CN109540638B - 一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，包含对盛装于离心管内石蜡包埋组织切片的处理，操作过程包含以下步骤：加脱蜡液后立即高速离心；在中高温下孵育；从中高温孵育取出后立即高速离心；向离心管内液体中注入蛋白酶K溶液，在中温下孵育；再次高速离心，吸取组织分解液。本发明不用二甲苯，无需煮沸水浴，无需耗时去除蜡质，组织分解能力强，对于多量组织仍然可彻底将其分解并释放核酸，实验操作简单，基本无组织损耗，对核酸破坏少，适用范围广，极少量至大量的石蜡组织切片均可处理。

Description

一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，特别适用于石蜡固定组织切片中核酸物质的提取和纯化。

背景技术

蜡质包埋组织是保存动物组织细胞核酸物质的常用方法，特别在医院保存人体组织时，一般采用石蜡包埋。当需要对保存组织进行核酸分子检测时，通常切取石蜡组织切片进行核酸的提取和纯化。从石蜡组织中提取核酸物质的关键步骤是将组织从石蜡中分离，将其彻底分解并释放细胞内核酸物质进入溶液中，方可成功提取和纯化核酸。目前石蜡切片组织的分解最常用方法是用二甲苯溶解包埋组织中的石蜡，再用无水乙醇清洗残余的二甲苯。二甲苯和无水乙醇的方法溶解石蜡最彻底，但二甲苯易挥发、气味重、毒性大、对组织破坏力强，并不是一种完美的方法。有人用DMSO作为石蜡溶解剂，DMSO气味小、不易挥发、毒性很低，但DMSO溶解石蜡的能力极为有限，仅能处理1-3张5微米的小薄片，对于较大量的石蜡切片效果很差。2000年上海医学检验杂志上发表的一篇《一种石蜡包埋组织DNA提取方法》论文第一次提出用TES溶液（10mmol Tris-HCL， 1mmol EDTA， 0.5% SDS）脱蜡的方法，查阅Pubmed未发现国外更早的论文描述。该文章中描述的方法是在装有3片5微米厚的石蜡切片组织的1.5ml无菌管中，注入1毫升 TES溶液。65℃水浴10分钟，待冷却后离心，用滤纸吸除上清液和浮蜡，如此吸除3次完成脱蜡。屠其华、张晓萍、袁亚婷、周卫宁等在2006-2013年间发表的科技论文分别描述并试验了TES溶液脱蜡方法。2011年天根生化科技（北京）有限公司提交并于2013年获授权的专利中，描述了在石蜡切片组织中加入特制裂解液，并在高温下煮沸30分钟，离心取清液的方法。该方法不使用二甲苯，也不需要蛋白酶K，专利权描述针对2-4片10微米厚的石蜡包埋组织切片。特制裂解液配方为500微升0.1M NaOH，50微升20%SDS，50微升0.001M二巯苏糖醇。成都晟博源生物工程有限公司于2017年提交的专利中采用NaOH和SDS为溶剂的去蜡液，在100℃水浴30分钟裂解组织，其方法与天根生物工程公司专利所述基本相同。日本Takara的MiniBEST石蜡组织提取试剂盒采用先加入500微升DP液，80℃加热一分钟后再加入180微升GL液，然后离心使蜡质分层的方法。

我们对以上所述的各类方法均进行了试验，发现上述各类方法仍存在较大改进空间。首先，TES溶液法是一种用脱蜡液去除蜡质留下组织的方法。通过该方法处理后离心，蜡质漂浮在液体上层，形成固体层，而脱蜡组织悬浮在液体中部，组织呈展开态，无聚缩，也无法下沉。实际操作时，吸取液体很容易误将组织带出，组织损耗比较大，对多量（如大于5张以上10微米厚）石蜡切片处理时效果更差。蜡质浮于顶层固化，并与离心管内壁四周紧粘，部分蜡质碎屑紧贴固化蜡质下表面，要将蜡质清除是个十分耗时且需要技巧的过程。

天根生化专利方法采用的是一种原位溶解的方法，但其不采用蛋白酶K，对石蜡组织处理量较为有限。当石蜡切片量较多时，即使煮沸半小时仍然无法完全分解组织。而半小时煮沸处理不仅使得实验过程变得复杂，而且有一定危险性。特别在当前实验室消防安全严格要求下，煮沸处理有诸多不便。同时，NaOH碱液的破坏作用和高温煮沸使石蜡组织中本已脆弱易断的核酸更加碎裂，影响了核酸的质量。

针对上述不足，申请人提出了一种清洁分解蜡质包埋组织切片更加简单、方便和有效的方法，该方法不用二甲苯，无需煮沸水浴，无需耗时去除蜡质，组织分解能力强，对于多量组织仍然可彻底将其分解并释放核酸，实验操作简单，基本无组织损耗，对核酸破坏少，适用范围广，极少量至大量的石蜡组织切片均可处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，包含对盛装于离心管内石蜡包埋组织切片的处理，操作过程包含以下五个步骤：

步骤一，加脱蜡液后立即高速离心；

步骤二，在中高温下孵育；

步骤三，从中高温孵育取出后立即高速离心；

步骤四，向离心管内液体中注入蛋白酶K溶液，在中温下孵育；

步骤五，再次高速离心，吸取组织分解液。

作为本发明进一步的方案：在步骤一中，所述的脱蜡液至少由十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和乙二胺四乙酸（EDTA）三种化合物成份组成，且脱蜡液中十二烷基硫酸钠（SDS）的质量百分比浓度为0.2%-10%。

作为本发明进一步的方案：在步骤一中，采用三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液来调整整体溶液pH值于7.0-8.5之间。

作为本发明进一步的方案：在步骤二中，所述的孵育温度为60℃-90℃，常用为80℃，所述的孵育时间为15分钟-60分钟。

作为本发明进一步的方案：在步骤三中，所述的高速离心是在离心管从中高温孵育中取出后，在离心管内液体尚未冷却至室温的条件下立即离心。

作为本发明进一步的方案：在步骤四中，所述的注入蛋白酶K操作过程为：在离心管中穿透凝固蜡质层，向下方液体中注入并吹打混匀。

作为本发明进一步的方案：在步骤四中，所述的孵育温度为37℃-60℃，常用为54℃，所述的孵育时间为15分钟-180分钟。

作为本发明进一步的方案：在步骤五中，所述的高速离心是在离心管从中温孵育中取出后，在离心管内液体尚未完全冷却至室温的条件下离心。

作为本发明进一步的方案：在步骤一、三和五中，所述的高速离心均为产生的离心力不低于8000克，离心时间为30秒-300秒。

所述的清洁分解蜡质固定动物组织的方法在核酸提取中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所述的清洁分解蜡质固定动物组织的方法，不使用二甲苯，不使用NaOH，不需要100℃高温，实验操作更加安全。脱蜡液中除SDS、Tris和EDTA外，不必添加其他任何溶质，不采用Tris-HCL，不需要NaOH调节pH值。所有处理在一个离心管内完成，属于原位脱蜡，无需耗时清除蜡质，没有组织损失的风险。只需5步，操作简单，不需要额外的技巧。分解组织前用中高温松解组织，并使用蛋白酶K，可使组织彻底分解为清亮的液体，核酸提取的质和量均有保障。

附图说明

图1为本发明清洁分解蜡质固定动物组织的示意图。

图中：01-离心管，02-石蜡包埋组织切片，03-石蜡组织，04-脱蜡液，05-蜡质层，06-组织，07-清亮的脱蜡液，08-组织分解液。

具体实施方式

下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是公开一种清洁分解蜡质固定（包埋）动物组织的方法，用以解决当前已有技术在分解蜡质包埋组织时，存在的使用毒性二甲苯、需沸水高温水浴、去蜡操作耗时、组织损耗大、加剧核酸破坏、无法彻底分解较大量蜡质包埋组织等缺点。而采用本发明所述方法则无需煮沸，无需去蜡，操作简单，几乎无组织损耗，组织分解彻底，可处理极少量至大量蜡质包埋组织。

本发明所采用的技术方案是将SDS原位脱蜡，中高温松解组织，蜡质离心分层，蛋白酶K分解组织四个要素组合在一起，形成一个步骤明确的清洁分解蜡质包埋组织的方法。

SDS原位脱蜡是指利用含十二烷基硫酸钠（SDS）溶液具有溶脱蜡质的能力，在一个离心管管内通过中高温孵育将组织和蜡质分离脱蜡的过程。所使用的脱蜡液必须成份为SDS， Tris和EDTA。SDS质量百分比含量在0.2-10%之间。Tris作用在于利用其碱性特征直接将溶液pH值调整至7.0-8.5之间，而不需要NaOH。脱蜡液pH调整目的在于为蛋白酶K分解组织建立最佳pH值反应环境。Tris所需含量由所需调整的pH值决定。EDTA作用在于螯合金属离子，保护核酸。

中高温松解组织是指在60-90℃中高温孵育下使脱蜡组织进一步松解以利于后续蛋白酶K分解的过程。

蜡质离心分层是指当石蜡切片组织的蜡质在SDS和中高温作用下溶出后，在其尚未完全冷却凝固时，通过高速离心，使蜡质因质量密度低而浮于顶层，同时随着温度自然下降固化形成蜡质层。而脱蜡组织此时密度与液体接近，既不全部下沉，也不全部上浮，悬浮于蜡质下层清液中的分层过程。

蛋白酶K具有分解组织释放核酸物质，并同时抑制核酸酶的作用，是一种较理想的组织分解酶。

本发明所述技术方案所处理的对象是装于离心管内的蜡质包埋动物组织切片，其处理方法包含5个步骤：

第一步为加液离心。即向装有石蜡包埋组织切片02的微量离心管01内注入含SDS的脱蜡液04，常温下高速离心。离心的目的为使尚未溶脱蜡质的石蜡包埋组织切片02在离心力压迫下聚集于离心管01管底，使其完全浸没在脱蜡液04中，以利下一步中高温孵育下脱蜡。因此，所需离心力不小于8000克，时间不小于30秒。脱蜡液04加液量根据所需处理蜡质切片多少决定，并与离心管01体积相适应。对于常用1.5毫升离心管01，最低需100微升，常用为250微升。

第二步为中高温孵育。将离心后的管子置于最低60℃，最高90℃，常用为80℃的金属浴或水浴中，使蜡质溶解。中高温孵育的目的其一是为物理熔解蜡质，因一般石蜡熔点为52-58℃，因此温度至少不低于60℃；目的其二为松解组织但需减少对组织的破坏，因此温度需稍高，以80℃为佳，但不超过90℃。孵育时间可短至5分钟，长至1小时，以利于后续蛋白酶K分解组织。孵育温度的高低设置和时间长短均与所需处理的石蜡切片组织量相关，如切片量少，则只需较低温度较短时间，如切片量大则以较高温度较长时间为佳。

第三步为离心分层。即从中高温孵育中取出管子后立即在不低于8000克离心力高速离心30秒-5分钟，使管中蜡质与组织分层。离心过程中，管中蜡质与脱蜡组织实现完全分离，并随着温度自然下降逐渐凝固。离心后可见蜡质固化于液体上表面，依离心管01四周呈圆盘状，可见蜡质表面光洁，而已脱蜡的组织06悬浮于下方液体中。

第四步为加蛋白酶K溶液分解组织。在蜡质层较薄情况下，可直接用移液头穿透蜡质层，将蛋白酶K注入下方液体中并吹打混匀。当蜡质层05较厚时，为避免蜡质堵塞移液头小孔，可先用一个空移液尖头穿透蜡质层05，再用另一个移液头吸取蛋白酶K溶液，注入含悬浮组织的下方清液中，并吹打混匀。然后，于蛋白酶K最适功能温度（常用为50-55℃）下孵育。所需蛋白酶K量及孵育时间均根据组织量多少决定。加入蛋白酶K量少至200微克，多至5000微克。孵育时间短至15分钟，长至3小时。孵育期间可间或以震荡混匀再离心并继续孵育，在组织量较大情况下，可加快组织分解。

第五步为再次离心分层。以不低于8000克离心力高速离心30秒-5分钟。离心后管中上层仍为蜡质层05，但下层已变为含核酸物质的完全清亮液体。如组织分解尚不彻底，则可见少许残余组织于液体中下部，是因蛋白酶K加入量不足所致，予添加蛋白酶K后继续孵育，最终可获完全清亮液体。该清亮液体即为含核酸物质的组织分解液08。用移液器将下层清液吸出，直接下一步提取。或者将下层清液吸出后注入新的离心管，再次离心，进一步吸取清液。所获组织分解液08可用硅质滤柱、磁珠、酚氯仿等方法纯化核酸，可获得高质量的石蜡切片组织释放核酸。

实施例1

以下为中等量石蜡组织切片采用本发明所述方法的实施方式案例：

如附图1说明中1.5ml塑料离心管01内装有厚度为6微米，面积约4cm×3cm的10个卷曲呈柱状的肺癌石蜡包埋组织切片02。向离心管01内注入脱蜡液04 250微升。脱蜡液04含质量百分比为2%的SDS，摩尔浓度为80mM的Tris，摩尔浓度为2mM的EDTA，溶液pH值为8.0。注入脱蜡液04后将离心管在11000克离心力下离心1分钟。离心后，管内石蜡包埋组织切片02在离心力压缩下集聚于离心管下部形成聚缩的石蜡组织03，注入的脱蜡液04则位于聚缩的石蜡组织03上方并将其浸没。将离心管01置于80℃金属浴孵育30分钟，完成孵育后取出，立即在11000克离心力下高速离心2分钟。此时可见离心管01中石蜡包埋组织中蜡质已溶出，呈圆盘状凝固的蜡质层05位于顶层，下方为完全脱蜡的组织06悬浮于清亮的脱蜡液07中。取一个空的200微升量程的移液头，用其尖头穿破凝固的蜡质层05。再用移液头吸取20微升浓度为20微克每毫升的蛋白酶K溶液，通过蜡质层05已穿破的小孔伸入下方清亮的脱蜡液07中，并用移液器吹打混匀蛋白酶K于清亮的脱蜡液07中。将离心管01置于54℃金属浴，孵育30分钟。取出立即离心，观察清亮的脱蜡液07中是否还有尚未分解的组织06残余。如有组织06残余，再添加蛋白酶K10微升，继续在54℃金属浴孵育，直至残余组织06完全消失分解。将离心管01在11000克离心力下高速离心2分钟，可见离心管01内凝固的蜡质层05仍位于上层，下方则为完全清亮的组织分解液08。吸取清亮的组织分解液08可直接用于下一步核酸纯化。或可用移液器吸取组织分解液08，注入新的离心管。再次以11000克离心力高速离心2分钟，再吸取组织分解液08，可获得更加纯净的组织分解液08。

实施例2

以下为少量石蜡组织切片采用本发明所述方法的实施方式案例：

如附图1说明中离心管01内装有1片厚度为4微米，大小为1平方厘米的结肠癌石蜡包埋组织切片2。向离心管01内注入脱蜡液04 100微升。脱蜡液04含SDS质量百分比为0.2%，EDTA摩尔浓度为1mM，Tris摩尔浓度为50mM，溶液pH值为7.0。在8000克离心力下高速离心30秒，可见石蜡组织03被压缩于离心管01底部，并浸没于脱蜡液04中。将离心管01置入60℃水浴孵育5分钟，取出后立即在8000克离心力下高速离心30秒，可见离心管01内蜡质已完全从石蜡包埋组织溶出并在液体上面凝固成薄层。已脱蜡组织06则悬浮于下方液体中。用移液器穿透蜡质层05向下方液体中注入蛋白酶K溶液10微升。将离心管01置于37℃孵育15分钟。完成孵育后取出并立即在8000克离心力下离心30秒，可见蜡质层05仍凝固于顶层，下方液体中组织06已完全分解，变成清亮的组织分解液08。吸取该组织分解液08可直接用于下一步核酸纯化。

实施例3

以下为大量石蜡组织切片采用本发明所述方法的实施方式案例：

如附图1说明中15ml离心管01中装有厚度为10微米，大小为6cm×6cm，数量为50张的乳腺癌石蜡包埋组织切片02。向离心管01内注入脱蜡液04 5毫升。脱蜡液04含SDS质量百分比为10%，EDTA摩尔浓度为10mM，Tris摩尔浓度为100mM，溶液pH值为8.5。将离心管01在15000克离心力下高速离心5分钟，可见石蜡包埋组织切片02被离心力压迫聚缩在离心管01底部，并浸没在脱蜡液04中。将离心管01置于90℃水浴1小时，取出立即在15000克离心力下高速离心10分钟。可见石蜡包埋组织中的蜡质已完全溶出并浮于液体上部且凝固。蜡质层05下方为清亮的脱蜡液07，液体中悬浮有已脱蜡的组织06。用一个空的移液头尖头穿透顶部蜡质层05，并用新的移液头吸取20微克每毫升的蛋白酶K溶液200微升，通过蜡质层05已穿透的小孔注入下方液体中。将离心管01在60℃水浴中孵育3小时。离心后观察是否有组织06残余，如仍有组织06残余，则添加蛋白酶K量，直至组织06完全分解。完成孵育后，在15000克离心力下离心10分钟，可见蜡质层05仍凝固于上层，下层则变成组织分解液08。吸取清亮的组织分解液08可直接用于核酸纯化。

本发明所述的清洁分解蜡质固定动物组织的方法，不使用二甲苯，不使用NaOH，不需要100℃高温，实验操作更加安全。脱蜡液04中除SDS、Tris和EDTA外，不必添加其他任何溶质，不采用Tris-HCL，不需要NaOH调节pH值。所有处理在一个离心管01内完成，属于原位脱蜡，无需耗时清除蜡质，没有组织损失的风险。只需5步，操作简单，不需要额外的技巧。分解组织前用中高温松解组织，并使用蛋白酶K，可使组织彻底分解为清亮的液体，核酸提取的质和量均有保障。

以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (2)

1.一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，包含对盛装于离心管（01）内石蜡包埋组织切片（02）的处理，其特征在于，操作过程包含以下五个步骤：

步骤一，加脱蜡液（04）后立即高速离心；

步骤二，在中高温下孵育；

步骤三，从中高温孵育取出后立即高速离心；

步骤四，向离心管（01）内液体中注入蛋白酶K溶液，在中温下孵育；

步骤五，再次高速离心，吸取组织分解液（08）；

其中，在步骤一中，所述的脱蜡液（04）至少由十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸三种化合物成份组成，且脱蜡液（04）中十二烷基硫酸钠的质量百分比浓度为0.2%-10%；

在步骤一中，采用三羟甲基氨基甲烷溶液来调整整体溶液pH值于7.0-8.5之间；

在步骤二中，所述的孵育温度为60℃-90℃，孵育时间为15分钟-60分钟；

在步骤三中，所述的高速离心是在离心管（01）从中高温孵育中取出后，在离心管（01）内液体尚未冷却至室温的条件下立即离心；

在步骤四中，所述的注入蛋白酶K操作过程为：在离心管（01）中穿透凝固蜡质层（05），向下方液体中注入并吹打混匀；

在步骤四中，所述的孵育温度为37℃-60℃，孵育时间为15分钟-180分钟；

在步骤五中，所述的高速离心是在离心管（01）从中温孵育中取出后，在离心管（01）内液体尚未完全冷却至室温的条件下离心；

在步骤一、三和五中，所述的高速离心均为产生的离心力不低于8000克，离心时间为30秒-300秒。

2.如权利要求1所述的清洁分解蜡质固定动物组织的方法在核酸提取中的用途。

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