CN104947197B - 一种构建高通量测序文库的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种构建高通量测序文库的方法。步骤包括对（1）DNA进行片段化；（2）纯化；（3）连接接头；（4）扩增；（5）小片段去除；（6）文库固定等步骤。本发明的接头连接效率高，利用本发明的方法，能够简单、高效地利用测序板，降低了样品和试剂的损耗，构建高通量测序文库。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种构建高通量测序文库的方法。
背景技术
高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序、聚合酶克隆、454焦磷酸测序、Illumina sequencing、ABISOLiD sequencing、离子半导体测序、DNA纳米球测序等。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。
现有技术中，构建高通量测序文库的方法包括：将基因组DNA片段化；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；利用特异性探针对所述连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成高通量测序文库。采用本发明的构建高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建样本的基因组特定区域的高通量测序文库。现有技术还存在建库效率较低，试剂、样品损耗大，信息不完整的问题，需要构建新方法来解决。
发明内容
本发明的一个目的是一种构建高通量测序文库的方法，包括以下步骤
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：打断DNA，温度在20℃以下，纯化回收；
（3）DNA片段质量评价；
（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
（5）接头连接磷酸：接头5’链末端是引物端，带有生物素，在接头的一侧有标签，其中平端化的接头5’末端连接磷酸基团；
（6）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过连接酶与平端化的DNA片段相连；
（7）DNA文库固定；
（8）小片段去除，PCR 扩增，得到双链DNA文库；
（9）DNA文库分离：对DNA文库进行变性，将未结合生物素的DNA片段洗脱下来，即为测序文库。
所述打断DNA使用Covaris超声波打断仪。
所述打断DNA使DNA样品成为400-700bp。
所述纯化回收为先用Qiagen 的MinElute进行纯化，然后使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳胶回收或Double SPRI bead方法回收，优选为使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳胶回收；回收选取450-700bp的片段。
所述质量评价采用Agilent的Bioanalyzer DNA 7500 LabChip。
所述与平端化的DNA片段相连采用的连接酶为T4连接酶，所述连接磷酸使用T4 多聚核苷酸激酶，连接6小时以上。
所述连接磷酸后的接头为接头a:
5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′
3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5′，
接头a的标签为GCATCACT和CGTAGTGA。
所述连接磷酸后的接头为接头b:
5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3′
3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′，
接头b的标签为TCACTAGT和AGTGATCT。
所述小片段的去除利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段。
所述PCR扩增采用化学修饰热启动 taq 酶。
所述PCR扩增采用高保真DNA聚合酶。
所述DNA文库固定，为连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上。
使用KOH溶液对DNA文库进行变性，KOH溶液的浓度为0.6mol/L。
所述洗脱未结合生物素的DNA片段，使用M280链霉素抗生物素蛋白磁珠。
本发明构建的文库容量大，与待测核酸配对的成功率高。其中的Y接头，节省了筛选不同连接产物的时间，提高了建库效率。方法中的T4 多聚核苷酸激酶能够高效的连接磷酸基团。测序接头序列长度较长，连接效率高。使用本发明构建的测序文库，能够简单、高效地构建高通量测序文库，高效的利用测序板，提高了文库构建的成功率，降低了样品和试剂的损耗。得到的测序文库纯度高、信息完整，能够高效地捕获目的片段，获得精确的测序结果。
具体实施方式
实施例1
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪打断DNA，使DNA样品成为400-700bp，温度为20℃，先用Qiagen 的MinElute进行纯化，然后使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳胶回收，回收选取450-700bp的片段；
（3）采用Agilent的Bioanalyzer DNA 7500 LabChip进行DNA片段质量评价；
（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
（5）接头连接磷酸：接头5’链末端是引物端，带有生物素，使用T4 多聚核苷酸激酶在接头一侧标签处，平端化的5’末端连接磷酸基团，连接7小时，得到接头a，
5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′
3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5′，
标签为GCATCACT和CGTAGTGA;
（6）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过T4连接酶与平端化的DNA片段相连，连接6小时；
（7）连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上；
（8）利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段，使用热启动高保真taq酶进行PCR 扩增，扩增体系为：每1ml扩增混合液中包含，0.50×10-3mmol MgCl2、50μl DNA聚合酶、160μl dNTP、150μl引物、10μl BSA、130μl emPCR助剂和100μl 10×反应液，余量为水，得到双链DNA文库；
（9）DNA文库分离：使用0.6mol/L的KOH溶液对双链DNA文库进行变性，使用M280链霉素抗生物素蛋白磁珠将未结合生物素的DNA片段洗脱下来，即为测序文库。
实施例2
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪打断DNA，使DNA样品成为500-700bp，温度为18℃，先用Qiagen 的MinElute进行纯化，然后使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳胶回收，回收选取500-700bp的片段；
（3）采用Agilent的Bioanalyzer DNA 7500 LabChip进行DNA片段质量评价；
（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
（5）接头连接磷酸：接头5’链末端是引物端，带有生物素，使用T4多聚核苷酸激酶在接头一侧标签处，平端化的5’末端连接磷酸基团，连接8.5小时，连接磷酸后的接头为接头b:
5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3′
3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。
标签为TCACTAGT和AGTGATCT；
（6）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过T4连接酶与平端化的DNA片段相连，连接7小时；
（7）连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上；
（8）利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段，使用化学修饰热启动 taq酶进行PCR 扩增，扩增体系为：每1ml扩增混合液中包含，0.50×10-3mmol MgCl2、50μl DNA聚合酶、160μl dNTP、150μl引物、10μl BSA、130μl emPCR助剂和100μl 10×反应液，得到双链DNA文库；
（9）DNA文库分离：使用0.6mol/L的KOH溶液对双链DNA文库进行变性，使用M280链霉素抗生物素蛋白磁珠将未结合生物素的DNA片段洗脱下来，即为测序文库。
实施例3
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪打断DNA，使DNA样品成为400-700bp，温度为16℃，先用Qiagen 的MinElute进行纯化，然后使用Double SPRIbead方法回收，回收选取450-700bp的片段；
（3）采用Agilent的Bioanalyzer DNA 7500 LabChip进行DNA片段质量评价；
（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
（5）接头连接磷酸：接头5’链末端是引物端，带有生物素，使用T4多聚核苷酸激酶在接头一侧标签处，平端化的5’末端连接磷酸基团，连接8小时，得到接头a，
5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′
3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5′，
标签为GCATCACT和CGTAGTGA;
（6）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过T4连接酶与平端化的DNA片段相连，连接8小时；
（7）连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上；
（8）利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段，使用化学修饰热启动 taq酶进行PCR 扩增，得到双链DNA文库；
（9）DNA文库分离：使用0.6mol/L的KOH溶液对双链DNA文库进行变性，使用M280链霉素抗生物素蛋白磁珠将未结合生物素的DNA片段洗脱下来，即为测序文库。
实施例4
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪打断DNA，使DNA样品成为400-700bp，温度为20℃，先用Qiagen 的MinElute进行纯化，使用Double SPRI bead方法回收，回收选取450-700bp的片段；
（3）采用Agilent的Bioanalyzer DNA 7500 LabChip进行DNA片段质量评价；
（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
（5）接头连接磷酸：接头5’链末端是引物端，带有生物素，使用T4多聚核苷酸激酶在接头一侧标签处，平端化的5’末端连接磷酸基团，连接10小时，连接磷酸后的接头为接头b:
5′GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3′
3′CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5′。
标签为TCACTAGT和AGTGATCT；
（6）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过T4连接酶与平端化的DNA片段相连，连接7小时；
（7）连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上；
（8）利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段，使用高保真DNA聚合酶进行PCR 扩增，得到双链DNA文库；
（9）DNA文库分离：使用KOH溶液对双链DNA文库进行变性，使用M280链霉素抗生物素蛋白磁珠将未结合生物素的DNA片段洗脱下来，即为测序文库。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种构建高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤:
（1）样品DNA提取及定量；
（2）DNA片段化、纯化及片段选择：使用Covaris超声波打断仪打断DNA，温度在20℃以下，使DNA样品成为400-700bp，纯化回收；所述纯化回收为先用Qiagen的MinElute进行纯化，然后使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳胶回收；回收选取450-700bp的片段。
（3）DNA片段质量评价；所述质量评价采用Agilent的Bioanalyzer DNA 7500 LabChip；
（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
接头连接磷酸：接头5’链末端是引物端，带有生物素，在接头的一侧有标签，其中平端化的接头5’末端连接磷酸基团；所述连接磷酸后的接头为接头a:
5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3′
3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp5′；所述与平端化的DNA片段相连采用的连接酶为T4连接酶，所述连接磷酸使用T4 多聚核苷酸激酶，连接6小时以上；
（5）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过连接酶与平端化的DNA片段相连；
（6）DNA文库固定；所述DNA文库固定，为连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上；
（7）小片段去除，PCR扩增，得到DNA文库；所述小片段的去除利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段；所述PCR扩增采用高保真DNA聚合酶；
DNA文库分离：对DNA文库进行变性，将未结合生物素的DNA片段洗脱下来，即为测序文库。
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