CN102485979B - Ffpe样品核酸文库，其构建方法和ffpe样品分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种FFPE样本核酸文库，其构建方法和分析FFPE样本的方法。具体的，本发明的核酸文库通过FFPE样本核酸的提取；核酸片段化；DNA片段末端修复及3’端连接“A”碱基；接头的连接及定量；片段选择；PCR扩增等步骤。本发明构建的FFPE文库能与目标序列捕获技术和测序技术相结合，为FFPE样本的分析提供了一种新的方法。

Description

FFPE样品核酸文库,其构建方法和FFPE样品分析方法

技术领域

本发明涉及基因组学领域，特别是福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)样品核酸文库、其构建方法及一种FFPE样品的分析方法。 

背景技术

组织样品的保存多采用福尔马林固定石蜡包埋的方法，该方法在临床和科研领域的应用已有一个世纪。数量巨大的归档FFPE样品为回顾性研究，阐明疾病机制，发现治疗靶标和指示预后提供宝贵的资源。现阶段FFPE样品仅限于病理学观察，分子水平的研究正在兴起，可行性尚无定论。FFPE样品的研究极具挑战，首先，石蜡包埋的医疗样本十分珍贵，每个样本总量都很有限且不可替代；其次组织样品在离体后就开始发生降解，福尔马林的固定会使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响。因此如何从有限的且容易发生核酸降解的FFPE样本中成功提取可用于后续反应的核酸成为其用于分子水平回顾性研究的关键。 

第二代测序技术(next generation sequencing，NGS)，例如SOLEXA、SOLID、和454测序平台等^[1]，大大提高了测序速度，同时测序成本显著降低。但某些全基因组测序项目的费用还未达到人人都能承受的水平，因此选取感兴趣的目标区域，通过特定的方法富集目标区域后测序，能大大降低测序成本，缩短研究周期，集中精力深度挖掘数据。人类全基因组的大小约为3Gb，其中蛋白编码序列仅占1％，约30Mb，以散在分布的外显子形式存在，约18万个。人类基因组的突变主要集中在外显子，占85％，且外显子的突变与疾病的发生密切相关，因此，选择性 的测定外显子序列是一个高效的研究人类疾病的策略。外显子测序是富集全基因组中的外显子，而后进行测序的技术，其富集方法有NimbleGen的基于DNA微阵列的固相杂交和Agilent的Sureselect液相杂交技术等。利用外显子测序技术可高效地对多份FFPE样本的外显子序列进行测定，并对外显子区域的变化进行分析，从而找到与疾病发生相关的基因，为疾病的预防、诊断和治疗提供依据。 

由于FFPE样本的特殊性，目前尚未有FFPE样本可否用于外显子捕获测序的论证，并且也没有相应方法的报道。虽然已经有许多商品化的FFPE样本DNA提取试剂盒，如Ambion公司的RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit，QIAGEN公司的 

DNA FFPE Tissue Kit等。DNA提纯的主要步骤包括二甲苯脱蜡，乙醇去除二甲苯，组织裂解缓冲液和蛋白酶K消化组织，高温帮助恢复分子交联以及DNA纯化。完全按照试剂盒的方法提取的FFPE核酸并不能很好地用于某些分子水平的研究^[2]。 

发明内容

发明人面对现有技术的缺陷，通过提供一种FFPE样本核酸文库及其构建方法，建立了将核酸测序技术和目标序列捕获技术用于分析FFPE样本的方法。 

本发明的一个方面提供了一种FFPE样本核酸文库的构建方法，包括以下的步骤： 

步骤一FFPE样本核酸的提取； 

步骤二核酸片段化 

片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将核酸打断为大小为200-300bp的片段； 

步骤三DNA片段末端修复及3’端连接“A”碱基； 

步骤四接头的连接 

将末端连接“A”碱基的DNA随机片段末端连接序列已知的接头； 

步骤五片段选择 

将连接产物进行琼脂糖电泳，选择350-400bp进行切胶纯化； 

步骤六PCR扩增 

根据已知的接头序列设计引物，进行PCR扩增，即得到FFPE样本核酸文库。 

本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤一所述核酸的提取包括以下步骤： 

FFPE样本切片，切片浸于二甲苯或右旋柠檬烯中去除石蜡，振荡混匀后离心去除上清；用无水乙醇洗涤以去除二甲苯或右旋柠檬烯，离心去除上清；每10mg组织加200-500μL裂解缓冲液和1-3mg蛋白酶K，在消化期间添加2-4次蛋白酶K，50-60℃消化15-20小时；消化后75-95℃孵育30-60分钟；对所得DNA进行纯化；所述裂解缓冲液成分：10-50mmol/L Tris-HCl，pH7.4；100-500mmol/LNaCl；5-20mmol/LEDTA，pH8.0；1-2％重量SDS。 

本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤一所述核酸的提取包括以下步骤： 

FFPE样本切片2-10微米，切片浸于二甲苯或右旋柠檬烯中去除石蜡，振荡混匀后离心去除上清；用无水乙醇洗涤以去除二甲苯或右旋柠檬烯，离心去除上清；每10mg组织加300μL裂解缓冲液和1.5mg蛋白酶K，在消化期间添加2-4次蛋白酶K，56℃消化16小时；消化后90℃孵育45分钟；所得DNA进行纯化；所述裂解缓冲液成分：10mmol/LTris-HCl，pH7.4；150mmol/LNaCl；10mmol/L EDTA，pH8.0；1.5％重量SDS。 

本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤二所述片段化使用超声的方法，超声使用低强度，多次打断。一般常用的超声打断仪都会有低强度超声和高强度超声的选择。例如使用Covaris超声打断仪打断，可以选择模式Frequency Sweeping mode，打断参数设置为Duty Cycle10％，Intensity5，Cycles per Burst200，共打断2-3次，每次打断时间为60-110秒，优选75秒。 

 本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤二所述打断后的片段化DNA在包括但不限于T4 DNA聚合酶、Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶等酶的作用下，进行末端修复，形成平末端的DNA随机片段，然后在包括但不限于Klenow(3’-5’exo-)酶的作用下，在平末端化的DNA随机片段的3’末端连接“A”碱基。 

本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤六所述PCR扩增，退火及延伸时间为45秒。 

本发明的另一个方面提供上述方法构建所得的文库。 

本发明的另一个方面还提供了一种分析FFPE样品的方法，包括构建上述FFPE样本核酸文库的步骤。 

本发明提供的分析FFPE样品的方法的一个实施例中，还包括对文库进行核酸测序的步骤。 

本发明提供的分析FFPE样品的方法的一个实施例中，还包括捕获文库中的目标序列，并对所捕获的目标序列进行测序的步骤。目标序列的种类包括但绝不限于外显子序列。 

本发明所指的FFPE样品即福尔马林固定石蜡包埋的组织样品，处理程序可以为组织样品4-10％甲醛固定14-20小时，彻底脱水后石蜡包埋。 

本发明所指目标序列捕获是指利用固相芯片或液相杂交等方法对目标序列进行捕获的技术。目前市场上实现这一目的的技术手段主要有NimbleGen的序列捕获芯片(Sequence Capture Microarrays)和Agilent液相杂交序列捕获技术(SureSelect Target Enrichment System)。 

当序列捕获的目标位外显子，并进一步结合测序技术时，产生了外显子测序技术。外显子测序是一种选择性地测定人类基因组中蛋白编码区的高效技术，以此找到与罕见或普通疾病相关的新基因。(Sarah B Ng，Kati J Buckingham，Choli Lee，Abigail W Bigham，Holly K Tabor，Karin M Dent，Chad D Huff，Paul T Shannon，Ethylin Wang Jabs，Deborah A Nickerson，Jay Shendure & Michael J Bamshad.(2010)Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder.Nature Genetics 42，30-35.) 

其中，所述测序可通过任何测序方法进行，包括但不限于双脱氧链终止法；优选高通量的测序方法，包括但不限于第二代测序技术或者是单分子测序技术。所述第二代测序技术(Metzker ML.Sequencing technologies-the next generation.Nat Rev Genet.2010Jan；11(1)：31-46)包括但不限于SOLEXA、SOLID和454(焦磷酸测序)测序技术(平台)；所述单分子测序技术(单分子测序平台)包括但不限于Helicos公司的True Single Molecule DNA sequencing技术，Pacific Biosciences公司的the single molecule，real-time(SMRT.TM.)技术，以及Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序技术等(Rusk，Nicole(2009-04-01).Cheap Third-Generation Sequencing.Nature Methods 6(4)：244-245)。 

本发明通过控制超声强度使打断片段长度尽量集中在250-300bp，减少DNA的损失以利于文库构建；并且在PCR前增加一步切胶纯化350-400bp的片段，连接产物切胶在许多普通样品中是可有可无的步骤，但是在FFPE样品中如果少了这一步而直接做PCR，会导致PCR酶主要扩增小片段，而目的片段大小的扩增效率降低。 

本发明提供的FFPE样本核酸文库的构建方法的一个实施例中，步骤六所述PCR扩增，其中退火及延伸时间为40-60秒，循环数为6-10个。在普通样品建库流程的相应PCR步骤中，PCR的退火时间一般为10-30秒，延伸时间为每500bp 30秒，而在FFPE样品中使用这些时间会使文库扩增成功率较低，推测是由于样品原因导致酶反应效率降低，因此作为优选地步骤，本发明中退火及延伸时间均延长至40-60秒，优选为45秒。结果提高了建库成功率和文库浓度并使文库达到相应大小。 

现有的FFPE核酸提取试剂盒中提到消化时间缩短至1小时，但由于FFPE样本中核酸与蛋白发生交联，1小时不足以消化与核酸交联的蛋白，导致提取的核酸纯度低，有蛋白污染，影响后续的反应。核酸纯度的高低直接影响下游分子反应的效率，因此我们延长消化时间至15-20小时，有效的提高核酸的纯度和下游反应的效率。 

现有的FFPE核酸提取试剂盒中提供的方法在消化时只加一次蛋 白酶K，但是在大部分情况下，只加一次不足以使蛋白消化完全。若在一次中加过量的蛋白酶K，也不能达到完全消化的效果。因此我们采用多次添加蛋白酶K的方法，使蛋白消化完全。 

本发明采取分次添加蛋白酶K，并采用较长的消化时间，有效提高了FFPE DNA的产率和纯度并解除蛋白质与DNA的交联，这些将有利于下游反应的顺利进行。 

附图说明

图1.胃癌旁组织冷冻及FFPE样品提取的DNA琼脂糖凝胶检测图；D2000与λHindIII均为分子量Marker，Frozen为冷冻样本的DNA泳道，FFPE为FFPE样本的DNA泳道。 

图2.胃癌旁组织冷冻及FFPE样品外显子捕获文库琼脂糖凝胶检测图；D2000与λHindIII均为分子量Marker，Frozen为冷冻样本的外显子捕获文库泳道，FFPE为FFPE样本的外显子捕获文库泳道。 

图3.不同打断参数时FFPE打断样品的电泳图； 

D2000，50bp为分子量Marker；1.低强度Duty Cycle 10％，Intensity 5，Cycles per Burst 200时FFPE样品打断，共打断2次，打断时间分别为110s和80s；2.高强度Duty Cycle 20％，Intensity5，Cycles per Burst 200时FFPE样品打断，共打断3次，打断时间分别为95s、50s和45s。 

图4.片段选择连接产物对文库扩增的影响； 

1.连接产物不切胶直接PCR；2.连接产物切胶后PCR；D2000为marker。 

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。 

实施例中所用主要试剂： 

实施例1人胃癌旁FFPE组织样品DNA提取 

FFPE样品切成每片5微米厚，共10片放于Eppendorf管中用于提取。先加1毫升二甲苯去除石蜡，振荡混匀后最大速度离心3min，去除上清；加1毫升无水乙醇洗涤以去除二甲苯，振荡混匀后最大速度离心3min，去除上清，室温挥发剩余乙醇；加180微升裂解缓冲液并加20微升20mg/ml蛋白酶K 50℃消化，在消化期间添加三次20微升20mg/ml蛋白酶K，消化时间16小时；消化后80℃孵育10min，逆转福尔马林交联；0.6倍体积Ampure磁珠纯化DNA并去除小片段降解DNA。该组织的冷冻样品采用QIAGEN组织DNA提取试剂盒提取，方法参照厂家说明。提取的DNA检测图见图1。图1的结果表明相对于冷冻样品提取的DNA而言，FFPE样品的DNA存在降解现象，降解是由FFPE样品制作过程中造成的。FFPE样品的泳道胶孔与冷冻样品的对比可知蛋白去除较完全，表明去蛋白与去交联反应充分。 

实施例2打断条件对FFPE样品的影响 

实施例1所得FFPE DNA，使用Covaris超声打断仪(Covaris，美国)在低强度(Duty Cycle 10％，Intensity 5，Cycles per Burst 200时FFPE样品打断，共打断2次，打断时间分别为110s和80s)和高强度(Duty Cycle 20％，Intensity 5，Cycles per Burst 200时FFPE样品打断，共打断3次，打断时间分别为95s、50s和45s)，结果如图3所示。由于FFPE本身就是降解的样品，如果在打断时再使所需片段范围的DNA减少，会使起始量更低而不利于文库构建。按照正常的强度一次打断会导致250-300bp的位置DNA量减少，因此本发明采用低强度两次超声打断FFPE DNA，从图3中1泳道可观察到打断片段相对集中在250-300bp位置。而2泳道还有许多DNA处在750bp的位置，如果将这些DNA也打断至目的大小，将大大提高文库的浓度，从而提高建库成功率。 

实施例3FFPE核酸文库的构建： 

(1)样品打断：采用Covaris超声打断仪打断，打断目的大小为250-300bp，打断参数为Duty Cycle 10％，Intensity 5，Cycles per Burst200，共打断两次，每次打断时间为75s，打断样品用Ampure磁珠纯化。 

(2)打断样品末端修复：100ul修复体系分别加10x Polynucleotide Kinase Buffer 10ul，25mM dNTP mix 1.6ul，T4 DNA Polymerase 5ul，Klenow Fragment 1ul，T4 Polynucleotide Kinase 5ul，打断样品77.4ul。置于Thermocycles中20℃孵育30min，Ampure磁珠纯化。 

(3)末端加“A”，体系为50ul，10x blue buffer 5ul，5mM dATP 2ul，Klenow(3’-5’exo-)3ul，40ul上一步纯化的样品，混匀后置于Thermocycles中37℃孵育30min，磁珠纯化。 

(4)接头连接：由于该实验设计为冷冻及FFPE样品的外显子捕获文库混合后与一张NimbleGen外显子捕获芯片杂交进行外显子捕获，因此建库过程中采用带有index的接头区分两个不同样品。接头连接体 系(Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit，PE-400-1002，illumina)为50ul，10x T4 DNA Ligation buffer 5ul，Index PE Adapter(40uM)3ul，T4 DNA Ligase 5ul，37ul上一步纯化的样品，混匀后置于Thermocycles中16℃孵育过夜，磁珠纯化，洗脱体积为50ul。(Index PE Adapter来自Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit，PE-400-1001，illumina。连接buffer和连接酶来自Paired-End DNA Sample Prep Kit，IP-102-1001，illumina。) 

(5)片段选择：将连接产物进行2％琼脂糖电泳，切下350-400bp区域，用QIAGEN切胶纯化试剂和纯化，洗脱体积为100ul。 

(6)PCR扩增文库：体系为50ul，Pfx  buffer 5ul，ddH20 13.6ul，10mM dNTP 2ul，50mM MgSO₄ 2ul，10uM上下游引物各2ul，Pfxpolymerase 0.4ul，上一步纯化的样品23ul。PCR程序为94℃5min；8个循环的94℃30s，62℃45s，72℃45s；72℃10min。PCR产物进行磁珠纯化，洗脱体积为50ul。外显子捕获文库检测图见图2。图2的结果表明：用本发明的方法所建的FFPE样品文库与冷冻样品文库没有明显的差别，文库大小和浓度相当。(PCR扩增引物来自Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit，PE-400-1001，illumina。) 

实施例4接头连接后切胶步骤在FFPE样本核酸建库过程中的重要性 

实施例3步骤(4)所得连接产物分别经过或不经过步骤(5)的切胶步骤，然后进行步骤(6)的PCR扩增。结果如图4所示：连接产物切胶在许多普通样品中是可有可无的步骤，但是在FFPE样品中如果少了这一步而直接做PCR，会导致PCR酶主要扩增小片段，而目的片段大小的扩增效率降低。 

实施例5FFPE样本DNA的外显子捕获文库与NimbleGen的2.1M外显子捕获芯片杂交 

(1)将杂交仪(12-Bay Hybridization Systems，厂家：Nimblegen， #05223695001)电源打开，需要3h以上使得杂交仪温度稳定至42℃。将2个干浴器打开分别调至70℃和95℃。 

(2)根据NanoDrop定量各取冷冻及FFPE外显子捕获文库DNA1.5微克，与400微克Cot-1 DNA(封闭内含子)及0.6nmol hybridization enhancing 1及hybridization enhancing 2(封闭接头序列)置于SpeedVac中蒸干，温度设置为60度，一般需要1hr左右。(hybridization enhancing 1及hybridization enhancing 2来自Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit，PE-400-1001，illumina。)) 

(3)向蒸干的样品中加入11.2ul纯水，震荡混匀后置于离心机上全速离心3-30秒。将离心后样品转移至70℃干浴器中10分钟使DNA充分溶解。 

(4)将样品取出震荡后置于离心机上全速离心30秒。分别加入以下两种试剂： 

2X SC Hybridiation Buffer  18.5μl 

SC Hybridiation Component A    7.3μl 

(2X SC Hybridiation Buffer，SC Hybridiation Component A均来自序列捕获杂交试剂盒，Nimblegen，5340721001) 

(5)将样品震荡混匀后置于离心机上全速离心3-30秒。将离心后样品转移至95℃干浴器(美国Labnet AccuBlock，型号D1100-230V)中10分钟使DNA变性。 

(6)将样品取出震荡后置于离心机上全速离心30秒，置于杂交仪器(12-Bay Hybridization Systems，厂家：Nimblegen，#05223695001)上42℃离心管放置位置准备杂交。 

(7)杂交方法参照NimbleGen公司芯片杂交方法(NimbleGen Arrays User’s Guide，Version 3.1，7 Jul 2009，Roche NimbleGen，Inc.)。样品上样量35ul，42℃杂交64-72hr，用900ul 160mM NaOH洗脱，洗脱产物用QIAGEN MinElute PCR Purification Kit纯化，最终用80ulElution buffer洗脱。 

(8)捕获后文库PCR(捕获后文库PCR引物来自multiplexing  Sequencing primers and phix control kit，PE-400-1002，ILLUMINA)扩增，体系为Phusion Mix(Phusion Mix，F-531L，NEB)150ul，上下游引物各4.2ul，上述的80ul洗脱样品加85ul ddH₂0，混合后分6管进行PCR，PCR循环数为16。PCR反应后把6管混合并用Ampure磁珠纯化，洗脱体积为50ul。 

(9)根据Nanodrop检测浓度，将捕获前与捕获后PCR产物稀释至1ng/ul，终体积要求＞12ul，根据芯片上4个探针的扩增引物做Q-PCR计算外显子富集度，富集度＝(ef)ΔCt，其中ef为每对扩增引物的扩增效率，ΔCt为捕获前与捕获后文库Ct值之差。平均富集度应大于60。 

实施例6Solexa测序 

使用Agilent 2100 Bioanalyzer和Q-PCR检测文库产量，合格文库稀释到相应浓度后在Cluster Station中进行桥式PCR，使文库中各个模板成簇固定在Flow cell上。测序方法参照Illumina公司HiSeq2000操作方法(HiSeq 2000 User Guide.Catalog # SY-940-1001 Part #15011190 Rev B，Illumina)。测序质控文件见表1 

从表1可知，FFPE样本用于外显子测序的读数，数据产量及目标区域的覆盖度较冷冻样本的少，外显子捕获的均一性稍低于冷冻样本；而可定位到参考序列的读数比例与冷冻样本的相当；至少1个读数的目标区域覆盖率％也很接近。FFPE样本与对应的冷冻样品的外显子测序数据(表1)表明在单碱基测序深度达到20×时，单核苷酸多态性(SNP)位点的差异并不显著，且这些差异出现的原因可能是FFPE样品的DNA损伤造成的，表现为嘌呤与嘌呤之间及嘧啶与嘧啶之间的转换。说明FFPE样本可用于外显子测序且本发明成功建立了富集FFPE样本外显子并进行Solexa测序的技术。 

表1.胃癌旁冷冻组织及FFPE组织样品外显子捕获文库上机测序质控数据。 

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。 

参考文献： 

1、Metzker ML.Sequencing technologies-the next generation.Nat Rev Genet.2010 Jan；11(1)：31-46 

2、John B.A.Okello et.al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed  paraffin-embedded autopsy tissues.Analytical Biochemistry 400(2010)：110-117. 

3、Sarah B Ng，Kati J Buckingham，Choli Lee，Abigail W Bigham，Holly K Tabor，Karin M Dent，Chad D Huff，Paul T Shannon，Ethylin Wang Jabs，Deborah A Nickerson，Jay Shendure & Michael J Bamshad.Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder.Nature Genetics 42(2010)：30-35. 

Claims (10)

1.一种FFPE样本核酸文库的构建方法，包括以下的步骤：

步骤一FFPE样本核酸的提取

FFPE样本切片2-10微米，切片浸于二甲苯或右旋柠檬烯中去除石蜡，振荡混匀后离心去除上清；用无水乙醇洗涤以去除二甲苯或右旋柠檬烯，离心去除上清；每10mg组织加300μL裂解缓冲液和1.5mg蛋白酶K,在消化期间添加2-4次蛋白酶K,56℃消化16小时；消化后90℃孵育45分钟；所得DNA进行纯化；

所述裂解缓冲液成分：10mmol/LTris-HCl，pH7.4；150mmol/LNaCl；10mmol/L EDTA，pH8.0；1.5%重量SDS；

步骤二核酸片段化

片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将核酸打断为大小为200-300bp的片段；

步骤三DNA片段末端修复及3’端连接“A”碱基；

步骤四接头的连接

将末端连接“A”碱基的DNA随机片段末端连接序列已知的接头；

步骤五片段选择

将连接产物进行琼脂糖电泳，选择350-400bp进行切胶纯化；

步骤六PCR扩增

根据已知的接头序列设计引物，进行PCR扩增，即得到FFPE样本核酸文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤二所述片段化使用超声的方法，打断至目的大小为250-300bp。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述片段化使用Covaris超声打断仪打断，模式选择Frequency Sweeping mode,打断参数为Duty Cycle10%,Intensity5,Cycles per Burst200,共打断2-3次，每次打断时间为60-110秒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述打断时间为75秒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤六所述PCR扩增，其中退火及延伸时间为40-60秒，循环数为6-10个。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述退火及延伸时间为45秒。

7.权利要求1-6所述任一种方法构建所得的文库。

8.一种分析FFPE样品的方法，包括构建权利要求7所述文库的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括对所述文库进行核酸测序的步骤。

10.根据权利要求8所述的方法，还包括捕获所述文库中的目标序列，并对所捕获的序列进行核酸测序的步骤；所述目标序列种类包括外显子序列。

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