KR20080005188A

KR20080005188A - 선별 프로브 증폭

Info

Publication number: KR20080005188A
Application number: KR1020077021238A
Authority: KR
Inventors: 글렌 푸; 로라 스투베; 존 쉬한; 에이미 올만; 나이핑 센; 앤드류 비 스파크스; 데니스 발링거
Original assignee: 펄리건 사이언시스, 인코퍼레이티드
Priority date: 2005-02-14
Filing date: 2006-01-25
Publication date: 2008-01-10
Also published as: EP1856285A4; US20060183132A1; WO2006088623A3; MX2007009809A; WO2006088623A2; IL185082A0; CA2597657A1; EP1856285A2; AU2006214631A1; CN101155931A; JP2008529526A

Abstract

다수의 독특한 선별 프로브가 단일 배지 내에 제공된다. 각각의 선별 프로브는 고려하에 샘플 내에 존재할 수 있는 독특한 표적 서열에 상보적인 서열을 가진다. 예를 들어, 각각의 선별 프로브는 개체의 유전형 확정법에 사용되는 SNP 중 하나를 포함하는 서열에 상보적일 수 있다. 단일-가닥 선별 프로브는 선별 프로브 서열에 의해 특정화되는 독특한 표적 서열을 갖는 샘플 서열과 어닐링 또는 혼성화된다. 선별 프로브와 어닐링 또는 혼성화되지 않는 샘플의 서열은 적절한 기술에 의해, 결합된 서열로부터 분리된다. 다음, 결합된 서열이 유리되어, 단리된 표적 서열의 혼합물을 제공할 수 있으며, 이는 곧 적용에 필요한대로 사용될 수 있다.

선별 프로브

Description

선별 프로브 증폭 {SELECTION PROBE AMPLIFICATION}

본 발명은 핵산 샘플 내 미리-특정된 서열의 선별, 단리, 및/또는 증폭을 위한 방법, 프로브, 장치, 키트 등에 관한 것이다. 본 발명은 단일 반응 혼합물 내에 다수의 선별 프로브 (종종 수천 개) 를 적용한다.

통상적으로, 핵산 샘플의 미리-특정된 영역 또는 절편을 증폭하는데 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 이 사용된다. 다수의 변성 및 어닐링 주기에 걸쳐서, PCR 은 절편의 많은 추가 복사본을 생성한다. 종종, 핵산 샘플은 증폭에서 제외되는 많은 다른 서열 영역을 함유한다. 상기 경우, PCR 은 핵산 서열의 나머지로부터 관심 있는 미리-특정된 서열을 효과적으로 선별 또는 단리한다.

많은 흥미로운 적용분야 중에서도, PCR 은 핵산 샘플 내 다수의 독특한 서열을 증폭시키는데 적용된다. 이는 샘플이 증폭되어야 할 서열을 상대적으로 적게 함유한 경우 효과적인 툴이 될 수 있으나, 고려해야 할 서열이 많은 경우 고비용이면서 시간 소모적이게 된다. 증폭될 각각의 서열은 그 자체의 독특한 PCR 프라이머 세트를 필요로 한다. 프라이머 세트를 제조 또는 수득하는데 비용이 많이 들 수 있다. 추가로, 최근까지, 각각의 서열은 그 자체의 PCR 반응물이 든 그 자체의 반응 용기 내에서 개별 PCR 증폭 반응이 수행될 것을 요구하였다.

복합 PCR 은 상기의 어려움 중 일부를 다루는 방법이다. 복합 PCR 은 단일 반응 용기 내에서 다수의 서열을 증폭시킨다. 복합 PCR 에서, 용기는 분석할 샘플, 증폭될 각각의 서열에 대한 독특한 프라이머 세트, 뿐만 아니라 중합효소 및 모든 증폭 반응에 의해 공유될 디옥시리보뉴클레오티드 3 인산 (dNTP - 예를 들어, dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP) 을 포함한다. 따라서, 단일 반응 혼합물 내에서 수백 개의 서열을 동시에 증폭시키는 것이 가능해진다. 이는 효율성을 크게 향상시킬 수 있다. 그러나, 상기 방법은 증폭될 각각의 서열에 대한 독특한 프라이머 세트를 여전히 필요로 하고, 따라서 과정의 비용은 증폭 또는 단리될 서열의 수에 거의 비례한다. 추가로, 수백 개보다 훨씬 더 많은 수의 서열이 증폭되어야 하는 많은 적용분야가 있다. 예를 들어, 더 상위 종의 개개의 유전형을 완성시키기 위해서는, 수천 개의 서열이 증폭될 것을 필요로 한다. 따라서, 많은 개별 복합 PCR 반응이 수행되어야 한다. 명백하게는, 복합 PCR 에 의해 효율성이 수득된다 하더라도, 상기 방법은 매우 고비용적이고 시간 소모적이게 될 수 있다.

인간 게놈은 분석을 위한 특히 복합적인 샘플을 제시한다. 인간 게놈은 약 5 백만 내지 약 8 백만 개의 단일 뉴클레오티드 다형체 (SNP) 를 함유하는 것으로 보인다. 그 중에서, 약 250,000 개가 개개의 유전형을 완성시키는데 필요한 것으로 여겨진다. SNP 의 완전한 세트에 대한 정보를 얻기 위해서는, 가능하게는 수천 개의 상이한 복합 PCR 반응이 필요하다.

이는, 최근에 전체 인간 게놈을 맵핑함으로써 달성된 치료적 잠재성을 여는 데 있어서, 유의한 실용적인 장애를 나타낸다.

핵산 샘플로부터 다중 서열을 단리 또는 선별하기 위한 더욱 효율적인 기술이 상기 분야에서 중요한 발전을 제공할 것이다.

요약

본 발명은 단일 배지 내에서 다수의 독특한 선별 프로브 (전형적으로 그러한 수천 개의 프로브) 를 적용함으로써 핵산 샘플로부터 다수의 서열을 단리 또는 선별하는 진보된 기술을 제공한다. 각각의 선별 프로브는 고려할 샘플 내에 존재할 수 있는 독특한 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 예를 들어, 각각의 선별 프로브는 개체의 유전형을 확정짓는데 사용되는 하나 이상의 SNP 를 포함하는 서열에 상보적일 수 있다. 본 발명의 방법은 단일-가닥 (예를 들어, 변성, 이중-가닥) 선별 프로브가 선별 프로브 서열에 의해 특정화되는 (예를 들어, 그것과 상보적인) 독특한 표적 서열을 갖는 샘플 서열과 어닐링되거나 또는 혼성화될 수 있게 한다. 선별 프로브와 어닐링되거나 또는 혼성화되지 않는 샘플의 서열은 적절한 기술에 의해 결합된 서열로부터 분리된다. 다음, 결합된 서열은 유리되어서, 단리된 표적 서열의 혼합물이 제공될 수 있고, 이는 곧 적용에 필요한 대로 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 표적 서열은 샘플을 채취한 개체의 유전형을 알아내기 위해, 핵산 어레이와 접촉될 수 있다.

본 발명의 한 측면은 핵산 샘플로부터 표적 핵산 서열을 선별 또는 단리하는 방법을 제공한다. 본 방법은 하기 조작 순서를 특징으로 할 수 있다 :

(a) 샘플로부터 핵산 절편을 생성함 ;

(b) 핵산 절편을 증폭시킴 ;

(c) 선별 프로브 및 증폭된 핵산 절편 (선별 프로브에 상보적임) 사이의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에, 증폭된 핵산 절편을 단일 반응 배지 내에서 약 2000 개 이상, 또는 약 5000 개 이상, 또는 약 10,000 개 이상의 독특한 선별 프로브에 노출시킴 ;

(d) 선별 프로브에 강하게 결합되지 않은 증폭된 핵산 절편을 제거함 ; 및

(e) 어닐링된 증폭된 핵산 절편을 선별 프로브로부터 유리시킴. 본 방법에서, 선별 프로브는 표적 핵산 서열에 상보적이거나 또는 거의 상보적인 것으로 이해된다. 따라서, 어닐링된 증폭된 핵산 절편은 표적 핵산 서열을 함유한다. 상기 방법은 표적 핵산 서열을 효과적으로 선별 또는 단리한다.

상기 방법은 추가로 (e) 에서 유리된 표적 핵산 서열을 바탕으로 핵산 샘플을 특징화하는 추가의 조작을 함유할 수 있다. 한 구현예에서, 이는 핵산 어레이에 표적 핵산 서열을 적용함으로써 수행된다. 이를 위해, 상기 방법은 또한 (i) (e) 에서 유리된 표적 핵산 서열을 증폭시키고, (ii) 표적 핵산 서열을 핵산 어레이와 접촉시키기 전에 표적 핵산 서열을 표지하는 것을 포함한다. 또다른 이행 상세사항에 따르면, 상기 방법은 표지 및/또는 어레이와 접촉시키기 전에 표적 핵산 절편을 추가로 절편화시킨다.

샘플에서 절편을 생성하는데 (조작 (a)) 적용되는 조건은 상기 방법의 나머지에 적절한 크기 및 구조를 가진 절편을 제공하도록 선택된다. 한 구현예에서, 절편화는 평균 길이가 약 25 내지 약 2,000 개 염기쌍 이상, 및 바람직하게는 약 500 개 염기쌍인 핵산 절편을 생성한다. 일부 방법을 위해, 절편화는 추가의 절편화 없이 마이크로어레이 상에서 유전형을 확정할 수 있도록 평균 크기의 핵산 절편을 생성한다. 일부 경우, PCR 억제로서 알려진 현상을 피하기 위해서는 증폭 전 1 단계 및 증폭 후 나머지 1 단계인 2 단계에서 절편화를 수행할 필요가 있다 (조작 (b)).

특정 구현예에서, 증폭은 절편화 조작 (a) 에 의해 생성된 핵산 절편 중 실질적으로 모든 것에 대해 PCR 을 사용함으로써 수행된다. 이 방법은 각각의 절편에 대한 독특한 프라이머를 제공하지 않으면서 달성되도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 핵산 절편의 말단에 "어댑터" 를 부착시키는 것을 포함할 수 있다. 어댑터는 PCR 증폭에 사용되는 범용 프라이머에 상보적인 상대적으로 짧은 서열을 포함한다. 모든 어댑터가 동일한 서열을 갖는 경우 또는 어댑터가 단지 소수의 상이한 서열을 포함하는 경우, 모든 절편을 증폭시키는데 있어서 단지 1 개의 또는 소수의 프라이머 세트만이 필요하다. 즉, 절편 내에 포함된 특정 서열에 상관없이, 제한된 세트의 프라이머가 어댑터를 가진 모든 절편을 증폭시킬 수 있다. 한 특정 구현예에서, 어댑터는 단일-가닥 꼬리 또는 돌출부가 있는 이중-가닥 서열이다. 또다른 특정 구현예에서, 어댑터는 추가의 기능을 가지는데 : 어댑터는 후속한 증폭 조작에서 PCR 프라이머로서 작용한다. 이 구현예에서, 모두는 아닌 일부 어댑터는 샘플 절편에 연결된다. 용액 내에 남아 있는 어댑터는 후속해서 요구되는 프라이머를 제공하도록 작용된다.

특정 구현예에서, 증폭은 예를 들어 조작 (e) 후에 마이크로어레이와의 접촉을 통한 추가의 분석 전에, 표적 핵산으로부터 생성된 핵산 절편 중 실질적으로 모든 절편에 대한 PCR 을 사용하여 수행된다. 이 구현예는 핵산 절편을 증폭시키는데 사용되는 것과 동일한 서열을 갖는 프라이머를 사용할 수 있으나 (조작 (b) 에서), 과량의 이중-가닥 어댑터를 사용하는 대신에, 단일-가닥 프라이머를 첨가할 수 있다.

기술된 방법은 선별 프로브에 결합하지 않는 절편으로부터 선별 프로브에 결합하는 절편을 분리한다. 이는 많은 방식으로 수행될 수 있다. 한 방식에서, 선별 프로브 (단일- 또는 이중-가닥일 수 있음) 는 비결합 샘플 절편을 제거하기 위해 세척 또는 처리될 수 있는 고체 기질에 결합한다. 이 접근법을 수행하기 위해서, 선별 프로브는 우선 증폭된 핵산 절편과 접촉된 다음 (조작 (c)), 고체 기질에 연결될 수 있다. 1 개 이상의 선별 프로브 하위세트를 조작 (c) 및 (d) 사이에서, 증폭된 핵산 절편에 어닐링할 수 있다. 선별 프로브를 고체 기질에 연결하기 위해, 고체 기질에 단단히 결합하는 부분을 프로브에 포함시킬 수 있다.

선별 프로브에 강하게 결합하지 않는 (그리하여, 고체 기질에도 강하게 결합하지 않는) 증폭된 핵산 절편을 제거하기 위해, 방법은 기질을 세척하여 비결합 또는 약하게 결합된 핵산 절편을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 한 방법에서, 상기 방법은 결합된 선별 프로브로부터 부분적으로 어닐링된 증폭된 핵산 절편을 제거하는 조건 하에 용액에 고체 기질을 노출시키는 것을 포함한다. 상기 부분적으로 어닐링된 증폭된 핵산 절편은 표적 서열에 비해 하나 이상의 미스매치부분을 함유할 수 있고, 따라서 선별 프로브 중 어느 것에도 완전히 상보적일 수 없다.

본 발명의 유의한 이점은 단일 반응 배지 내에서 수천 개의 독특한 표적 서열을 선별 또는 단리하는 능력이다. 이를 위해, 반응 배지는 수천 개의 서열 특이적인 선별 프로브를 포함할 수 있는데 ; 예를 들어, 약 10⁵ 내지 약 10⁸ 개의 상기 선별 프로브를 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서, 복합 PCR 을 능가하는 유의한 이점은 단지 수천 개의 독특한 선별 프로브, 예를 들어, 약 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 1,000,000 또는 10,000,000 개 이상의 프로브를 사용하는 경우에 실현될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 초기의 증폭에 단일 프라이머를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기 조작을 특징으로 할 수 있다 :

(a) 혼합물 내 표적 및 비-표적 핵산 절편의 말단에 어댑터 서열을 적용함 ;

(b) 표적 및 비-표적 절편을 증폭시키는 중합효소 연쇄 반응을 수행함 (여기서, 과량의 어댑터를 변성시킴으로써 제공되는 것 외에는 어떤 프라이머 서열도 표적 및 비-표적 절편을 증폭시키는데 필요하지 않음) ;

(c) 선별 프로브와 표적 핵산 절편의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에, 증폭된 표적 및 비-표적 절편을 복수의 선별 프로브와 동시에 접촉시킴 ; 및

(d) 어닐링된 표적 핵산 절편 (상기 선별 프로브에 결합됨) 으로부터 비-어닐링된 비-표적 핵산 절편 및 부분-어닐링된 비-표적 핵산 절편을 분리하여, 표적 핵산 절편을 선별함. 상기 기술된 방법에 따르면, 선별 프로브는 표적 핵산 절편의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 바람직하게는, 어댑터 서열은 길이가 약 15 내지 40 개 염기쌍인 서열을 포함하고/거나 또는 약 10-내지 100-배 초과의 범위 내에서 절편 말단의 수를 초과하여 존재한다.

한 구현예에서, 어댑터 서열은 이중-가닥 핵산 서열이다. 상기 서열은 하나의 블런트 말단 및 하나의 비-블런트 (스티키) 말단을 가질 수 있다. 이 구현예에서, 블런트 말단은 핵산 절편의 말단에 부착되는데 사용될 수 있다. 자가-어닐링을 방지하기 위해, 스티키 말단을 갖는 이중-가닥 어댑터는 그 자체에 상보적이지 않은 돌출부를 갖도록 디자인될 수 있다. 추가로, 어댑터의 자가-연결을 방지하기 위해, 어댑터의 한 가닥에는 어댑터의 블런트 말단에서의 연결에 필요한 부분 (예를 들어, 5' 인산기) 이 없을 수 있다.

본 발명의 더욱 또다른 측면은 비-표적 핵산 절편으로부터 표적 핵산 절편을 동시에 단리하는데 사용되는 선별 프로브의 세트에 관한 것이다. 상기 프로브 세트는 하기를 특징으로 할 수 있다 : (a) 공통 배지 내에 약 1,000, 또는 5,000 또는 10,000 개 이상의 독특한 선별 프로브를 가지고, (b) 여기서, 각각의 독특한 선별 프로브의 길이는 약 20 내지 1000 개의 염기쌍이다. 한 구현예에서, 각각의 선별 프로브는 모두 단일 게놈에서 발견되는 하나 이상의 독특한 SNP 를 포함하는 독특한 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 각각의 독특한 표적 서열은 단지 하나의 SNP 만을 포함한다. 다른 구현예에서, 각각의 독특한 표적 서열은 2 개 이상의 SNP 를 포함한다. 더욱 추가의 구현예에서, 일부 표적 서열은 단지 1 개의 SNP 만을 포함하는 반면, 다른 표적 서열은 2 개 이상의 SNP 를 포함한다.

선별 프로브는 이중- 또는 단일-가닥일 수 있다. 프로브는 특정 PCR 반응과 같은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 상기 세트는 약 10⁴ 내지 10⁷ 개의 독특한 선별 프로브, 또는 더욱 특이적인 경우 약 10⁴ 내지 10⁵ 개의 독특한 선별 프로브를 포함할 수 있다. 특정 경우, 선별 프로브는 길이가 약 50 내지 200 개의 염기쌍인 PCR 증폭산물이다.

추가의 구현예에서, 각각의 독특한 선별 프로브는 선별 프로브 서열과는 별도로, 고체 기질에 결합할 수 있는 부분을 함유한다. 예로서, 상기 부분은 비오틴 또는 스트렙타비딘일 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 비-표적 핵산 절편으로부터 표적 핵산 절편을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 (i) 상기 기술된 바와 같은 선별 프로브 세트 (예를 들어, 공통 배지 내의 약 1,000 또는 2,000 또는 5,000 또는 10,000 개 이상의 독특한 선별 프로브) ; 및 (ii) 선별 프로브 상의 부분과 결합하는 표면 특징을 가져서 고체 기질 상에 선별 프로브를 고정시킬 수 있는 고체 기질을 포함한다. 예로서, 고체 기질은 비드의 형태를 취할 수 있다. 추가로, 선별 프로브는 고체 기질에 결합하는 부분 (표면 특징을 통해) 을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상기 키트는 또한 핵산 절편의 증폭을 위한 프라이머 및 중합효소를 포함할 것이다. 키트는 또한 표적 핵산 절편에 상보적인 서열을 포함하는 마이크로어레이를 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 완전한 조작 순서는 하기를 포함한다 :

(1) 적절한 크기의 핵산 절편을 게놈으로부터 생성함,

(2) 보편적인 어댑터를 절편의 양 말단에 첨가하여, 하나의 프라이머 또는 단순 프라이머 세트를 사용한 증폭을 가능하게 함,

(3) 절편을 증폭시킴,

(4) 증폭된 절편을 관심 있는 SNP 위치에 있는 서열에 상보적인 선별 프로브와 어닐링함 (상기 프로브는 고체 기질에 첨부될 수 있는 비오틴 또는 기타 분자 특징을 함유함),

(5) 선별 프로브 (상보성 서열과 함께) 를 고체 기질에 연결함,

(6) 기질을 세척하여, 비결합된 게놈 절편 및 느슨하게 결합된 게놈 절편을 제거함,

(7) 상보성 게놈 절편을 고정된 선별 프로브로부터 변성에 의해 분리함,

(8) 초기의 증폭 과정에 사용되었던 것과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 프라이머를 사용해 선택된 게놈 절편을 증폭시킴,

(9) 증폭된 절편을, 마이크로어레이와의 결합에 적절하도록 더 작은 크기의 절편으로 절편화시킴, 및

(10) 상기 절편을 마이크로어레이 상의 표적 프로브에 혼성화시켜, 게놈의 유전형을 알아냄.

본 발명의 상기 및 기타 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조로 하여 하기에서 더욱 상세히 기술될 것이다.

도 1 은 본 발명의 구현예에 따라, 샘플로부터 표적 핵산 서열을 단리하는 구체적인 방법을 기술한 과정 순서도이다.

도 2A 및 2B 는 핵산 가닥을 다중 절편 (그 중 일부는 관심 표적 서열을 함유함) 으로 절편화시키는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 3A 는 후속하는 증폭을 가능하게 하기 위해, 절편의 말단에 어댑터가 부착된 도 2B 의 절편을 나타낸 것이다.

도 3B 는 이중-가닥 어댑터를 핵산 절편의 블런트 말단에 부착하는 연결 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 3C 는 어댑터의 블런트 말단에 연결 부분 (예를 들어, 인산기) 이 없어서 자가-연결이 방지되도록 디자인된 어댑터 구조를 보여준다.

도 3D 는 절편 가닥을 부착된 어댑터와 중합시켜서, 이중-가닥 구조에서 닉 (nick) 위치 뒤에 있는 어댑터 서열을 제거하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 4A 는 표적 서열의 선별이 선별 프로브를 사용하여 수행될 수 있는 배지를 나타낸 것이다.

도 4B 는 처음의 서열을 변성시킨 다음, 단일-가닥 선별 프로브 및 단일-가닥 표적 핵산 절편 사이의 결합을 촉진시키는 조건 하에 그것들을 다시 어닐링하는 처리 후의 도 4A 의 배지를 나타낸다.

도 5 는 선별 프로브를 함유하는 이중-가닥 핵산의 고체 지질에의 고정화를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 6 은 선별 프로브와, 표적 핵산 서열 내 SNP 위치 사이의 연결의 3 가지 예를 보여준다.

도 7 은 샘플 핵산 절편이 선별 프로브에 "결합될" 수 있는데, 한 경우에는 단단하게 결합될 수 있고, 또다른 경우에는 느슨하게 결합될 수 있는 2 개의 상이한 시나리오를 나타낸 것이다.

도 8 은 단리된 표적 핵산 서열을 증폭시키고 추가로 절편화시키는 방법을 나타낸 것이다.

도 9 는 단리된 표적 서열을 DNA 마이크로어레이와 같은 핵산 어레이와 접촉시키는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.

바람직한 구현예의 설명

도입 및 개요

본 발명은 약 1000, 2000, 5000, 10,000, 30,000, 50,000, 80,000, 100,000, 1,000,000, 또는 10,000,000 개 이상의 독특한 선별 프로브를 함유하는 단일 배지를 사용한다. 각각의 선별 프로브는 특정 SNP 와 연관된 서열과 같이 관심 있는 독특한 표적에 상보적인 서열을 갖는다. 선별 배지를 사용하여, 핵산 샘플 (예를 들어, 게놈 DNA) 의 절편이 선별 프로브와 어닐링되고, 그리하여 "선별" 되게 한다. 따라서, 단일 배지를 사용하는 단일 단계에서, 수천 개의 표적 절편은 샘플 내에서 비-표적 절편으로부터 동시에 선별된다. 본 방법은 단일 반응 배지 내에서 단지 수백 개의 선별성 증폭만이 동시에 일어날 수 있는 복합 PCR 과 선호할만하게 비교된다. 즉, 본 발명은 매우 복합적인 핵산 샘플 내에서 표적 서열을 효율적으로 풍부하게 한다.

선별 배지 자체는 당업계에서의 진보를 나타낸다. 한 예에서, 선별 배지는 약 10,000 개 이상의 상이한 선별 프로브를 함유하고, 각각의 선별 프로브는 길이가 약 50 내지 500 개의 염기쌍이고, 고체 기질에의 연결을 유용하게 하는 부분을 함유하여, 어닐링된 표적 절편을 비-어닐링된 비-표적 절편으로부터 분리할 수 있게 한다.

하기에 상세히 기술될 흥미있는 또다른 점은 보편적인 어댑터 서열의 사용으로서, 이 어댑터 서열은 단일 프라이머가 게놈 샘플으로부터 생성되는 많은 수천 개의 핵산 절편 모두를 증폭시킬 수 있게 한다. 동시에 증폭된 샘플 절편은 많은 상이한 서열을 가질 것이다. 두번째의 증폭이 상기 방법 중에서 나중에 적용된다면, 동일한 단일 프라이머가 다시 사용될 수 있다. 예를 들어, 선별 프로브에 결합됨으로써 선별되는 표적 절편이 추가로 증폭되는 경우, 동일한 프라이머가 상기 표적 절편을 따로 증폭시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 실례의 방법을 위한 조작의 순서에 관한 일반적인 개요는 도 1 에 나타나 있다. 보여진 바와 같이, 참조 번호 101 번은 전체 방법을 규명하고 있으며, 이 방법은 핵산 샘플 (예를 들어, 복합 게놈 샘플) 의 절편화로 시작된다. 조작 103 을 참조한다. 하기에 설명된 바와 같이, 다양한 절편화 기술이 상기 목적을 위해 적용될 수 있다. 주어진 이행을 위해 선택된 한 기술은 목적하는 크기 범위 및 말단 구조를 갖는 절편을 제조할 것이다.

다음, 블록 105 에서 나타낸 바와 같이, 어댑터는 조작 103 에서 생성된 샘 플 절편에 부착된다. 어댑터는 일부 구현예에서만 제한된 수의 프라이머를 사용하여, 서열과는 무관하게 모든 절편을 증폭시킬 수 있도록 사용된다. 어댑터는 프라이머에 상보적인 서열을 가진다. 하기 설명된 바와 같이, 일부 구현예에서, 용액 내 과량의 어댑터는 프라미어 그 자체로서 작용할 수 있다. 어댑터가 부착된 후에, 샘플은 블록 107 에서 지시된 바와 같이 증폭된다. 전형적으로, 이는 적절한 프라이머, 예를 들어, 자유 어댑터 서열을 사용한 PCR 방법을 포함한다.

다음, 조작 109 에서, 증폭된 샘플 절편은 변성되어, 이어서 대규모 선별 프로브 수집물과 어닐링되는 단일-가닥 서열을 생성하고, 각각은 게놈 샘플로부터 단리되는 특정 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 선별 프로브는 단일-가닥 형태로 도입될 수 있거나, 또는 이중-가닥 형태로 도입되고 증폭된 샘플 절편과 동시에 변성될 수 있다. 상기 지시된 바와 같이, 단일 유체 배지는 많은 상이한 프로브 서열을 함유하는데, 종종 많은 수천 개의 상이한 프로브 서열을 함유한다. 이는, 선행 기술에 의해 수득되는 것보다 더욱 더 효율적으로 표적 서열을 선별할 수 있게 한다.

어닐링 방법이 완결된 후에, 많은 단일-가닥 선별 프로브가 샘플의 상보적인 표적 절편과 어닐링되어, 이중-가닥 핵산 서열을 생성할 것이다. 다음, 선별 프로브는 블록 111 에서 지시된 바와 같이 고체 기질에 부착된다. 한 구현예에서, 선별 프로브는 고체 기질에 연결될 수 있도록 하는 부분을 함유하여, 선별 프로브의 1 개 이상의 단일 가닥을 함유하는 핵산에 고정되는 것을 제한한다.

다음, 블록 113 에서 지시된 바와 같이, 비결합된 절편이 고체 기질로부터 제거된다. 물론, 상기 기질은 여전히 고정된 선별 프로브를 함유하고 있을 것이고, 그 중 일부는 상보성 게놈 절편과 어닐링된다. 조작 113 의 제거는 하기기술되는 바와 같은 한정된 세척 프로토콜을 적용할 것이다.

방법 101 에서 다음 조작은 포착된 단일-가닥 절편 (표적 서열을 가짐) 을 고체 지질에 연결된 선별 프로브로부터 유리시키는 것을 포함한다. 이는 단순히, 결합된 이중-가닥 절편을 변성시키는 조건에 고체 기질을 노출시키는 것을 포함한다. 단지 선별 프로브만이 고체 지질에 그것들을 연결시키는 부분을 함유하기 때문에, 포착된 표적 절편은 유리되어서 추가 분석용 용액에 다시 들어간다. 상기 분석 전에, 표적 절편은 블록 117 에서 지시된 바와 같이 임의로 증폭될 수 있다. 그리고, 분석 기술에 따라, 절편은 절편의 포착, 취급 및 추가 분석을 할 수 있도록 더 작은 크기로 추가로 절편화될 필요가 있을 수 있다. 마지막으로, 블록 119 에서 지시된 바와 같이, 단리된 표적 절편은 표적 서열이 게놈 샘플 내에 존재하는지 정확히 알아보기 위해 추가로 분석된다. 지시된 바와 같이, 이는 고정된 핵산 서열의 마이크로어레이를 사용하여 수행될 수 있다. 직접 서열화와 같은 기타 기술이 또한 적용될 수 있다.

방법 101 의 조작 중 모든 것이 본 발명의 모든 이행에 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 일부 구현예는 샘플 절편을 미리-고정된 단일-가닥 선별 프로브와 혼성화시킬 수 있다. 상기 구현예에서, 선별 프로브는 그것들이 고정되는 고체 기질 (예를 들어, 비드, 칼럼, 마이크로어레이 등) 과 함께 공급된다. 이 경 우, 표적 샘플 절편은 이미 고체 기질 상에 있는 단일-가닥 선별 프로브와 혼성화될 것이다. 표적 절편에 혼성화된 프로브를 고체 기질에 부착하는 개별 단계는 이 구현예에서 필요하지 않다. 명백하게는, 프로브는 혼성화 전, 개별 조작에서 기질에 부착될 수 있다. 상기 방법으로부터 기타 특정 단계가 발생될 수 있다. 따라서, 상기 방법의 대체적인 특징화는 하기를 포함한다 :

(1) 핵산 샘플을 절편화시켜, 다수의 핵산 절편을 생성함 ;

(2) 증폭된 핵산 서열을, SNP 또는 기타 관심 있는 특징에 근접한 게놈 서열에 상보적인 서열을 갖는 선별 프로브와 어닐링시키거나 또는 혼성화시킴 ;

(3) 상기로부터 선별 프로브에 결합되지 않은 핵산 절편을 분리함 ; 및

(4) 선별 프로브에 이미 결합된 표적 핵산 절편의 유전자형을 확정하여, 관심 있는 유전자 좌에만 있는 핵산 샘플 (예를 들어 SNP) 을 선택적으로 유전자형을 확정함.

샘플 및 그의 절편

지시된 바와 같이, 본 발명의 방법을 핵산 샘플 상에서 수행한다. 샘플은 표적 및 비-표적 서열을 가질 것이다. 본 방법은 표적 서열을 선별 또는 단리함으로써 샘플을 풍부하게 한다. 그렇게 하는 경우, 상기 방법은 또한 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 복합 샘플 내에서 수백 개 또는 수천 개 또는 수만 개 이상의 독특한 표적 특징 또는 서열이 발견되는 경우, 현재의 기술을 능가하는 가장 큰 이점을 제공한다.

핵산 샘플은 고려하에 개체로부터 수득되는데, 예를 들어, 생검, 사후 조직 샘플, 및 개체의 많은 생성물 중 임의의 것으로부터의 추출물을 사용하여 유래될 수 있다. 흥미로운 많은 적용에서, 샘플은 게놈 물질을 포함할 것이다. 관심 있는 게놈은 임의의 개체의 것일 수 있고, 가장 흥미로운 것은 종종 영장류와 같은 고등 개체의 게놈이다. 게놈 DNA 는 사실상 임의의 조직 공급원으로부터 수득될 수 있다. 통상의 조직 샘플은 전혈 및 혈액 생성물 (순수한 적혈구 제외), 정액, 타액, 눈물, 소변, 배설물, 땀, 구강, 피부 및 모발을 포함한다. 핵산 샘플은 DNA, RNA, 또는 그의 화학적 유도체일 수 있고, 단일 또는 이중-가닥 형태로 제공될 수 있다. RNA 샘플은 또한 종종 증폭된다. 이 경우, 증폭은 전형적으로 역전사보다 선행된다. 모든 발현된 mRNA 의 증폭은 예를 들어, 공통적으로 소유된 WO 96/14839 및 WO 97/01603 에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

특정 구현예에서, 관심 있는 표적 특징은 SNP 를 함유하는 상대적으로 짧은 서열이다. 상기 지시된 바와 같이, 인간 게놈의 경우, 약 5 백만 내지 약 8 백만 개의 공지된 SNP 가 있다. 본 발명은 그러한 SNP 와 연관된 서열을 효과적으로 단리하고 서열화시키는 방법을 제공한다. 본 발명을 사용하여 단리될 수 있는 기타 표적 특징 (SNP 와는 별도임) 은 삽입, 소실, 역위, 전좌, 기타 돌연변이, 현미부수체, 반복 서열을 포함하는데 - 본질적으로 그의 핵산 서열에 의해 구별될 수 있는 임의의 특징을 포함한다. 이러한 특징은 예를 들어, 엑손 또는 기타 유전자 영역, 프로모터 또는 기타 조절 서열, 또는 구조 영역 (예를 들어, 중심체 또는 텔로미어) 에서 생길 수 있다. SNP 또는 기타 특징이 표적으로서 작 용하는지와는 무관하게, 본 발명은 특정 유전자 표적에 관한 약학적 연구 (예를 들어, 약물 반응 또는 약물 개발에 관련된 연구), 표현형 연구, 연관성 연구, 단일 염색체 또는 게놈을 포함하는 염색체 하위세트에 중점을 둔 연구, 예를 들어, mRNA 로부터 유래된 프로브를 사용하는 발현 양상에 중점을 둔 연구, 게놈의 암호화 영역 또는 조절 영역에 중점을 둔 연구, 및 특정 생화학적 또는 대사적 경로에 관련된 유전자 또는 기타 유전자 좌에만 중점을 둔 연구를 포함하여 광범위한 적용분야에서 사용된다. 즉, 표적 서열은 관심 있는 많은 상이한 경계 또는 특성을 바탕으로 샘플로부터 선별 및 단리될 수 있다. 다른 실시예에서, 표적 서열은, 어떻게 표적 서열이 추가로 분석되고 가공될 것인지를 바탕으로, 예를 들어, 표적 서열이 적용될 DNA 마이크로어레이의 디자인을 바탕으로 선별된다.

설명된 바와 같이, 원래의 핵산 샘플은 절편화되어서, 많은 상이한 핵산 절편을 생성시키고, 그 중 일부는 관심 표적 특징 또는 서열을 가지고 있고 나머지는 그렇지 않다. 물론, 처음의 샘플이 개별 절편화 조작을 필요로 하지 않는 적절한 조건 및 크기의 형태로 절편화되어 제공될 가능성이 있다. 모든 절편 (표적 절편 및 비-표적 절편과 같은 절편) 은 전형적으로 일반적인 크기 범위 및 말단 특징 (예를 들어, 블런트 대 (vs) 스티키) 과 같은 특정의 공통적인 특징을 가질 것이다. 절편 집단은 추가로 평균 크기 및 크기 분포, 뿐만 아니라 표적 서열의 발생률에 의해 특징화될 수 있다. 절편화 조건은 상기 특징을 결정한다.

도 2A 는 분석될 샘플의 일부 ; 예를 들어, 인간 공여자로부터 취한 게놈 DNA 의 이중-가닥 분절을 형성할 수 있는 핵산 203 의 연속 가닥을 나타낸 것이다. 가닥 203 은 다수의 표적 특징 207, 207', 207", . . . 을 가진 것으로 보인다. 이는 조사 중인 SNP 또는 기타 특징을 나타낼 수 있다. 방법 101 의 조작 103 에서, 샘플은 절편화된다. 이는 연속 가닥 203 이 다수의 가닥 209, 209', 209" 등으로 절편화되는 도 2B 에 나타나 있다. 가닥 209 와 같이, 상기 가닥 중 일부는 관심 표적 특징을 함유한다. 가닥 209' 및 209" 와 같은 기타 가닥은 표적 서열을 함유하지 않는다. 설명된 바와 같이, 핵산 절편이 본 발명에 따라 처리되는 경우, 많은 또는 대부분의 표적 함유 절편은 많은 또는 대부분의 비-표적 함유 절편으로부터 분리된다.

평균 또는 평균 절편 길이를 선별하는 경우 다양한 고려를 한다. 전형적인 경우, 평균 절편 크기는 길이가 약 20 개 내지 2000 개의 염기쌍 또는 그보다 더 긴데, 바람직하게는 길이가 약 50 개 내지 800 개 염기쌍이다. 특정 구현예에서, 평균 절편 크기는 길이가 약 400 내지 600 개 염기쌍이다. 다른 구현예에서, 평균 절편 크기는 길이가 약 100 개 내지 200 개 염기쌍이다. 당업자는 최적 평균 절편 길이가 특정 적용에 따라 다를 수 있음을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 절편은 독특한 서열을 함유할만큼 충분히 커야 한다. 표적 서열을 선별 또는 분석하는데 혼성화가 사용된다면, 절편은 특정 혼성화 조건에서 그의 상보성 서열과 잘 혼성화될 정도로 충분히 커야 한다. 절편은 충분히 작아서, 후속하는 조작 동안에 쉽게 전단되어서는 안될 것이고, 선별 프로브에의 혼성화를 방해하지 않아야 할 것이다. 추가로, 절편은 후속한 조작, 예를 들어, 장거리 PCR, 단거리 PCR 등에 의해 요구되는 정도의 적절한 크기여야 할 것이다.

적절한 절편 길이를 결정하는 경우 고려해야 할 또다른 요소는 고려되는 최종 서열 분석이다. 예를 들어, 만약 핵산 마이크로어레이가 적용된다면, 목적하는 절편 크기는 대략 25 내지 100 개의 염기쌍일 것이다. 만약 처음에 생성된 절편이 이보다 유의하게 더 크다면, 마이크로어레이를 사용한 유전자형 확정법 전에 두번째 절편화가 수행되어야 한다. 이상적이게는, 처음의 절편화는, 추가의 절편화가 필요하지 않는 분석에 적합한 크기의 절편을 생성할 것이다. 불행하게도, 크기가 25 내지 100 개의 염기쌍인 절편은 "PCR 억제" 를 나타낼 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는, 주어진 절편의 프라이머-상보성 말단이 단일 가닥에서 서로 결합되어, 헤어핀 구조를 형성할 때 초래된다. 상기 헤어핀 구조는 PCR 증폭에 참여할 수 없다. 절편이 유의하게 더 큰 경우에만 (예를 들어, 약 300 개 이상의 염기쌍보다 더 큰 경우에만), 단일 가닥의 말단 대 말단 결합의 가능성은 PCR 억제가 상당한 염려가 되지 않는 지점까지 감소된다.

서로 상보적이지 않은 2 가지 상이한 어댑터 서열을 사용함으로써, 상기 헤어핀 구조가 형성될 가능성을 최소화시킬 수 있다. 예를 들어, 어댑터 서열 A 및 B 를 사용하면 2 개의 A 어댑터를 가진 연결된 생성물 중 대략 1/4, 2 개의 B 어댑터를 가진 연결된 생성물 중 대략 1/4, 및 하나는 A 어댑터 그리고 다른 하나는 B 어댑터를 가진 연결된 생성물 중 대략 1/2 이 수득될 것이다. 따라서, 생성 연결된 생성물의 유의한 분획은 여전히 PCR 억제되기 쉬울 것이다.

어댑터 서열의 부착을 유용하게 하기 위해서, 절편 말단은 바람직하게는 일관된 구조, 예를 들어, 모두 블런트이거나 또는 모두 스티키인 구조를 가진다. 후자의 경우, 모든 스티키 말단은 바람직하게는 동일한 돌출부 서열을 가지고 있어서, 상응하는 어댑터 말단에 부착되기 위한 일관된 구조를 제공한다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 절편은 블런트-말단이다. 하기 상술되는 본 발명의 특정 구현예는 완전한 블런트-말단 어댑터를 사용한다.

샘플 핵산의 절편화는 다양한 공지 기술 중 임의의 기술을 통해 수행될 수 있다. 예는 기계적 절단, 화학적 분해, 효소적 절편화, 및 자가-분해를 포함한다. 자가-분해는 DNA 의 산성으로 인해 상대적으로 고온에서 발생한다. 절편화 기술은 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA 를 제공할 수 있다. 2003 년 8 월 8 일에 출원된 미국 특허 출원 제 10/638,113 호는 목적하는 수준의 절편화를 제공하도록 조절될 수 있는 다양한 방법, 장치 및 변수를 제공한다. 상기 출원은 모든 목적을 위해 참조로써 본원에 삽입되어 있다.

효소적 절편화는 DNAase 와 같은 뉴클레아제를 사용하여 수행된다. 한 예에서, DNaseI 은 망간 (II) 이온의 존재 하에 사용된다. 상기 효소를 사용한 절단은 상대적으로 블런트-말단 이중-가닥 절편을 제공한다. 생성 절편 내에는 1 개 또는 2 개의 염기 돌출부가 여전히 있을 수 있다. 그러한 경우, 완전한 블런트-말단 절편은, Pfu DNA 중합효소에 의해 나타낸 것과 같은 특정 엑소뉴클레아제를 처리함으로써 적절하게 스티키한 말단 절편으로부터 생성될 수 있다. Pfu 효소는 DNA 절편의 양쪽 말단 상에서 3' 신장으로 되돌아감으로써 작용한다. 또한, 상기 효소는 중합효소 활성에 의해 3' 오목한 말단에 채워질 수 있다. 블런트-말단 절편을 생성하는 또다른 방법은 기계적 전단 및 산 가수분해를 포함하 는데, 2 가지 모두 일부 블런트 말단 및 일부 돌출부를 생성한다. 따라서, 절편은 여전히 Pfu 중합효소와 함께 어느 정도 "블런팅" 될 것을 필요로 할 것이다. 추가로, 블런트 말단 (예를 들어, AluI, HaeIII, HinDII, SmaI) 을 남겨 놓는 특정 제한 효소가 사용될 수 있다. "블런트될" 수 있는 돌출부를 남겨 놓는 다른 제한 효소가 또한 사용될 수 있다. 물론, 스티기 말단 (무작위 돌출부 서열) 을 남겨 놓는 기술 중 임의의 기술이, 상기 방법이 혼화가능한 어댑터 (예를 들어, 돌출부가 어떤 것이든지 간에 상관 없이, 여전히 어댑터를 수득할 무작위 말단을 가진 것) 를 사용하는 한, 후속하는 블런팅 없이 사용될 수 있다.

어댑터 및 증폭

많은 상이한 프라이머를 제조하거나 또는 구매하는 비용을 피하면서 샘플 절편을 증폭시키기 위해, 본 발명은 임의로 하나 이상의 보편적인 어댑터 서열을 사용한다. 상기 어댑터는 프라이머 어닐링을 위한 공통 서열을 제공하도록 모든 샘플 절편의 양쪽 말단에 부착된다. 도 1 의 블록 105 를 참조한다. 또한, 어댑터 303 을 부착시킨 후의 도 2B 의 절편을 만화 형식으로 나타낸 도 3A 를 참조한다. 바람직하게는 단지 단일 어댑터 서열이 샘플로부터 생성되는 모든 많은 절편에 부착되기 위해 제공된다. 상기 접근법을 사용해, 단지 하나의 프라이머 서열이 모든 절편을 증폭시키는데 필요하다. 대안적인 구현예에서, 하나 이상의 어댑터 서열이 사용되나, 일반적으로 소수 이하의 것을 사용하는 것이 유익할 것이다. 본 섹션은 어댑터의 구조 및 어댑터를 절편에 부착시키는 방법 둘 다에 관해 기술한다.

어댑터는 그의 목적 : 즉, PCR 프라이머와 어닐링되는 부위를 제공하는 목적에 적절한 크기를 가져야 할 것이다. 따라서, 어댑터의 길이는 전형적으로 약 25 개 내지 50 개 염기쌍이다. 한 바람직한 구현예에서, 어댑터는 하나의 블런트 말단 및 하나의 스티키 말단을 가진 이중-가닥이다. 하기 설명되는 바와 같이, 이는, 어댑터가 일정한 방향으로 절편에 결합하게 하고, 또한 후속한 증폭 동안에 여분의 어댑터가 PCR 프라이머로서 작용하게 한다. 물론, 본 발명은 상기 구조에 제한되지 않으며, 일부 경우 어댑터가 단일-가닥 서열일 수 있다.

많은 경우, 어댑터의 농도는 절편 농도를 초과하여 있어야 할 것이다. 이는, 빠른 절편-어댑터 연결을 촉진시킬 수 있도록 충분한 어댑터가 있을 것을 보증한다. 또한, 어댑터의 농도는 절편-대-절편 연결의 경향을 감소시킨다. 한 구현예에서, 어댑터 농도는 절편 말단의 농도를 약 10-배 내지 100-배 초과한다 (보통 절편 농도의 2 배). 이 농도에서, 미반응된 여분의 어댑터 서열은 후속한 증폭에서 프라이머로서 작용할 수 있다. 변성 동안에, 이중-가닥 어댑터는 단일-가닥 서열로 분리될 것이고, 그 중 하나는 단일-가닥 절편 상에서 그의 상보성 서열에 어닐링되는 경우 프라이머로서 작용할 수 있다.

도 3B 에서 나타낸 구현예에서, 어댑터 303 은 스티키 말단 313 및 블런트 말단 311 을 포함한다. 블런트 말단은 항상 DNA 절편 209 에 부착하고, 스티키 말단은 절편으로부터 떨어져 있다. 때문에, 스티키 말단 313 은 블런트-말단 절편과 연결되지 않을 것이고, 어댑터는 절편과 어댑터 사이의 블런트 말단 대 블런트 말단 연결에 의해 지시된 단일 배향에서 부착되어야 한다. 보여진 예에 서, 스티키 말단 313 은 3' 오목한 부분을 갖는다. 연결은 통상의 DNA 연결효소를 사용해 수행될 수 있다.

어댑터 사이의 자가-연결을 감소시키거나 또는 제거할 수 있도록 주의가 취해질 수 있다. 하나의 어댑터의 블런트 말단이 또다른 어댑터의 스티키 말단에는 연결하지 못할 것이나, 2 개의 어댑터의 블런트 말단이 연결될 가능성은 있다. 또한, 2 개의 어댑터의 스티키 말단이 연결될 가능성도 있을 수 있으나 어댑터의 돌출부가 서로 상보적인 경우에만 그러하다. 이러한 가능성은 비-상보적인 돌출부를 갖는 어댑터를 디자인함으로써 제거될 수 있다. 어댑터의 블런트 말단에서 어댑터가 자가-연결되는 것을 방지하기 위해, 배열된 어댑터의 블런트 말단 내 인접 가닥이 단일 가닥 중 하나와 연결될 수 없게 하는 화학적 특징을 단일 가닥 중 하나가 함유하도록 블런트 말단이 디자인될 수 있다.

예를 들어, 어댑터의 블런트 말단 내 5' 가닥은 인산기가 없을 수 있다. 2 개의 상기 어댑터의 블런트 말단이 연결을 촉진하는 방식으로 배열된다면, 각각의 가닥은 2 개의 어댑터 사이에 인산염 다리가 없어서, 적절한 DNA 연결효소가 그것들을 연결할 수 없게 될 것이다. DNA 가닥의 5' 말단이 3' 히드록시기와 연결되기 위해서는 전형적으로 자유 인산기를 가지고 있다는 것을 주목한다. 상기 결합은 연속 가닥을 생성한다. 5' 인산기가 어댑터의 블런트 말단 끝 가닥 중 하나에 없는 경우, 연속 가닥을 형성할 수 없다. 그러한 경우, 단일 가닥의 각각의 5' 에서 3' 으로의 커플링이 방지될 것이기 때문에, 2 개의 어댑터를 연결하는 것이 불가능할 것이다. 이러한 상황은 어댑터 303a 및 303b 각각이 5' 가 닥에 인산기가 없는 블런트 말단을 가지고 있는 경우인 도 3C 에서 나타나 있다. 상기 어댑터가 보여진 바와 같이 말단-대-말단 연결되는 경우, 상부 가닥들 또는 하부 가닥들 사이에 어떤 연속 단일 가닥도 형성될 수 없기 때문에, 어댑터가 연결되는 것이 불가능하다. 인산기를 없애는 것은 자가-연결을 방지하는 하나의 접근법이나, 다양한 화학적 방지 기작이 사용될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 예를 들어, 유사한 구현예는 5' 인산기 대신에, 블런트 말단에 3'OH 가 없는 어댑터를 사용한다.

어댑터의 블런트 말단이 DNA 절편의 블런트 말단에 이어지는 경우, 단일 가닥 중 단지 1 개 가닥만이 연결되지 못한다. DNA 절편에 의해 부여되는 5' 말단이 있는 가닥은 인산기를 가질 것이고, 이는 어댑터 서열 상에서 단일 가닥 중 한 개의 3' 말단에 연결될 수 있다. 그러나, 생성 연결된 생성물은 각각의 어댑터와의 공유면에서 닉 315 를 가질 것이다. 도 3D 를 참조한다. 닉 뒤에 있는 어댑터 서열은, 도 3D 의 더 하위 부분에 나타나 있는 바와 같이 중합효소 반응에 의해 게놈 절편으로부터 밖으로 확산되어 가는 완전한 연속 단일 가닥으로 대체될 수 있다.

한 구현예에서, Pfu DNA 중합효소는 어댑터의 연결 동안에 반응 혼합물에 존재하면서 남아 있다. Pfu DNA 중합효소가 친열성 효소이기 때문에, 혼합물의 온도를 상승시킴으로써 (예를 들어 약 68℃ 까지) 활성화될 수 있다. dNTP 의 존재 시, Pfu 중합효소는 3' 오목한 부분에 채워질 것이고, 가닥 교체 활성을 가진다. 그와 같이, 상기 중합효소는 도 3D 에서 나타낸 바와 같이, 상기 중합효소 는 5' 인산염의 결함으로 인해 남겨진 닉에서 DNA 중합을 개시하고, 그리하여 절편의 3' 말단을 신장시키고, 5' 인산염이 결여된 어댑터의 가닥을 대체함으로써, 어댑터를 함유하는 절편 상에 작용한다. 이는 DNA 절편에 걸쳐져 있는 2 개의 어댑터 서열을 포함하는 닉-없는 이중-가닥 서열을 생성한다. 게놈 절편의 블런트 말단 사이의 자가-연결은 일반적으로, 어댑터의 농도가 핵산 절편의 농도와 비교해, 절편-대-절편 연결 가능성을 최소화시키는 정도로 크기 때문에, 피해진다.

핵산 절편이 어댑터를 사용해 개질된 후에, 상기 절편은 상기 기술된 바와 같이 증폭될 수 있다. 도 1 의 블록 107 을 참조한다. 어댑터 또는 어댑터들에 상보적인 프라이머 또는 프라이머 세트는 절편을 함유한 용액에 제공된다. 지시된 바와 같이, 여분의 어댑터 서열은 프라이머로서 작용할 수 있으며, 이 경우 추가의 프라이머가 첨가될 필요가 없다. 증폭에 필요한 다른 성분 (예를 들어, 특정 중합효소, dNTP, 완충제 등) 은 필요한 경우 제공될 수 있다. 상기 기술된 특정 구현예에서, PfU 중합효소는 용액 내에 남아 있고, 단독으로 또는 St. Louis, Missouri 의 AB Peptides, Inc. 에서 구입가능한 "Klentaq1" 과 같은 또다른 중합효소, 또는 당업계에 공지된 기타 중합효소와 함께 PCR 에 참여한다. 다음, PCR 증폭은 절편 모두를 증폭시키기 위해 수행된다. 특정 구현예에서, 증폭은 약 20 주기 동안 수행되나, 이는 결코 최소 또는 최대의 요건이 아니다. 생성 DNA 서열은 조작 103 에서 생성된 개별 DNA 절편에 걸쳐져 있는 어댑터 서열을 가질 것이다. 일부 구현예에서, 증폭 후의 절편 농도의 총 수율은 약 1μg 내지 1 mg 이다.

증폭의 PCR 방법은 PCR 기술 : Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992) ; PCR 프로토콜 : A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, 등, Academic Press, San Diego, CA, 1990) ; Mattila 등, Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991) ; Eckert 등, PCR Methods and Applications 1, 17 (1991) ; PCR (eds. McPherson 등, IRL Press, Oxford) ; 및 각각이 모든 목적을 위해 참조로써 삽입된 미국 특허 제 4,683,202 호에 기술되어 있다. 증폭 생성물은 증폭 반응에 사용된 효소 및 기질에 따라, RNA, DNA, 또는 그의 유도체일 수 있다. 본 발명의 방법으로 사용될 수 있는 특정 PCR 증폭 방법은 추가로 각각이 모든 목적을 위해 참조로써 삽입된 2002 년 1 월 9 일에 출원된 미국 특허 출원 제 10,042,406 호 ; 2004 년 5 월 25 일에 발행된 미국 특허 제 6,740,510 호 ; 및 2003 년 1 월 14 일에 출원된 미국 특허 출원 제 10/341,832 호에 기술되어 있다.

본 발명으로 사용될 수 있는 증폭된 샘플 절편을 생성하기 위한 (예를 들어, 선별 프로브의 단리를 위해) 다른 방법이 있다. 이들 기술 중 일부는 DOP-PCR, 태깅된 PCR 등과 같이 기타 핵산 절편의 태깅 방법을 포함하고, 모든 목적을 위해 참조로써 본원에 삽입된 [Kamberov 등, US2004/0209298 A1] 에 상세히 논의된다.

표적 절편의 선별 및 단리

샘플 절편의 증폭 후, 다수의 올리고뉴클레오티드 선별 프로브가 혼합물에 첨가된다. 바람직하게는, 약 1000 또는 2000 또는 5000 또는 10,000 또는 30,000 또는 50,000 또는 80,000 또는 100,000, 1,000,000, 또는 10,000,000 개 이상의 독특한 서열이 상기 혼합물 내에 선별 프로브로서 제공된다 (대략 85,000 개의 프로브가 한 샘플 내에 사용되었음). 설명된 바와 같이, 선별 프로브를 단일 반응 배지 내에서 증폭된 핵산 절편과 접촉시키고, 선별 프로브 및 증폭된 핵산 절편 (선별 프로브에 상보적임) 사이의 어닐링을 촉진시키는 조건에 노출시킨다.

각각의 샘플 프로브는 샘플 내에 존재할 것으로 여겨지는 (또는 적어도 잠재적으로 존재하는 것으로 여겨지는) 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 따라서, 1000 개의 프로브가 사용된다면, 1000 개의 표적 서열이 선별될 수 있다. 그와 같이, 표적 서열을 가진 샘플 절편만이 선별 프로브와 결합할 것이고, 결국 샘플 혼합물 내에서 단리될 것이다. 프로브 서열는 표적 서열을 독특하게 선별하는데 적절한 임의의 길이일 수 있다. 표적 SNP 의 경우, 적절한 길이의 범위는 약 20 개 내지 1000 개 염기쌍, 더욱 바람직하게는 약 20 개 내지 200 염기쌍 (예를 들어, 약 80 개의 염기쌍) 일 수 있다. 다른 크기 범위는 다른 적용에 적절할 수 있다.

선별 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, RNA, DNA, 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 하기 논의된 일부 구현예에서, 선별 프로브의 단일 가닥은 고체 기질에의 결합을 유용하게 하는 화학적 부분 또는 기타 특징을 포함한다. 기능적으로, "프로브" 는 1 개 이상의 유형의 화학적 결합을 통해, 보통 상보성 염기쌍을 통해, 보통 수소 결합 형성을 통해, 상보성 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 핵산이다. 핵산 프로브는 자연적인 (즉, A, G, C, 또는 T) 또 는 개질된 염기 (예를 들어, 7-디아자구아노신, 이노신) 를 포함할 수 있다. 또한, 핵산 프로브 내 염기는 혼성화를 방해하지 않는 한, 인산디에스테르 결합 이외의 연결에 의해 연결될 수 있다. 따라서, 핵산 프로브는 구성 염기가 포스포디에스테르 연결 이외의 펩티드 결합에 의해 연결되는 펩티드 핵산일 수 있다.

전형적으로, 어닐링 혼합물은 각각의 선별 프로브의 다수의 복사본을 함유할 것이다. 바람직하게는, 혼합물 내 각각의 선별 프로브의 농도는 100 μl 의 반응 혼합물 내에서 약 1 내지 100 ng 의 범위일 것이고, 절편의 농도는 100 μl 의 반응 혼합물 내에서 약 1 내지 10 μg 의 범위일 것이다.

광범위하게는, 본 발명은 임의의 수의 독특한 선별 프로브를 사용할 수 있다. 흥미로운 많은 적용분야는 약 1000 개 이상, 예를 들어 약 10⁴ 내지 10⁷ 개의 독특한 선별 프로브를 사용할 것이다. 본 발명에 사용될 것으로 고려되는 더욱 특정한 양은 약 2000 개 이상의 독특한 프로브이고, 더욱 더 구체적인 양은 약 5000 개 이상 또는 약 10,000 개 이상 또는 약 50,000 개 이상의 독특한 프로브이다. 모든 선별 프로브는 샘플 절편의 모두와 접촉되는 단일 용액 또는 혼합물 내에서 사용되어, 단일 반응 혼합물 내에서 수천 개의 독특한 표적 서열의 선별이 동시에 일어날 수 있다. 수십 또는 수백 또는 수천 개의 독특한 표적 서열을 사용하는 복합 샘플에 대해서는, 약 10,000 개 내지 100,000 개 또는 심지어 1,000,000 개의 독특한 프로브가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 필요하지 않더라도, 모든 선별 프로브가 단일 용액 또는 혼합물에 제공된다.

따라서, 본 발명의 한 구현예는 비- 표적 핵산 절편으로부터 표적 핵산 절편을 동시에 선별하는데 사용되는 선별 프로브 1 세트를 제공한다. 상기 세트는 약 1000 개 이상 (바람직하게는 약 10,000 개 이상) 의 독특한 선별 프로브를 공통 배지 내에 포함한다. 지시된 바와 같이, 각각의 선별 프로브는 독특한 SNP 와 연관된 서열과 같이 독특한 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 바람직하게는, 임의의 주어진 선별 프로브는 단일 SNP 만을 가진 서열에 상보적일 것이다. 모든 표적 서열은 게놈과 같은 단일 샘플 내에서 발견될 수 있다. 프로브 세트를 함유하도록 사용된 배지는 완충 수용액일 것이다. 특정 구현예에서, 상기 용액은 대략 1M Na++ 염, 바람직하게는 50% 포름아미드 및 10% 덱스트란 술페이트를 함유한다.

선별 프로브 세트가 표적 및 비-표적 서열 둘 다를 함유하는 더 큰 게놈 내의 표적을 나타내기 때문에, 공통 배지의 선별 프로브는 임의의 비-표적 서열이라면 거의 함유하지 않거나, 또는 적어도 표적 서열을 선별하는 프로브의 능력이 유의하게 손상되지 않는 양만을 함유한다. 최소한, 공통 배지는 비-표적 서열과 비교해 (원래의 게놈 또는 다른 샘플 내의 표적 및 비-표적 서열의 상대량과 비교 시), 표적 서열에 상보적인 선별 프로브를 유의하게 풍부한 양으로 함유할 것이다. 표적-특이적 선별 프로브 대 비-표적 서열의 상대량이, 상이한 표적-특이적 프로브 서열의 수 대 상이한 비-표적 절편 서열의 수, 또는 용액 내 표적-특이적 프로브 서열의 총 수 대 비-표적 절편의 총 수를 기준으로 측정되는지는 사실이다.

추가로, 1 세트의 선별 프로브는 샘플의 특징화에 상응하는 것으로 규명된 각각의 그리고 모든 표적 서열에 대한 프로브를 함유할 필요가 없다. 예를 들어, 50,000 개의 독특한 SNP 대립 유전자는 샘플의 특징화에 상응하는 것으로 규정될 수 있으나, 선별 프로브 세트는 상기 대립 유전자 중 단지 40,000 개에 대한 프로브를 함유할 수 있다. 적어도 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적 서열의 분획을 단리하기 위해서, 샘플 혼합물에 40,000 개의 구성원이 있는 프로브 세트를 적용하는 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 추가로, 프로브 세트는 특정 샘플 내에 존재하는 것보다 더 많은 표적 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 특정 조직으로부터의 mRNA 로부터 유도될 수 있어서, 상기 조직에서 발현되지 않는 임의의 표적 서열은 샘플 내에 존재하지 않을 것이다.

선별 프로브는 올리고뉴클레오티드 합성 기술 및 개체로부터의 단리를 포함하여 임의의 적절한 방법에 의해 생성될 수 있다. 후자의 경우, PCR 또는 기타 증폭 기술이 프로브를 상대적으로 고농도로 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 예에서, 프로브는 특정 SNP 를 유지하는 것으로 밝혀진 인간 게놈의 서열 상에서PCR (또는 복합 PCR) 을 사용하여 수득된다. 그러한 상황에서, 개별 선별 프로브는 상기 프로브에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 의해 제조될 수 있다. 그러한 게놈 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 연관성 연구, 연결 분석 등을 통해 규명될 수 있다.

많은 서비스 공급자는 통상의 프로브를 접촉 기준 상에서 사용가능하도록 만든다. 본 발명에 사용되는 선별 프로브는 상기 공급자로부터 구입될 수 있으며, 그 중 일부는 하기이다 : Palo Alto 의 Agilent Technologies, CA, Madison, WI 의 NimbleGen Systems, Inc., Houston, TX 의 Seq Wright DNA Technology Services, 및 Carlsbad, CA 의 Invitrogen Corporation. 또다른 접근법에서, 선별 프로브는 표적 특징을 가진 것으로 알려진 게놈 DNA (예를 들어, 게놈 라이브러리의 단일 염색체 또는 클론(들)) 를 절편화시킴으로써 생성될 수 있다. 더욱 추가로, 선별 프로브는 cDNA 로의 전환에 의해 mRNA 로부터 생성될 수 있어서, 발현된 표적 서열을 선별할 수 있다. 즉, 발현된 mRNA 는 표적 서열을 가진다.

지시된 바와 같이, 선별 프로브는 또한, 어닐링 방법이 완료된 후에, 고체 기질에 연결될 수 있는 부분을 포함할 수 있다. 그러한 부분의 예는, DNA 가 비오틴, 아비딘, 형광 염료, 디곡시게닌, 또는 기타 뉴클레오티드 개질을 포함하도록 하는 개질을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 부분은 비오틴 또는 스트렙타비딘이고, 기질 표면은 각각 스트렙타비딘 또는 비오틴을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 선별 프로브는 고체 기질에 미리-연결되어서 제공될 것이다. 그러한 구현예에서, 고체 기질은 혼성화 촉진 조건 하에 증폭된 절편의 용액과 접촉된다. 개별 연결 단계가 필요하지 않다.

본 발명의 측면은 상기 규명된 선별 프로브 1 세트를, 표적 서열의 풍부화 및/또는 분석을 유용하게 하는 하나 이상의 물품과 함께 함유하는 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 키트는 또한, 선별 프로브 상의 부분과 결합하여 선별 프로브를 기질 상에 고정시킬 수 있는 표면 특성을 가진 고체 기질 (예를 들어, 비드, 마이크로어레이, 칼럼 등) 을 포함한다. 키트는 또한 핵산 절편의 증폭을 위한 프라이머 및 중합효소를 포함할 수 있다. 더욱 추가로, 키트는 표적 절편 에 함유된 표적 서열을 규명하기 위한 핵산 어레이 또는 기타 툴을 포함할 수 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 선별 프로브 및 샘플 절편의 완전한 세트는 단일 반응 혼합물 내에 제공된다. 혼성 어닐링 생성물의 형성을 촉진하기 위해, 상기 2 가지 성분의 상대 농도는 바람직하게는 선별 프로브보다 절편이 약 100-배 내지 약 10,000-배 더 많고, 더욱 바람직하게는 절편이 약 500-배 내지 약 5000-배 더 많고 ; 예를 들어, 선별 프로브보다 절편이 약 1000-배 더 많다. 많은 적용에서는 더 큰 "완전한" 세트의 선별 프로브의 하위세트가 사용될 것임을 주목한다. 예를 들어, 연관성 연구는 특정 SNP 를 흥미로운 조건에 연결시킬 수 있다. "완전한" 프로브 세트는 SNP 대립 유전자에 대한 독특한 선별 프로브를 수백 개 또는 수천 개 또는 심지어 수백만 개 포함할 수 있는 한편, 흥미로운 조건에 사용되는 프로브 세트는 단지 상기 선별 프로브를 수천 개만 포함할 수 있다.

표적 절편을 정확하게 선별하기 위해, 본 방법은 절편 및 선별 프로브 둘 다를 단일 가닥으로서 제공해야 한다. 그 중 어떤 것이 이중-가닥 형태로 존재한다면, 본 방법은 우선 혼합물 내에서 이중-가닥 서열을 변성시킴으로써 시작된다. 다음, 혼합물 내 조건을 점차 변경시켜서 어닐링이 이루어지게 한다. 일부 이행에서, 온도는 어닐링을 촉진하도록 단계식으로 바뀐다. 전형적인 이행에서, 어닐링은 약 10 내지 50 시간 (특정 이행 시 36 시간) 동안 발생한다.

한 구현예에서, 이중-가닥 프로브 및 이중-가닥 절편은 50% 포름아미드 용액을 사용하여 약 94℃ 의 온도에서 약 2 분 동안 변성된다. 포름아미드 농도가 1% 증가하는 것이 이중-가닥 DNA 의 용융 온도를 약 0.6℃ 저하시키고, 따라서 온도 및 포름아미드 농도의 조합이 필요한대로 조정될 수 있음을 주목한다. 변성 후, 서열은 본원에서 기술된 바와 같은 단계적으로 서서히 냉각시키는 단계에 의해 어닐링된다. 처음에, 혼합물을 94℃ 에서 약 42℃ 로 약 2 시간에 걸쳐 냉각시킨다. 다음, 온도를 42℃ 에서 약 12 시간 동안 유지시킨다. 그런 후, 용액을 42℃ 에서 약 37 ℃ 로 약 5 시간에 걸쳐 서서히 냉각시킨다. 이 온도 범위 (약 37℃ 내지 42℃) 에서, 대부분의 어닐링이 일어난다. 37℃ 에 도달한 후, 혼합물을 이 온도에서 약 12 시간 동안 유지시킨다. 물론, 본 발명은 상기 변성 조건에 제한되지 않는다. 예를 들어, 유의하게 더 짧은 시간에 걸쳐서, 가능하게는 12 시간만큼 짧은 시간에 걸쳐서 어닐링시킬 수 있다.

일반적으로, 어닐링은 특정 뉴클레오티드 서열이 존재하는 경우 엄격한 조건 하에서, 1 개의 분자를 단지 1 개의 특정 뉴클레오티드 서열에 결합, 이중화, 또는 혼성화시키는 것을 말한다. 엄격한 조건은, 프로브가 다른 어떤 서열도 아닌 그의 표적 하위서열에 혼성화하는 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 환경에 따라 다양하다. 일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 및 pH 에서 특정 서열에 대한 열 융용 온도 (Tm) 보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm 은 표적 서열에 상보적인 프로브 중 50% 가 평형상태에서 표적 서열에 어닐링되는 온도이다 (한정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에서) (표적 서열이 과량으로 존재할 수 있기 때문에, Tm 에서, 프로브 중 50% 는 이론상으로 평형상태에 있음). 전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3 에서 약 0.01 내지 1.0 M 이상의 Na 이온 농도 (또는 기타 염) 의 염 농도를 포함하고, 온도는 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50 개의 뉴클레오티드) 에 대해 약 30℃ 이상이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 5X SSPE (750 mM NaCl, 50 mM 인산나트륨, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25 ~ 30℃ 의 온도 조건은 대립 유전자-특이적 프로브 혼성화에 적합하다.

선별 방법의 개시 및 종점은 도 4A 및 4B 에 도식적으로 나타나 있다. 보여진 바와 같이, 상기 중 각각은 단일 용기 (403) 에서 제공된 반응 혼합물 (405) 중 분자 규모 부피 (407) 을 나타낸다. 도 4A 의 부피 (407) 은 수많은 이중-가닥 종을 가진다. 선별 프로브는 비오틴에 대한 부착된 "B" 종에 의해 규명될 수 있다. 이는 프로브 (411) 및 (415) 를 포함한다. 또한, 각각의 선별 프로브는 "X" 에 의해 지시된 표적 서열을 포함할 것이다. 샘플 절편은 말단에 있는 직사각형 어댑터 서열에 의해 규명될 수 있다. 절편 중 일부는 표적 서열 X (예를 들어, 절편 (413)) 를 가지는 한편, 다른 절편은 그렇지 않다 (예를 들어, 절편 (409)).

도 4A 의 이상적인 예에서, 선별 프로브는 표적 서열 X1 내지 X6 을 가지고 있다. 샘플 절편은 단지 표적 서열 X1, X2, X4, 및 X6 을 가진다. 서열 X3 및 X5 는 샘플 내에 존재하지 않는다. 어닐링 후, 도 4B 의 부피 (407') 에서 나타낸 바와 같이, 일부 프로브는 표적 절편과 혼성화되고, 나머지는 그렇지 않다. 보여진 바와 같이, 절편 (409) 와 같은 샘플 절편은 표적 서열을 갖지 않고 그대로 유지되어 남아 있다. 표적 X3 및 X5 를 가진 선별 프로브, 뿐만 아니라 표적 X6 을 가진 프로브 (411) 에 대해서도 마찬가지이다. 이러한 프로브는 샘플 절편 (413) 과 어닐링하지 않았고, 또한 표적 서열 X6 을 가지고 있다. 물론, 상보적인 선별 프로브 및 표적 절편 중 일부 분획은 서로 어닐링되지 않을 것이다. 나타내어진 예에서, 표적 X1, X2, 및 X4 가 있는 절편은 교차-어닐링된다. 물론, 정상적으로는 표적을 가진 다수의 절편 복사본, 뿐만 아니라 다수의 상보성 선별 프로브 복사본이 있을 것이다. 따라서, 전형적으로 모든 상보성 가닥이 서로 찾아서 어닐링하지는 않을 것이며, 한편 적절한 조건 하에서 유의한 분획이 어닐링되어 프로브-샘플 이중-가닥 생성물을 생성할 것이다.

샘플 절편 및 선별 프로브를 어닐링시킨 후에, 그것들을 선별 프로브에 대해 친화성을 가진 고체 기질에 상기 용액을 노출시킴으로써 고정시킨다. 지시된 바와 같이, 선별 프로브는 기질 표면 상에서 상보성 부분과 연결되는 부분 (예를 들어, 비오틴 및 스트렙타비딘) 을 포함할 수 있다. 고체 기질은 비드, 디스크, 칼럼, 마이크로어레이, 다공성 유리 표면, 막, 플라스틱을 포함하여 많은 상이한 형태를 취할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 기질은 직경이 대략 1 마이크론인 비드를 포함하고, 각각은 1 마이크론 비드 당 대략 10⁵ ~ 10⁷ 개의 프로브를 갖고 있다. Dynal (Oslo, Norway) 로부터 구매가능한 스트렙타비딘으로 코팅된 자기 비드는비오틴-표지 DNA 를 고정시키는데 적합하다. 비드 상에 고정된 DNA 를 사용하여 핵산의 풍부화를 수행하는 과정은 모든 목적을 위해 본원에서 참조로써 삽입된 [Birren 등, at ch. 3] 에 기술되어 있다.

도 5 에 나타나 있는 구현예에서, 어닐링된 혼합물을 비드의 표면에 걸쳐서 스트렙타비딘 부분이 분포된 비드와 접촉시킨다. 보여진 바와 같이, 다수의 비드 (503) 를 어닐링된 혼합물 (405') 에 첨가한다. 처음에, 개별 비드는 고정된 선별 프로브를 갖지 않는다. 그러나, 개별 비드는 도 5 에서 보여진 개별 비드 (505) 상에서 "S" 에 의해 지시된 바와 같이 비드의 표면에 걸쳐서 스트렙타비딘 부분이 분포되어 있다. 어느 정도의 시간 동안 용액 내에 남아 있은 후에, 비드는 용액 내 선별 프로브 중 일부를 포착한다. 일부 포착된 프로브는 도 5 에서 보여진 바와 같이 표적 절편과 어닐링된다 ; 비드 (505') 를 참조한다.

특정 구현예에서, 용액 및 비드 간의 접촉은 약 20℃ 내지 37℃ 의 온도에서 약 30 분 내지 1 시간 동안 발생한다. 이는 비오틴 및 스트렙타비딘 부분이 서로 연결되고, 선별 프로브 및 상보성 DNA 절편의 이중-가닥 서열을 효과적으로 고정시키게 하기에 충분한 시간이다..

상기 지시된 바와 같이, 관심 특징을 포함한 표적 서열 (예를 들어, 하나 이상의 SNP) 을 선별하기 위해 선별 프로브의 서열을 선택해야 할 것이다. 종종 관심 있는 특징이 프로브 서열에서 중심이 될 것이나, 이것이 필수적인 것은 아니다. 일부 경우, 관심 있는 특징은 프로브 서열의 중심-밖 또는 심지어 외부일 것이다. 관심 있는 특징이 프로브 서열의 외부에 위치한다면, 프로브 서열은, 관심 있는 특징에 충분히 가까워서 프로브가 상기 특징을 가진 절편을 집어 낼 표적 서열의 영역에 상보적이어야 할 것이다. 이러한 이행은 도 6 에 나타나 있고, (a) 선별 프로브 (605) 에서 중심에 있는 SNP 또는 기타 관심 있는 특징 (603), (b) 선별 프로브 (607) 내이나 중심과는 떨어져 있는 SNP (603), 및 (c) 선별 프로브 (609) 의 범위 밖이나 상기 프로브의 한쪽 말단 가까이에 위치해 있는 SNP (603) 을 보여준다.

하나 이상의 표적 절편 하위세트는 상기 기술된 과정에서 고체 기질에 부착되게 된다. 상기 절편을 풍부하게 하기 위해, 비부착된 절편을 씻어 내거나 또는 그렇지 않다면 기질로부터 분리해야 할 것이다. 표적 절편이 고정된 프로브 서열에 상보적인지를 알아내기 위해서는, 다양한 분리 기술이 당업자에게 명백해져야 할 것이다. 예를 들어, 기질 상에 있으나 DNA-DNA 상호작용을 통해 결합되지 않은 DNA 절편을 제거하는 제 1 단계, 및 더욱 엄격한 조건 하에 느슨하게 혼성화된 샘플 핵산 가닥 (영역 내에서 하나 이상의 선별 프로브에 대한 미스매치를 함유할 수 있거나, 또는 그렇지 않다면 하나 이상의 선별 프로브에 상보적임) 을 제거하는 제 2 단계의, 2-단계 세척 과정을 사용할 수 있다.

예로서, 제 1 단계는 실온에서 6x SSPE 완충액을 사용해 수행되고, 제 2 단계는 상대적으로 더 높은 온도에서 더 낮은 염 농도를 사용하는 가장 엄격한 조건 (더욱 심각한 조건을 나타냄) 하에서 수행된다. 예를 들어, 이는 약 실온 내지 약 37℃ 의 온도에서 0.2x SSPE 를 사용해 적용될 수 있다. 또, 상기 제 2 세척은 선별 프로브와 부분적으로 상보적일 수 있으면서 상대적으로 느슨하게 결합된 DNA 절편을 제거할 것이다. 도 7 은, 완전한 상보성 혼성화된 절편 (711) (전형적으로 제 2 단계 세척에 의해 제거되지 않을 절편) 및 부분적으로 혼성화된 절편 (713) (제 2 단계 세척에 의해 제거될 경향이 더욱 더 많은 절편) 이 어떻게 되 어 있는지를 보여준다. 두 절편 모두 선별 프로브 (705) 에 혼성화되어 있는 것으로 보여진다.

비-어닐링된 샘플 절편 및 느슨하게 어닐링된 샘플 절편을 상기 기술된 2 단계 세척에 의해 제거한 후에는, 단지 표적 DNA 절편만이 고체 기질 상에 남아 있어야 할 것이다. 즉, 상기 기질은 이 시점에서 선별 프로브에 강하게 상보적인 핵산 절편만을 (이상적으로는) 함유할 것이며, 이러한 절편은 아마도 표적 DNA 절편이다. 따라서, 이 시점에서의 방법은 표적 절편을 샘플의 잔여물로부터 효과적으로 단리한다. 이 점에서, 표적은 하기 기술된 다양한 방법에서 추가로 처리 또는 분석될 수 있다. 실시예가 DNA 마이크로어레이를 사용한 분석을 구체적으로 설명하더라도, 본 발명이 상기 방법에 한정되는 것은 아님을 알아야 할 것이다.

도 1, 블록 113 에서 지시된 바와 같이, 표적 DNA 절편을, 예를 들어 변성에 의해, 고정된 선별 프로브로부터 제거한다. 특정 구현예에서, 이는 실온에서 0.15 M 수산화나트륨으로 처리해 수행된다. 그런 후, 상기 용액을 0.15 M 염산을 사용해 중성화시킨다. 변성 후, 표적 절편이 기질로부터 제거된 경우, 기질 자체 (예를 들어, 비드) 를 용액으로부터 제거할 수 있다. 생성 용액은 단리되고 풍부하게 된 표적 핵산 절편을 함유한다.

단리된 표적 절편의 분석

일부 구현예에서, 단리된 표적 절편을 바로 분석할 수 있다. 그러나, 특정 적용을 위해서는, 상기 절편을 우선 추가로 증폭 및/또는 절편화시켜야 한다. 상기 지시된 바와 같이, PCR 억제의 가능성은 초기의 절편화 과정을 제한하여, 대략 300 ~ 400 개 이상의 염기쌍을 가진 절편이 생성되게 할 수 있다. 그러한 절편은 너무 커서, DNA 마이크로어레이를 사용하여 효과적으로 실험될 수 없다. 따라서, 표적 가닥을 추가로 절편화하는 것이 필요할 수 있다.

풍부해진 표적 절편을 증폭시켜야만 하는 것을 가정하여 (도 1 의 조작 117 참조), 초기 증폭 (조작 107) 에서 사용되었던 것과 동일한 서열의 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행한다. 단리된 표적 절편에는 여전히, PCR 프라이머에 대한 어닐링 부위로서 작용할 수 있는 어댑터 서열이 부착되어 있을 것이다. 많은 경우, 단지 하나의 단일 프라이머 서열이 제 2 증폭에 필요할 것인데, 그 이유는 단지 하나의 단일 어댑터 서열이 그 과정에서 이미 그 전에 사용되었기 때문이다 (도 1 의 조작 105 참조). 그러나, 전형적으로 본원에서는 단일-가닥 프라이머가 초기 증폭에 사용된 이중-가닥 어댑터 서열보다 더 잘 사용될 것이다. 증폭의 정도는 포착되고 고정된 절편의 양뿐만 아니라, 서열 분석 기술의 요건에 따라 다를 것이다. 전형적인 경우, 대략 20 내지 40 회의 PCR 주기가 적용된다.

증폭 후, 단리된 절편은 너무 커서, DNA 마이크로어레이 상에서 고정된 올리고뉴클레오티드 프로브와 효과적으로 혼성화될 수 없다. 지시된 바와 같이, 표적 가닥을 추가로 절편화하는 것이 바람직할 것이다. 제 2 절편화가 적용된다면, 조건은 수행되는 분석 기술에 적절한 크기를 갖는 절편을 생성하도록 선택된다. DNA 마이크로어레이에 의한 유전자형 확정법을 위해서는, 최종 절편 크기가 바람직하게는 길이가 약 25 내지 150 개 염기쌍, 또는 일부 구현예에서는 약 40 내지 100 개 염기쌍이다. 단리된 표적 서열을 절편화하고, 상기 크기를 가진 최종 절편을 생성하기 위해, 절편은 적절한 시간 동안 DNase 와 접촉될 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 절편화는 상기 기술된 바와 같이 전단, 제한 효소 등을 사용하여 수행된다.

도 8 은 증폭 및 절편화의 제 2 순환을 통한 선택된 표적 절편의 과정을 보여준다. 보여진 바와 같이, 추가의 복사본 613' 를 생성하기 위해, 어댑터 (303) 을 갖는 표적 절편 (613) 을 증폭시킨다. 다음, 증폭된 표적 절편을 절편화하여, 더 작은 크기의 표적 절편 623, 623' 등을 생성한다. 예시된 바와 같이, 상기 절편의 일부는 관심 표적 서열을 함유하지 않을 것이다.

물론, 본 발명의 범주 내에서는 단일 절편화 반응만을 사용한다. 그러한 구현예에서, 초기 절편화는 단리된 표적 절편의 분석, 예를 들어, 통상의 DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자형 확정법에 적절한 크기의 절편을 생성한다. 대안적으로, 상기 방법은 상대적으로 큰 서열 (예를 들어, 약 300 개 이상의 염기쌍) 을 서열화하기에 적합한 서열화 툴을 사용한다. 예를 들어, 직접 서열화 기술이 적용될 수 있다. 다른 구현예는 Illumina, Inc. (San Diego, CA) 및 454 Corporation (New Haven, CT) 의 서열화 플랫폼을 적용한다. 일반적으로, 본 발명은 본 발명을 사용하여 단리된 표적 절편의 분석을 위한 임의의 특정 방법 또는 생성물에 제한되지 않는다.

DNA 마이크로어레이를 단리된 표적 절편을 서열화하는데 적용한다면, 절편을 우선 표지한 다음, 고정된 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 유용하게 하는 조건 하에서 마이크로어레이와 접촉시킨다. 임의의 적합한 표지 및 표지화 기술이 사용될 수 있다. 이를 위한 많은 광범위하게 사용되는 표지는 형광 신호를 제공한다. 특정 구현예에서, 절편을 표지하는데 말단 트랜스퍼라제 효소가 사용된다. 표지가 절편에 부착되고 절편이 마이크로어레이 상에서 올리고뉴클레오티드와 혼성화된 후에, 상기 어레이를 유지시키고/거나, 또는 추가로 어레이에 결합된 절편을 검출하기 위해 세척한다. 다음, 어레이 상에서의 결합 양상을 판독하고 해석하여, 다양한 표적 서열이 샘플 내에 있는지 또는 없는지 알아낸다. SNP 표적의 경우, 판독기는 예를 들어, (1) 어레이 상에서의 개별 프로브의 공지된 서열 및 위치 ; (2) 절편이 어레이 상에서 하나 이상의 프로브에 상보적인가를 알아내고 ; (3) 따라서 절편의 서열을 알아내고 ; 마지막으로 (4) 따라서, 절편의 유전형을 알아냄으로써, 표적 서열 내에 존재하는 대립 유전자를 규명한다. 표지, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이, 및 연관된 판독기, 소프트웨어 등은 Affymetrix, Inc., (Santa Clara, CA) 에서 시판되는 것과 같은 다양하고 통상적으로 이용가능한 DNA 마이크로어레이 생성물과 함께 제공된다. 지시된 바와 같이, 다른 방법 ; 예를 들어, 각각의 마커를 암호화하는 영역의 직접 서열화, 표적 서열을 포함하는 라이브러리의 제조, 추가의 실험 또는 방법에서 표적 서열의 프로브로서의 용도, 또는 세포주에서 수행되는 기능적 어세이에서의 용도가 또한 적합하다.

도 9 는 상기 기술된 바와 같은 특정 구현예에서 단리된 표적 절편을 서열화하는데 사용되는 조작 순서를 보여준다. 조작 921 에서, 자유 단리된 표적 절 편은 유체 배지 내에서 제공된다. 이러한 절편은, 우선 고체 기질을 세척하여 비-특이적인 절편을 제거한 다음, 특이적으로 결합된 표적 절편을 유리시킴으로써 수득되었다. 83,000 개의 SNP 는 표적 절편 내에서 나타내어진다. 조작 923 에서, 자유 표적 절편을 단일 프라이머를 사용한 단일 PCR 을 사용하여 증폭시켜서, 83,000 개의 SNP 모두를 증폭시킨다. 그런 후, 조작 925 에서, 절편을 추가로 절편화시키고 표지한다. 마지막으로, 조작 927 에서, 표지된 절편을 DNA 마이크로어레이를 사용해 검사한다.

DNA 샘플의 제조

제조업자에 의해 제공된 프로토콜을 따라 시판의 키트를 사용해, 인간 혈액 림프구로부터 게놈 DNA 를 단리하였다. 대략 100 ng 의 게놈 DNA 를 1 mM MnCl₂ 의 존재 하에 DNase I 을 사용해 절편화시켰다. 절편화된 DNA 크기는 아가로스 젤 전기영동을 통해 분리한 후 에티디움 브로미드로 염색시켰을 때, 약 200 bp 내지 1 kb 의 범위이었다. 절편화된 DNA 를 200 mM dNTP 의 존재 하에 65℃ 에서 Pfu DNA 중합효소로 처리함으로써 블런트-말단이 있게 제조하였다. 다음, T4 DNA 연결효소를 사용해 블런트-말단 절편을 4℃ 에서 16 시간 동안 이중-가닥 어댑터에 연결시켰다. 다음, 연결된 DNA 를 20 내지 24-주기 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였고, 연결 반응에서 남은 비연결된 어댑터는 PCR 프라이머로서 작용하였다. 이러한 반응은, DNA 절편 말단을 블런트 말단으로 만드는데 이미 사용된 Pfu DNA 중합효소에 의해, 또는 상기 반응에 첨가된 다른 DNA 중합효소 효소에 의해 촉매화될 수 있다. 전형적으로, PCR 생성물의 크기 범위는 약 300 bp 내지 1.2 kb 이고, 생성물의 대부분은 약 500 ~ 600 bp 이다.

어닐링 반응

PCR 생성물 중 대략 5 μg 을 COT-1 DNA 10 μg 및 Herring Sperm DNA 100 μg 과 혼합하고, 상기 혼합물을 진공 원심분리에 의해 동결건조시켜서 건조 상태가 되게 하였다. 다음, 건조된 DNA 를 50% 포름아미드, 및/또는 10% 덱스트란 술페이트 또는 10% 폴리에틸렌 글리콜과 같은 혼성화 가속화제를 함유할 수 있는 6X SSC 또는 6X SSPE 와 같은 적합한 혼성화 완충액 내에서 재현탁시켰다. 비오틴-표지된 DNA 선별 프로브 대략 50 ng 을 반응물에 첨가하고, 95℃ 에서 2 분 동안 변성시킨 다음, 반응물이 2 시간에 걸쳐 37℃ 로 서서히 냉각되게 하였다. 어닐링 반응이 37℃ 에서 20 내지 36 시간 동안 진행되게 하였다.

어닐링된 DNA 절편의 선별

1 마이크론 상자성 비드가 코팅된 스트렙타비딘 100 μg 을 반응물에 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 비오틴화된 DNA 가 상기 비드에 결합되도록 하였다. 결합 후에, 상기 비드를 실온에서 6X SSPE 완충액 1 ml 로 연속해서 2 회 세척하고, 37℃ 에서 30 분 동안 0.2X SSPE 1 ml 로 2 회 세척하였다. 다음, 비드 상에서 포착된 DNA 를 0.15 M NaOH 내에서 인큐베이션시킴으로써 유리시키고, 변성된 DNA 를 각각의 부피의 0.15 M HCl 을 첨가하여 중성화시켰다. 다음, 중성화된 DNA 를, DNA 절편의 말단에 연결된 어댑터에 상응하는 DNA 서열을 갖는 단일-가닥 PCR 프라이머를 사용한 PCR 반응에 사용하였다. 다음, 증폭된 DNA 를 표준 과정에 따른 마이크로어레이 혼성화 제조에서 정제하고, 절편화시키고, 말단 트랜스퍼라제 효소를 사용해 말단-표지하였다.

본 실시예 및 바람직한 구현예에 대한 상기 설명에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명은 인간 게놈과 같은 크기가 큰 샘플을 처리하는데 있어서의 복잡성을 상당히 감소시킨다. 포인트 또는 참조로서, 인간 게놈은 대략 30 억 개의 염기쌍을 함유한다. 본 발명에 따라 80,000 개 선별 프로브 한 세트를 적용하는 것은 대략 20 개의 요소에 의해 분석되는 DNA 의 양을 쉽게 감소시킬 수 있는데 ; 예를 들어, 500 bp 샘플 절편의 경우 약 8 천만 개 염기쌍으로 감소시킬 수 있다. 명백하게는, 더 적은 수의 선별 프로브를 적용하고/거나, 또는 샘플 절편이 더 작은 경우, 복잡성이 더 크게 감소될 것이다.

기타 구현예

본 발명은 상기 기술된 것보다 이행 및 이용가능성의 범위가 더 광범위하다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 DNA 마이크로어레이를 사용한 유전자형 확정법에 관해 기술되었더라도, 본 발명의 방법은 그런 식으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명은 전장 cDNA, mRNA 및 유전자와 같은 핵산의 선별 및 단리, 뿐만 아니라 유전자 발현 분석 및 교차-종 비교 혼성화와 같은 복잡성 감소를 필요로 하는 다른 방법에도 쉽게 확장될 수 있다. 당업자는 기타 변형, 개질 및 대안책을 인지할 것이다.

상기 설명이 예시적인 것이고 제한적인 것은 아님을 알 것이다. 당업자 가 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 본 출원에서 개시된 본 발명에 대해 다양한 구현예 및 개질을 할 수 있음을 쉽게 알아야 할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 설명을 참조로 해서 결정되어야 할 것이 아니라, 그 대신에 첨부된 청구항이 주장하는 것에 상응하는 전체 범주를 따라 첨부된 청구항을 참조로 해서 결정되어야 할 것이다. 본원에서 언급된 모든 공개물은 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 시약, 방법 및 개념을 설명하고 개시하기 위해 언급된다. 본원 중 어느 것도, 상기 참조가 본원에서 기술된 본 발명과 관련된 선행 기술이라는 것을 허가가 된 것으로 여겨져서는 안된다. 개시물을 통해, 다양한 특허, 특허 출원 및 공개물이 참조된다. 달리 지시되지 않는 한, 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로써 삽입된다.

Claims

하기를 포함하는, 핵산 샘플로부터 표적 핵산 서열을 단리시키는 방법 :

(a) 샘플로부터 핵산 절편을 생성함 ;

(b) 핵산 절편을 증폭시킴 ;

(c) 선별 프로브 및 증폭된 핵산 절편 (선별 프로브에 상보적임) 사이의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에, 증폭된 핵산 절편을 단일 반응 배지 내에서 약 2000 개 이상의 독특한 선별 프로브에 노출시킴 (여기서, 선별 프로브는 표적 핵산 서열에 상보적인 서열을 가짐) ;

(d) 선별 프로브에 강하게 결합되지 않은 증폭된 핵산 절편을 제거함 ; 및

(e) 어닐링된 증폭된 핵산 절편을 선별 프로브로부터 유리시켜 (여기서, 상기 어닐링된 증폭된 핵산 절편은 상기 표적 핵산 서열임), 상기 표적 핵산 서열을 단리시킴.
제 1 항에 있어서, (e) 에서 유리된 표적 핵산 서열을 바탕으로 핵산 샘플을 특징화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 2 항에 있어서, 표적 핵산 서열을 핵산 어레이에 적용함으로써 특징화를 수행하는 방법.
제 3 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법 :

(e) 에서 유리된 표적 핵산 서열을 증폭시킴 ; 및

상기 표적 핵산 서열을 표지한 다음, 그 서열들을 상기 핵산 어레이와 접촉시킴.
제 4 항에 있어서, 표지화 전에 표적 핵산 절편을 추가로 절편화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 샘플의 절편화가, 평균 크기가 약 25 내지 약 2,000 개 염기쌍인 핵산 절편을 생성하는 방법.
제 6 항에 있어서, 핵산 절편의 평균 크기가 약 500 개 염기쌍인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 에서 핵산 절편을 생성하는 것이, 추가의 절편화 없이도 핵산 어레이 상에서 유전자형 확정법을 할 수 있게 하는 평균 크기의 핵산 절편을 생성하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 절편을 증폭시키는 것이 (a) 에서 생성된 실질적으로 모든 핵산 절편에 대해 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 절편을 증폭시키기 전에, 어댑터를 핵산 절편의 말단에 부착하는 것을 추가로 포함하는 방법으로서, 여기서, 어댑터는 증폭 조작에 사용되는 프라이머에 상보적인 서열을 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 어댑터 각각이 동일한 서열을 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 어댑터가 ssDNA 꼬리가 있는 dsDNA 를 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서, 핵산 절편의 말단에 부착되지 않은 과량의 어댑터가 핵산 절편의 증폭에서 프라이머로서 작용하는 방법.
제 10 항에 있어서, 어댑터를 부착하는 것이 핵산 절편의 블런트 말단에 어댑터를 연결하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 프로브가 고체 기질에의 연결을 유용하게 하는 부분을 포함하는 방법.
제 15 항에 있어서, 선별 프로브를 고체 기질에 연결하는 것을 추가로 포함 하는 방법으로서, 여기서, 하나 이상의 선별 프로브 하위세트가 조작 (c) 및 (d) 사이에서, 증폭된 핵산 절편에 어닐링되는 방법.
제 16 항에 있어서, 고체 기질이 다수의 비드를 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서, 선별 프로브에 강하게 결합하지 않은 증폭된 핵산 절편을 제거하는 것이, 고체 기질을 세척하여 비결합 핵산 절편을 제거하는 것을 포함하는 방법.
제 18 항에 있어서, 고체 기질의 세척이, 부분적으로 어닐링된 증폭된 핵산 절편을 결합된 선별 프로브로부터 제거하는 조건 하에서, 고체 기질을 용액에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 핵산 절편을 단일 반응 배지 내에서 독특한 선별 프로브에 노출시키는 것이 약 50,000 개 이상의 독특한 선별 프로브 (각각은 단일 반응 배지 내에서 독특한 표적 핵산 서열에 상보적임) 를 제공하는 것을 포함하는 방법.
제 20 항에 있어서, 단일 반응 배지에 적용되는 독특한 선별 프로브의 수가 약 50,000 내지 약 10⁷ 개인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 핵산 절편을 단일 반응 배지 내의 독특한 선별 프로브에 노출시키는 것이, 증폭된 핵산 절편을 상기 단일 반응 배지 내의 약 5,000 개 이상의 독특한 선별 프로브에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
제 22 항에 있어서, 증폭된 핵산 절편을 단일 반응 배지 내의 독특한 선별 프로브에 노출시키는 것이, 증폭된 핵산 절편을 상기 단일 반응 배지 내의 약 10,000 개 이상의 독특한 선별 프로브에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
하기를 포함하는, 표적 및 비-표적 핵산 절편의 혼합물로부터 표적 핵산 절편을 단리하는 방법 :

(a) 혼합물 내 표적 및 비-표적 핵산 절편의 말단에 어댑터 서열을 적용함 (여기서, 어댑터 서열은 길이가 약 15 내지 40 개 염기쌍인 서열을 포함하고, 핵산 절편 말단의 수에 초과하여 존재함) ;

(b) 표적 및 비-표적 절편을 증폭시키는 중합효소 연쇄 반응을 수행함 (여기서, 과량의 어댑터를 변성시킴으로써 제공되는 것 외에는 어떤 프라이머 서열도 표적 및 비-표적 절편을 증폭시키는데 필요하지 않음) ;

(c) 선별 프로브와 표적 핵산 절편의 어닐링을 촉진시키는 조건 하에, 증폭된 표적 및 비-표적 절편을 복수의 선별 프로브와 동시에 접촉시킴 (여기서, 선별 프로브는 표적 핵산 절편의 서열에 상보적인 서열을 포함함) ; 및

(d) 상기 선별 프로브에 결합된 어닐링된 표적 핵산 절편으로부터 비-어닐링된 비-표적 핵산 절편 및 부분-어닐링된 비-표적 핵산 절편을 분리하여, 표적 핵산 절편을 단리함.
제 24 항에 있어서, 어댑터 서열이 이중-가닥 핵산 서열인 방법.
제 25 항에 있어서, 어댑터가 핵산 절편의 말단에 부착되는 블런트 말단을 가진 방법.
제 26 항에 있어서, 어댑터가 그 자체에 상보적이지 않은 돌출부를 가진 스티키 말단을 가지고, 그리하여 어댑터의 스티키 말단이 서로 어닐링되지 않는 방법.
제 26 항에 있어서, 어댑터의 한 가닥에는 어댑터의 블런트 말단에서의 연결에 필요한 부분이 없고, 그리하여 어댑터의 블런트 말단이 서로 연결되지 않는 방법.
제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 어댑터가 핵산 절편 말단의 수보다 약 10 ~ 100 배 초과하여 존재하는 방법.
비-표적 핵산 절편으로부터 표적 핵산 절편을 동시에 선별하는데 이용되기 위한 선별 프로브 세트로서, 여기서 세트는 :

공통 배지 내에 약 10,000 개 이상의 독특한 선별 프로브를 포함하고, 각각의 선별 프로브는 독특한 SNP (모두 단일 게놈 내에서 발견됨) 를 포함하는 독특한 표적 서열에 상보적인 서열을 가지며,

여기서, 각각의 독특한 선별 프로브의 길이는 약 20 내지 1000 개 염기쌍인 세트.
제 30 항에 있어서, 세트의 개별 선별 프로브가 이중-가닥 핵산 서열인 선별 프로브 세트.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 세트가 약 10⁴ 내지 10⁸ 개의 독특한 선별 프로브를 포함하는 선별 프로브 세트.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 세트가 약 10⁴ 내지 10⁵ 개의 독특한 선별 프로브를 포함하는 선별 프로브 세트.
제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 독특한 선별 프로브가 선별 프로브 서열과는 별도로, 고체 기질에의 결합을 유용하게 하는 부분을 추가로 포함하는 선별 프로브 세트.
제 34 항에 있어서, 부분이 비오틴 또는 스트렙타비딘인 선별 프로브 세트.
제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 세트의 개별 선별 프로브가 개별 선별 프로브에 대해 특이적인 PCR 반응에 의해 제조되는 선별 프로브 세트.
하기를 포함하는, 비-표적 핵산 절편으로부터 표적 핵산 절편을 단리시키는 키트 :

제 34 항에 따른 선별 프로브 세트 ; 및

선별 프로브 상의 부분과 결합하기 위한 표면 특징을 포함하고, 그리하여 선별 프로브를 고체 기질 상에 고정시킬 수 있는 고체 기질.
제 37 항에 있어서, 핵산 절편을 증폭시키기 위한 프라이머 및 중합효소를 추가로 포함하는 키트.
제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 표적 핵산 절편에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 어레이를 추가로 포함하는 키트.
제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 기질이 비드를 포함하는 키트.