化DNA链不起作用的ATP依赖性DNA酶，建立反应体系：终浓度为1mM的ATP、10×buffer 30μL、10U/μL的ATP依赖性DNA酶5μL、环化产物220μL，ddH₂O加至300μL，37℃孵育2h，反应结束试剂盒提纯回收。

应当说明的是，本实施例仅是本发明中步骤S203的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S204的一个实施例中，步骤S204具体实现如下：

设计合成使得第一接头元件的配对区上携带有酶切识别位点，利用能够识别第一接头元件上的酶切识别位点，切割目的DNA片段但不切割接头元件的typeIIs酶如Acu I对环化产物进行酶切，从而得到接头元件两端连接有目的DNA片段末端的DNA构建物。本实施例中所用酶切体系为：环化产物60μL(3～5μg)、10×NEB buffer 8μL、Acu I(NEB，10U)2μL、SAM(32mM)1μL，加ddH₂O至80μL，37℃孵育2h，乙醇沉淀DNA片段，然后TE重悬。

应当给予说明的是，本实施例仅是本发明步骤S204的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S205的一个实施例中，步骤S205具体实现如下：

连接第二接头元件之前，对DNA构建物进行提纯。由于扩增时加入的是生物素化的扩增引物，因此可以直接通过亲和素或链霉亲和素修饰的磁珠对DNA构建物进行快速简便的提纯。本实施例利用链霉亲和素修饰的磁珠M280，对DNA构建物进行提纯。提纯产物与第二接头元件孵育连接，形成配对末端片段。连接体系以及条件为：终浓度为1pmol的磁珠连接的DNA构建物、第二接头元件1μL、连接缓冲液2μL、T4连接酶(30wiss/μL)稀释到5wiss、10mM ATP 2μL，加ddH₂O至20μL，14℃孵育2h。

本实施中的第二接头元件优选分叉区与配对区的双链核酸分子，具体结构见图5所示。其中分叉区的每条链包含N个核苷酸，9≤N≤30，每条单链上各有一个扩增引物结合位点；配对区含有9对互补配对的核苷酸。在此步骤中也能换用平端接头，为了避免出现接头之间的自连，因此优选分叉接头。

应当给予说明的是，本实施例仅是本发明步骤S205的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S206的一个实施例中，步骤S206具体实现如下：

利用0.1M的NaOH清洗3次配对末端片段，使其解旋形成单链，洗脱缓冲液清洗3次，然后TE重悬保存。应当说明的是，本实施例仅是本发明步骤S206的一个实施例，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

对于上述实施例，可以进一步对得到的配对末端测序文库进行扩增，以得到更高拷贝数的配对末端测序文库。对于连接在磁珠上的单链产物，优选使用E-PCR反应进行扩增，直接形成结合于固相载体上的扩增文库。在典型的E-PCR实施方案中，先将一端的扩增引物固定于磁珠上，另一端引物位于水相溶液中，然后水相与油相混合制备成乳浊液体系，使得扩增反应在相互隔离的封闭小液滴中进行单分子扩增。在另一实施例中，也可以直接采用一般的聚合酶链式反应进行扩增，扩增体系为：配对末端片段40μL、10×buffer 30μL、10mM dNTP 3μL、上下游两端引物各3μL、Taq酶3μL，ddH₂O加至300μL。扩增反应程序为94℃ 2min；94℃ 10s；57℃ 10s；72℃ 20s，15cycles；72℃ 5min。扩增产物利用试剂盒纯化回收，TE重悬成为待用的测序文库。应当说明的是，上述实施例中仅给出了典型的扩增方式，并不用于限定本发明的保护范围。

图6为本发明的一个实施例中构建测序文库的方法示意图。该图直观的展示了利用分叉接头元件构建测序文库的过程：

1、利用常用方法如超声破碎法将源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；将片段混合物通过凝胶电泳的方式进行DNA片段的分离纯化；回收目的DNA片段之后，对其进行磷酸化、末端修复以及加A尾的末端修饰。

2、将带有扩增引物结合位点以及酶切识别位点的分叉A-T接头元件连接到目的DNA片段两端，形成连接物，然后加入生物素化并带有酶切识别位点的扩增引物对连接物进行扩增，产生带有生物素化的扩增产物。

3、利用之前加入的扩增引物所带的酶切位点，对扩增产物进行酶切，酶切产物进行环化。扩增引物中带有尿嘧啶碱基，利用尿嘧啶特异性切除试剂User酶进行酶切，产生长突出末端，提高成环的效率。

4、环化产物酶切，得到接头元件两端连有目的DNA片段末端的DNA构建物。利用能够识别第一接头元件上的酶切识别位点，切割目的DNA片段但不切割接头元件的typeIIs酶对环化产物进行酶切，从而得到接头元件两端连接有目的DNA片段末端的DNA构建物。

5、利用经链霉素修饰的磁珠与DNA构建物上携带的生物素作用，对酶切产物进行纯化回收。

6、在DNA构建物两端连接上带有扩增引物结合位点的第二接头元件，形成配对末端片段分子。该第二接头元件同样为分叉接头元件，可以避免出现接头自连现象。

7、将磁珠上所连接的配对末端片段解旋形成单链分子，形成测序文库。

本方法能够避免进行再次成环或者是利用滚环扩增来提高环化产物数量的操作，降低了耗时。

应当说明的是，本发明提供的接头元件以及构建测序文库的方法典型的应用于测序样品的处理，但不限于测序，任何其他类似的应用均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种用于构建测序文库的接头元件，其特征在于，所述接头元件是从5’到3’端依次包含分叉区和配对区的分叉型双链核酸接头；

所述分叉区的两条单链各包含至少一个扩增引物结合位点；

所述配对区包含至少一个酶切识别位点。

2.根据权利要求1所述的用于构建测序文库的接头元件，其特征在于，所述分叉区的每条链含有N个核苷酸，其中9≤N≤30。

3.根据权利要求1或2所述的用于构建测序文库的接头元件，其特征在于，所述配对区含有7～15对互补配对的核苷酸。

4.根据权利要求3所述的用于构建测序文库的接头元件，其特征在于，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端或平末端。

5.根据权利要求4所述的用于构建测序文库的接头元件，其特征在于，所述接头元件配对区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T。

6.根据权利要求4所述的用于构建测序文库的接头元件，其特征在于，所述接头元件配对区的3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

7.一种构建测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

B.目的DNA片段两端连上所述权利要求1至6的任一接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增，得到扩增产物；

C.对扩增产物进行富集回收，形成测序文库。

8.根据权利要求7所述的构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤A之后还包括所述目的DNA片段的分离纯化和末端修饰步骤。

9.根据权利要求7所述的构建测序文库的方法，其特征在于，步骤B中所述扩增引物采用聚合酶链式反应引物，或带有RNA转录酶初始序列的转录引物。

10.根据权利要求9所述的构建测序文库的方法，其特征在于，步骤B所述扩增引物是生物素化的引物。

11.根据权利要求9所述的构建测序文库的方法，其特征在于：

若扩增引物是聚合酶链反应引物，则后续利用聚合酶链反应进行扩增；

若扩增引物是带有RNA转录酶初始序列的转录引物，则后续利用转录法进行扩增。

12.根据权利要求10所述的构建测序文库的方法，其特征在于，步骤C所述扩增产物的富集回收利用亲和素或链霉亲和素修饰的磁珠进行。

13.一种构建测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A.对源DNA进行片段化处理，以产生目的DNA片段；

B.目的DNA片段两端连上第一接头元件形成接头元件-DNA复合物，加入扩增引物进行扩增，得到扩增产物；

C.酶切扩增产物得到酶切产物，环化酶切产物得到环化产物；

D.酶切环化产物得到DNA构建物；

E.在DNA构建物两端连接第二接头元件形成配对末端片段；

F.解旋形成单链，得到配对末端测序文库。

14.根据权利要求13所述的构建测序文库的方法，其特征在于，所述片段化处理步骤之后还包括目的DNA片段的分离纯化及末端修饰步骤。

15.根据权利要求13所述的构建测序文库的方法，其特征在于，步骤B所述扩增引物是生物素化的扩增引物。

16.根据权利要求13所述的构建测序文库的方法，其特征在于，所述扩增引物上带有至少一个特异性酶切识别位点。

17.根据权利要求16所述的构建测序文库的方法，其特征在于：

若扩增引物上所带的特异性酶切识别位点是尿嘧啶碱基，则步骤C利用尿嘧啶特异性切除试剂进行酶切；

若扩增引物所带特异性酶切识别位点为限制性内切酶识别位点，则步骤C利用相应的限制性内切酶进行酶切。

18.根据权利要求13所述的构建测序文库的方法，其特征在于，步骤D中利用能够识别接头元件上的酶切识别位点，切割目的DNA片段但不切割接头元件的II类限制性内切酶进行酶切环化产物，从而得到接头元件两端连接有目的DNA片段末端的DNA构建物。

19.根据权利要求13所述的构建测序文库的方法，其特征在于，所述第二接头元件是包含分叉区与配对区的双链核酸分子，其中分叉区的每条链包含N个核苷酸，9≤N≤30；配对区含有7～15对互补配对的核苷酸。

20.根据权利要求13所述的构建测序文库的方法，其特征在于，所述步骤F后还包括以下步骤：

G.对所述的配对末端测序文库进行扩增，以得到更高拷贝数的配对末端测序文库。

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