JP2013530697A - ワックス包埋サンプルからの核酸抽出 - Google Patents

Abstract

本発明は、ワックス包埋サンプルから核酸を抽出するための方法、架橋ワックス包埋サンプルから核酸を抽出、単離および／または精製するための方法においてワックス包埋サンプルからワックスを除去するための特定の溶媒の使用、ならびにワックス包埋サンプルから核酸を抽出、単離および／または精製するためのキットに関する。本発明において、脱パラフィンされたワックス包埋サンプルの溶解が、ワックス可溶化剤および可溶化されたワックスを依然として含む二相系または多相系において、溶解の結果を損なうことなく達成され得るということが見出された。したがって、面倒な洗浄工程も、夾雑物を捕捉するためのレジンも、必要ない。

Description

本発明は、ワックス包埋サンプルから核酸を抽出するための方法、架橋ワックス包埋サンプルから核酸を抽出、単離、および／または精製するための方法においてワックス包埋サンプルからワックスを除去するための特定の溶媒の使用、ならびにワックス包埋サンプルから核酸を抽出、単離、および／または精製するためのキットに関する。

生存している生物から生物学的材料を取り出す際（例えば、組織、そのフラグメントまたは単離された細胞）、例えば、栄養培地中でのインキュベーションなどの通例の措置が行われない場合、それらは間もなく死亡する。死んだ細胞は、さらに、急速に、初期の自己溶解性−発酵性の腐敗、次いで、細菌による腐敗を受け、それにより、元の組織内細胞構造が破壊される。ゆえに、サンプルの組織学的検査を想定している場合、その腐敗を抑制するために、取り出された生物学的サンプルを固定する必要がある。固定は、生物学的構造を生きているような様式で実質的に保存することを目的としており、その結果、「真の評価」が可能となる。固定のさらなる利点は、検体を資料として長時間保管することができるという点である。さらに、多くの形態学的調査は、固定された材料に基づいてのみ可能である。

固定は、通常、沈殿化合物または架橋化合物（例えば、酸、アルコール、ケトンまたはアルデヒド、特に、ホルムアルデヒド（通常、４〜１０重量％または３５重量％水性溶液の形態で使用される（この両方が「ホルマリン」と呼ばれる））を用いて行われ、通常、その後、固定された材料をワックス、通常、パラフィンに包埋する（いわゆる「ホルマリン固定パラフィン包埋」（ＦＦＰＥ）材料）工程が行われる。包埋媒体の主な目的は、顕微鏡的および／または組織化学的な用途のために自然状態で検体を切片にしてマウントするのを可能にすることである。しかしながら、多くの用途では、例えば、サンプルの組織学的染色の前に、包埋媒体をサンプルから除去することが必要であるか、または除去することが少なくとも都合がよい。

慣習的に、脱パラフィンは、トルエン、および特に、キシレンなどの芳香族溶媒の使用を含む。代表的には、新鮮なスライス、または顕微鏡用スライドにマウントされた検体を、パラフィンが可溶化されるまで、キシレン浴に浸漬する。その後の工程では、脱パラフィンされた検体を、アルコール濃度を下げていった一連のアルコール溶液によって洗浄してキシレンを除去し、その後、水を用いて最後の洗浄して、水性の反応物／試薬溶液（例えば、溶解緩衝液または染色溶液等）がサンプルに接近できるようにする。しかしながら、キシレンは、引火性、揮発性および毒性の有機溶媒である。このため、過去数年間、キシレンを、より毒性が低い脱パラフィン剤で置き換える努力が相当行われている。組織化学的用途においてキシレンに置き換わるものの例としては、テルペン油（例えば、ｄ−リモネン）、イソパラフィン炭化水素または水性の食器洗い用せっけん溶液が挙げられる（非特許文献１）。

これらの脱パラフィン剤のいくつかは、より毒性が低いかまたは無毒性でさえありつつ、ワックスの除去に関してキシレンと同等に機能する。しかしながら、多くの場合、ほとんどのタイプの免疫組織化学的染色との適合性を達成するために、水洗浄の前に溶媒／脱パラフィン剤を除去するために、一連のアルコール洗浄が依然として必要である。生体分子に関する技術の進歩に伴い、ワックス包埋サンプルの光学顕微鏡的検査だけでなく、ワックス包埋サンプル、特にＦＦＰＥサンプルから収集されたＤＮＡとＲＮＡの両方の核酸の分析も、ますます重要になってきている。そのようなサンプルから収集された核酸は、その後、高感度の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等）を用いて分析され得る。しかしながら、免疫組織化学的染色の代わりに、またはそれに加えて、ワックス包埋サンプルからの核酸の抽出が想定される場合、その後の核酸の濃縮、精製、単離および／もしくは分析の任意の工程に脱パラフィン剤が干渉しないこと、または脱パラフィン剤が脱パラフィン後のサンプルから完全に除去され得ることが非常に重要である。

ＦＦＰＥサンプルから核酸を取り出す場合、上記サンプルは、通常、キシレンを用いて脱蝋され、同様にアルコール濃度を下げながらアルコール溶液で数回洗浄された後、適切な消化緩衝液中で溶解される。核酸は、その後の工程において、通常、有機抽出法（例えば、フェノール／クロロホルム抽出）を用いてこれらの緩衝液から単離され、必要に応じて、例えば、エタノールまたはイソプロパノールを用いた沈殿によってさらに濃縮される。

例えば、グアニジニウムチオシアネートを含む、カオトロピック消化緩衝液が使用される場合、あるいは、消化／溶解工程の後にサンプルにカオトロープが加えられる場合、核酸に選択的に結合する固相（例えば、シリカ膜またはガラスビーズ等）を用いることによっても核酸は単離され得、ゆえに、有毒な溶媒を用いた上述の液体／液体抽出手順が回避される。一方で、カオトロピック物質も同様に、毒性であると考えられている。

有毒な物質の量、ならびに洗浄工程の回数を最小限にするための、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸を単離するための商業的に入手可能なキットがいくつか開発されており、脱パラフィン剤として例えばテルペンを備えるキットも入手可能であるが、それらのキットのほとんどは、脱パラフィン剤としてキシレンを使用している（非特許文献２）。ＴｒｉｍＧｅｎ（Ｓｐａｒｋｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）製の商業的に入手可能なワックス非含有パラフィンサンプル調製キットでは、別のアプローチが使用されている。専売溶液を用いてワックスを除去した後、特別なレジンおよび酵素混合物をサンプルに加える。その酵素混合物がサンプルを消化し、潜在的なＰＣＲインヒビターがそのレジンに結合され、そのレジンは、ＰＣＲによる増幅の前にサンプルから容易に除去することができる。

Ｒ．Ｊ．Ｂｕｅｓａ，Ｍ．Ｖ．Ｐｅｓｈｏｖ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２００９，１３，２４６〜２５６ Ｊ．Ｂ．Ａ．Ｏｋｅｌｌｏ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０，４００（１），１１０〜１１７

このキットは、ＦＦＰＥ組織から収集された核酸のＰＣＲベースの増幅では良好な結果をもたらし得るが、その方法は、他のその後の分析手順には好適ではない可能性がある。さらに、そのレジンは、上記消化混合物および上記脱蝋溶液に存在する特定の成分に適合させられている。ゆえに、そのキットは、任意の溶解緩衝液と組み合わせて使用することができない。

それゆえ、本発明によって解決される問題は、有毒な脱パラフィン剤も、面倒な洗浄工程も、サンプルから夾雑物またはＰＣＲインヒビターを捕捉するために特別に適合させたレジンも必要としない、ワックス包埋サンプルから核酸を抽出するための方法を提供することだった。

この目的は、本発明の方法によって満たされる。驚いたことに、脱パラフィンされた、先のワックス包埋サンプルの溶解が、ワックス可溶化剤および可溶化されたワックスを依然として含む二相系または多相系において、溶解の結果を損なうことなく達成され得るということが見出された。したがって、面倒な洗浄工程も、夾雑物を捕捉するためのレジンも、必要ない。

したがって、本発明は、ワックス包埋サンプルから核酸を抽出するための方法を提供し、この方法は：
１．水と不混和性の少なくとも１つの有機溶媒を含むワックス可溶化剤とサンプルとを接触させる工程、
２．工程１において得られた混合物を必要に応じてインキュベートする工程、
３．依然としてワックス可溶化剤を含む混合物に水性溶解緩衝液を加える工程、
４．工程３において得られた混合物をインキュベートすることにより、少なくとも有機相および水相を含む二相混合物または多相混合物を得る工程（上記有機相は、溶けたワックスおよびワックス可溶化剤を本質的に含み、上記水相は、核酸を含む）
を包含し、ここで、工程２が省略される場合、工程１および工程３は１つの組み合わされた工程としてもまた行われ得る。

上記方法は、任意の工程として：
５．水相から有機相を分離する工程、ならびに／または
６．水相から核酸を単離、および／もしくは精製する工程
をさらに包含し得る。

本発明に関して、用語「ワックス包埋サンプル」は、例えば、組織化学的分析またはさらなる化学的分析および／もしくは生物学的分析のために、ワックスに包埋された任意の生物学的サンプルを含む。そのようなワックスは、通常、高級炭化水素の複合混合物からなり、さらなる成分（例えば、高級脂肪酸および／またはグリコールのエステルなど）を含み得る。そのワックスは、天然起源および／または合成起源のものであり得、サンプル包埋特性を高める添加物（例えば、ＤＭＳＯまたは高級ポリオレフィン等）をさらに含み得る。好ましくは、そのワックスは、室温で固体の、主に飽和炭化水素の混合物であるパラフィンであり得る（代表的には石油の蒸留によって調製される）。どのタイプのパラフィン（いわゆる、高融点もしくは低融点パラフィンまたはそれらの混合物）が使用されるかとは無関係に、サンプルは、本発明の方法および／またはキットを用いて処理され得る。必要に応じて、パラフィンワックスは、例えば、ワックスの特定の特徴を改善するために、当該分野で公知の添加物（例えば、少量の有機ポリマーまたはＤＭＳＯ等）を含み得る。

好ましくは、サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルであり得、ここで、生物学的サンプルは、パラフィンに包埋される工程の前に、ホルムアルデヒドを用いて固定される。その生物学的サンプルは、生物体全体、生物の一部、特に、ヒト、動物もしくは植物が起源である組織フラグメントもしくは組織切片、または微生物（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）であり得る。細胞培養物から単離され包埋された細胞も同様に使用され得る。

溶解緩衝液（工程３）として、細胞含有材料中の細胞を溶解する／破壊することができる任意の水性溶液が使用され得、これにより、単離される核酸を破壊することなく核酸を溶液中に放出する。本発明の方法において使用され得る多くの水性消化緩衝液が、当該分野で公知である。包埋されたサンプルが固定されたサンプル、例えば、ホルマリン固定サンプルである場合、上記消化緩衝液は、サンプル中の架橋数を減少させるために、当該分野で公知の追加の成分を含んでもよい。しかしながら、約９０℃というインキュベーション温度が適用される場合、架橋数を減少させるための化合物が存在しなくても、工程４に記載のインキュベーション中に架橋が効率的に除去され得るので、溶解緩衝液中にそのような追加の成分が存在することは、必須ではない。

これらの溶解緩衝液は、一般に、水性溶液の形態でサンプルに適用されるので、溶解後、少なくとも１つの有機相（上記有機相は、溶けたワックスおよびワックス可溶化剤を本質的に含む）および水相（核酸（ならびに例えば、さらなる細胞成分）を含む）を含む多相混合物が得られる。ほとんどの場合、その多相混合物は、厳密に１つの有機相および厳密に１つの水相を含む二相混合物である。しかしながら、例えば、固相の存在下において溶解工程を同様に行うことが可能であり（その固相が、サンプルからのＰＣＲ阻害化合物を捕らえるように適合されていないという条件下で）、その場合、その混合物は、三相混合物とみなされ得る。また、ある種の「三相」混合物は、液体の水相と液体の有機相とを十分に混合した直後に観察されることがあり、その三相混合物は、先の２相および中間「相」を含み、上記先の２相のエマルジョンによって形成され、通常、混合を停止するとすぐさま分離する。さらに、溶解緩衝液に存在する化合物、そのｐＨおよび温度に応じて、サンプルの１つ以上の成分が、溶液から沈殿して、（さらなる）固相を形成し得る。

工程４に記載のように混合物をインキュベートした後、工程５では、有機相が必要に応じて水相から分離され得る。さらに、水相から核酸を単離および／または精製する工程が、本発明の方法に含められ得る（工程６）。

本発明の方法の大きな利点は、サンプルを脱蝋するために有毒な化学薬品が必要ないという点である。さらに、溶けたワックスをサンプルから分離するために、面倒な洗浄工程または特に適合させたレジンが必要ない。さらに、工程３において使用される溶解緩衝液、ならびに工程６に記載の、水相から核酸を単離および／または精製する任意の工程において使用される任意のさらなる試薬および手段が、幅広い方法および／または手段からほぼ自由に選択可能であり得、これは、サンプルの特定の要求に対して本方法を特別に適合させることができることを意味する。

ワックス可溶化剤は、好ましくは、無毒性であり得、水と不混和性の少なくとも１つの有機溶媒／化合物を含み得る。ワックス可溶化剤は、少なくともそれとサンプルとが接触するときは液体であり得る。好ましくは、上記溶媒は、直鎖状、分枝状および環状のＣ_１０〜Ｃ_１６アルカンまたはそれらの混合物を含む群から選択され得、より好ましくは、Ｃ_１３〜Ｃ_１６アルカンまたはそれらの混合物を含む群から選択され得、最も好ましくは、テトラデカン、ペンタデカンまたはヘキサデカンである。脱蝋するためにワックス包埋サンプルに適用される、純粋な形態または溶媒の混合物としての任意の溶媒の融点は、それぞれ好ましくは、室温（２３±２℃）未満である。さらに、上記溶媒または溶媒の混合物は、水に可溶であるべきではなく、すなわち、０．０１％（ｗ／ｗ）未満の水溶解性を有するべきであり、水と混和性であるべきではなく、すなわち、混合されたとき、水と均一な溶液を形成するべきではない。本明細書中で、用語「純粋な形態」とは、予め希釈されることなく、かつ／または他の溶媒と混合されることなく、ワックスを溶かすためにワックス包埋サンプルに適用される溶媒のことを指す。しかしながら、それは、溶媒ではないさらなる化合物の存在に関する特定の純度のグレードのことを指さない。溶媒が、純粋な形態でサンプルに適用される場合、その溶媒は、好ましくは、室温よりも低い融点を有する。しかしながら、室温より高い融点を有する「溶媒」が、室温（２３±２℃）で液体である溶媒の混合物において存在する場合、その室温より高い融点を有する溶媒をワックス包埋サンプルに適用してもよい。

好ましくは、溶媒または溶媒の混合物は、１５０℃より高い、より好ましくは、２００℃より高い、最も好ましくは、２５０℃より高い沸点を有する。１５０℃より高い沸点を有するワックス可溶化剤を選択することによって、サンプルのパラフィンが、いったん液化されると液体の状態のままとなり、ワックス可溶化剤の意図されない蒸発に起因して再度硬化しないことを容易に保証することができる。さらに、驚いたことに、上で述べられた有機溶媒またはそれらの混合物は、例えば、ヘキサンまたはヘプタンなどの低級アルカンの挙動とは対照的に、ＳＤＳのような洗浄剤の存在下でさえも、通常、工程３に記載の溶解緩衝液を加えた後に得られる水相と安定したエマルジョンを形成する傾向が非常に低いことが見出されている。さらに、上記溶媒のすべてが、室温において数秒以内に、またはせいぜい数分で（好ましくは、約１５秒〜約１５分で）、固形パラフィンを溶かすことができる。

水相と有機相との間の界面の光学的な検出を容易にするために、上記ワックス可溶化剤に可溶性であるが水に不溶性である色素／着色料をワックス可溶化剤中に含めてもよい（例えば、水に不溶性であるアントラキノン溶媒色素、例えば、「オイルグリーン（ｏｉｌ ｇｒｅｅｎ）」として商業的に入手可能な１，４−ビス［（４−メチルフェニル）アミノ］−９，１０−アントラセンジオン）。例えば、約３０ｍｌのワックス可溶化剤、例えば、ヘキサデカン中の約１ｍｇもの少量の「オイルグリーン」（およそ０，００３％（ｗ／ｖ）に等しい）が、水相の色を変化させずに有機相に強い色を与えるのに十分であり、それにより、相分離が有意に容易になる。

工程２に記載の、ワックス包埋サンプル中のワックス可溶化剤の混合物をインキュベートする工程は、１５〜８５℃、好ましくは、２０〜５５℃、より好ましくは、室温から３５℃の範囲内の温度、最も好ましくは、室温において行われ得る。このインキュベーション工程が行われる場合、それは、好ましくは、１秒〜３時間、より好ましくは、１０秒〜１時間、さらにより好ましくは、２０秒〜３０分間、最も好ましくは、３０秒〜５分間にわたって継続され得る。同様に、ワックス可溶化剤および水性溶解緩衝液が、同時にまたは「ほぼ同時に」（すなわち、他方の直後に一方が、つまり、溶解緩衝液の直後に脱蝋剤が、またはその逆で）サンプルに適用され得る。この場合、本発明の方法の任意の工程２は省略され、工程１および３が、同時にまたは「ほぼ同時に」行われる。

本発明の方法では、水性溶解緩衝液が、ワックス可溶化剤と同時にまたは「ほぼ同時に」サンプルに加えられたとしても、低温において、非常に迅速かつ（ほぼ）定量的な様式で、包埋媒体がサンプルから除去され得るという点が、特に有益である。ゆえに、溶解の前の時間のかかる面倒な脱蝋工程および相分離工程が必要ない。

したがって、当該分野で公知のいくつかの方法とは対照的に、ワックスを除去するために、（特に、プロテイナーゼによって（まだ）不活性化されていない核酸消化酵素（例えば、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ）がサンプルに存在する場合）核酸の質および収量に悪影響を有し得る高い温度および／または長いインキュベーション時間は必要ない。水性溶解緩衝液は、包埋されたサンプルよりも迅速かつ効率的に、脱パラフィン化されたサンプルに浸透することができるので、溶解の前または溶解と同時のパラフィンの除去はまた、必要な溶解時間を短縮し、すなわち、より短い溶解時間および／またはより低い溶解温度が適用され得る。

しかしながら、水性溶解緩衝液を加える前に、サンプルをワックス可溶化剤と接触させてインキュベートする必要はない。そのうえ、ワックス可溶化剤および水性溶解緩衝液をサンプルに同時に加えてもよい。この場合、サンプルは、例えば、ボルテックスすること、実験室のシェーカー上で振盪すること、上下にピペット操作をすること（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）などによって（これらに限定されない）、好ましくはそれらの相が十分に接触することを保証するように混合される。プロテアーゼなどの追加の化合物を同様に加えてもよい。

本発明の方法は、当該分野で公知の幅広い溶解緩衝液および溶解プロトコル（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＦＦＰＥキットに含められている緩衝液ＡＴＬ、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ ＤＮＡキットに含められている緩衝液Ｐ１（両方が、ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）または緩衝液ＰＢＳ）と組み合わせて使用することができる。その溶解緩衝液は、例えば、緩衝剤（好ましくは、Ｔｒｉｓ、Ｍｏｐｓ、Ｍｅｓ、Ｈｅｐｅｓ、ホウ酸塩、リン酸塩および炭酸塩を含む群から選択される）および少なくとも１つの洗浄剤（好ましくは、非イオン洗浄剤、陰イオン洗浄剤、陽イオン洗浄剤および両性イオン洗浄剤を含む群から選択される）、またはそれらの混合物を含み得る。より好ましい洗浄剤は、陰イオン洗浄剤または両性イオン洗浄剤から選択される。最も好ましくは、溶解緩衝液は、陰イオン洗浄剤、最も好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウムを含み得る。さらに、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）またはＴｗｅｅｎ２０（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）として商業的に入手可能な、置換フェノールまたは糖ポリエトキシレートなどの非イオン性界面活性物質、ならびに陽イオン性界面活性物質（例えば、四級アンモニウム界面活性物質、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）またはテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ））が使用され得る。

溶解緩衝液は、１つ以上の追加の物質（好ましくは、キレート剤、還元剤、硫酸アンモニウムなどの無機塩、ｐＨ指示薬、およびアジ化ナトリウムなどの安定剤を含む群から選択される）を含み得る。好ましくは、溶解緩衝液は、４〜１１、好ましくは、７〜１０、最も好ましくは、８〜９の範囲内のｐＨを有し得る。

溶解緩衝液のほかに、タンパク分解剤が工程３において混合物に加えられ得る。そのタンパク分解剤は、同様に、工程３においてサンプルに加えられる溶解緩衝液に予め含められていてもよい。上記タンパク分解剤は、好ましくは、プロテアーゼおよび非酵素的タンパク分解性化合物を含む群から選択され得、好ましくは、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ブロモシアン、組換えＢａｃｉｌｌｕｓプロテアーゼ（例えば、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼＬｙｓｏｚｙｍｅ）またはそれらの混合物であり得る。

工程４に記載の、サンプルに水性溶解緩衝液を加えた後に得られた混合物をインキュベートする工程は、好ましくは、１５〜９５℃、好ましくは、２０〜７０℃、最も好ましくは、３７〜６５℃の範囲内（例えば、５６℃）の温度において行われ得る。このインキュベーションは、好ましくは、３０秒〜２４時間、より好ましくは、４５秒〜１２時間、さらにより好ましくは５０秒〜５時間、最も好ましくは、１分〜２時間にわたって行われ得る。しかしながら、インキュベーションの温度と時間の両方が、サンプルの種類、量および経過時間（ａｇｅ）、ならびに使用される溶解緩衝液によって変化し得る。このことは、当業者に周知であり、特に、最適な溶解条件は、インキュベーション時間および温度に関して、通例の実験を用いて当業者によって容易に決定され得る。多くの場合、「２工程インキュベーション」手順を行うことが好ましい場合もあり、まず、３７〜６５℃の範囲内の温度において、例えば、約１分〜約３時間にわたって、混合物をインキュベートし、次いで、必要に応じて水相から有機相を分離し、約９０℃の温度において、例えば、約１０分〜約５時間にわたって、水相をインキュベートする。水相から有機相を必要に応じて分離することは、９０℃のインキュベーションがすでに行われたときにだけ行う場合もある。後者の場合は、水相の蒸発が減少する。

工程６に記載の、水相に含まれている核酸を単離および／または精製する工程は、好ましくは、少なくとも１つのクロマトグラフィーおよび／または固相ベースの方法（好ましくは、順相および逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、三重らせんアフィニティークロマトグラフィーならびにカオトロープ非含有親和性結合（吸着）（結合剤によって媒介されるシリカまたはポリスチロールマトリックス／表面への吸着を含む）を含む群から選択される）を用いて行われ得る。あるいは、または追加的に、例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン性界面活性物質を用いて、核酸を選択的に沈殿させるか、または、例えば、硫酸アンモニウムを用いてタンパク質を沈殿させることによってサンプルに存在する不純物／望まれないさらなる化合物を選択的に沈殿させることによっても、核酸は精製され得る。

本発明に記載の二相または多相溶解手順は、当該分野で公知の核酸を単離および／または精製するための幅広い種々の手順（例えば、商業的に入手可能なＱＩＡａｍｐ、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ組織キット（これらすべてＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従った手順）と適合性がある。核酸を単離および／または精製するために使用される手順に応じて、溶けたワックスおよびワックス可溶化剤を含む有機相が、任意の工程５において水相から分離され得、その後、核酸を単離および／または精製するために、水相がさらに処理され得る。例えば、ビーズへの吸着、例えば、カオトロープによって媒介されるかまたはカオトロープによって媒介されないシリカビーズへの吸着が、水相から核酸を単離および／または精製するために使用される場合、先行する工程において水相から有機相を分離することは多くの場合において必要ない（特に、その混合物中にカオトロープが存在しない場合）。他方で、その混合物が、例えば、塩化グアニジニウムを含む場合、有機相が水相から分離されることが好都合であり得、その後、水相と固相とが接触させられ得る。ゲル濾過クロマトグラフィー工程を用いる方法では、カオトロープが水相に存在しなかったとしても、水相をクロマトグラフィーカラムに適用する工程の前に水相から有機相を除去することが有益であり得る。相分離中に失われる可能性のある水／緩衝液をクロマトグラフィーの前に補うために、水相を有機相から分離した後に、水相の体積を調節することおよび必要に応じて調整することが好ましい場合がある。

例えば、本発明に記載される二相系または多相系における溶解の原理を、同時係属中の出願の出願番号ＥＰ１０００３７５９．７、ＥＰ１０００３７６５．４およびＥＰ１０００３７６６．２に記載されている溶解手順および／またはゲルクロマトグラフィー手順と組み合わせることが好ましい場合がある。本方法は、さらに、同時係属中の出願ＥＰ１０００３７６７．０に記載のＲＮＡ除去のための方法と組み合わされ得る。好ましいプロトコルにおいて、ワックス包埋サンプルは、本発明に記載のワックス可溶化剤、および適切な容積のＥＰ１０００３７５９．７に記載の溶解緩衝液（少なくとも陰イオン界面活性物質、ならびに必要に応じて緩衝物質および／またはプロテイナーゼを含むが、キレート剤または錯化剤を本質的に含まない）と同時に混合され得る。パラフィンは、上に記載されたように、例えば、サンプルをワックス可溶化剤と接触させてボルテックスすること、および必要に応じて、例えば、好ましくは、約５０〜６５℃の温度において５〜１５分間にわたって、その混合物をインキュベートすることによって、溶かされ得る。この時点において、水相および有機相は、所望であれば、例えば、慎重なピペット操作によって、例えば、下の水相を取り出すことによって、はやくも互いから分離され得る。サンプル中の細胞材料の溶解、およびサンプルのホルムアルデヒド固定に起因する架橋の除去は、好ましくは、約９０℃の温度における、例えば、１０〜６０分間、好ましくは、１５〜４５分間、より好ましくは、２５〜３５分間にわたる第２インキュベーション工程によって完了し得る。溶解緩衝液は、好ましくは、陰イオン界面活性物質イオンを含み得、そのイオンは、工程４に記載のインキュベーション後、アルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオン（好ましくは、Ｒｂ^＋、Ｃｓ^＋、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｂａ^２＋またはそれらの混合物を含む群から選択される）を用いた沈殿によって、サンプルから本質的に除去され得、その後、好ましくは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、水相から核酸が単離および／または精製され得る。水性サンプル溶液から陰イオン界面活性物質イオンを選択的に沈殿させる場合、アルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオン（好ましくは、Ｒｂ^＋、Ｃｓ^＋、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｂａ^２＋またはそれらの混合物を含む群から選択される）を含む、ＥＰ１０００３７６５．４に記載されているような沈殿溶液が、サンプルに加えられ得る。沈殿物の形成の完全性を確実にするために、混合物は、必要に応じて、例えば、約−５〜５℃の温度において、約３〜２０分間にわたって、インキュベートされ得る。

ＥＰ１０００３７６６．２に記載されているゲルクロマトグラフィーデバイスおよび方法、すなわち、およそ１５０〜５００ｂｐのサイズ排除限界を有するゲル形成ポリマーマトリックスを備えるクロマトグラフィーデバイスを用いて、上記混合物から、ＤＮＡが好ましくは単離され得（および同時に精製され得）、ここで、そのクロマトグラフィーデバイスは、好ましくは、いわゆるスピンカラムの形態であり得、溶出は、好ましくは、そのカラムを「回転させること」によって、すなわち、遠心分離によって溶出溶媒をカラムに通すことによって、行われ得る。この方法とデバイスとの組み合わせを用いると、高度に精製されたＤＮＡ、特に、塩およびさらなるインヒビター含量が非常に少ないｇＤＮＡが得られ、それは、さらなる処理工程（例えば、緩衝液交換）の必要なしに、ＰＣＲ、ライゲーション、ハイブリダイゼーションなどの技術を含む下流の適用において直接使用され得る。

上で述べられた同時係属中の出願に対して行われる言及は、本発明の方法の例示的な適用として理解されるべきである。しかしながら、本発明の方法は、上で述べられた特定のプロトコルおよびデバイスと組み合わされるとは限定されず、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびカオトロープ非含有親和性結合と組み合わせても同様に良好に行われ、それにより、優れた純度ならびに塩およびさらなるインヒビター含量が少ない高収量の核酸がもたらされ、それらは、上で述べられた下流の適用において直接使用することができる。

本発明に従って単離および／または精製される核酸は、好ましくは、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＮＡ）を含む群から選択され得る（真核生物、原核生物またはウイルス起源の天然に存在する核酸、組換え核酸および／または化学的もしくは生物工学的に操作された核酸（以下に限定されないが、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）またはそれらのフラグメントを含む）を含む）。好適な溶解緩衝液（例えば、ＱＩＡＧＥＮ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から商業的に入手可能な緩衝液ＰＫＤ）を使用するとき、異なる種類の核酸であっても、本発明の方法を用いることにより同じサンプルから単離され得る（実施例７に示されるように）。好ましくは、上記核酸は、ＤＮＡ、より好ましくは、少なくとも１００ｂｐの長さを有するＤＮＡであり得る。

本発明は、架橋ワックス包埋サンプル、好ましくは、ＦＦＰＥサンプルから核酸を抽出、単離および／または精製するための方法、好ましくは、上に記載された方法において、ワックス包埋サンプルからワックスを除去するための、直鎖状、分枝状および環状のＣ_１０〜Ｃ_１６アルカンを含む群から選択される溶媒、より好ましくは、Ｃ_１３〜Ｃ_１６アルカンを含む群から選択される溶媒、最も好ましくは、テトラデカン、ペンタデカンまたはヘキサデカンである溶媒の使用をさらに提供し、ここで、サンプル中の架橋を溶解する工程は、好ましくは、少なくとも１つ以上の上記溶媒および水性溶解緩衝液から形成される二相混合物または多相混合物において行われ得る。

本発明の方法は、上に記載されたようなワックス包埋サンプルから核酸を抽出、単離および／または精製するためのキットをさらに提供し、そのキットは、（１）ワックス可溶化剤、好ましくは、上に記載されたようなワックス可溶化剤、および必要に応じて（２）工程３に記載の二相系または多相系において溶解を行うための指示書を備える。そのキットは、（３）水性溶解緩衝液、好ましくは、上に記載されたような溶解緩衝液、（４）タンパク分解剤、好ましくは、上に記載されたようなタンパク分解剤、ならびに（５）クロマトグラフィーおよび／または親和性結合用の固相を含む群から選択される１つ以上の追加の構成要素をさらに備え得る。

図１は、特定の溶解および単離プロトコル（実施例１）に対する、キシレン脱蝋工程の存在（それぞれ柱２および４）または非存在（それぞれ柱３および５）の影響を示している。柱１における比較のために、商業的に入手可能なＱＩＡａｍｐキットを製造者のプロトコルに従って使用して得られた結果も示している。 図２は、種々の溶媒を使用した本発明に記載の二相溶解手順を用いたときの、ゲル濾過クロマトグラフィーによって得られた溶出液に存在する残留ＳＤＳの量を示している（実施例２）。 図３および４は、その後のＰＣＲにおいて得られたＣｔ値に対する脱蝋溶媒の影響を示している（実施例３）。 図３および４は、その後のＰＣＲにおいて得られたＣｔ値に対する脱蝋溶媒の影響を示している（実施例３）。 図５は、得られた溶出液をそれぞれ１：１０または１：１００の希釈率で用いたＰＣＲにおいて得られるＣｔ値に対する、ＱＩＡａｍｐプロトコルにおいてもともとの脱蝋溶媒であるキシレン（図５において「Ｑａｍｐ」と表示されている）をヘキサデカン（図５において「Ｈｅｘ Ｑａｍｐ」と表示されている）によって置き換えた影響、ならびにＱＩＡａｍｐプロトコルに記載の別個の脱蝋工程および溶解工程を本発明に記載の二相プロトコル（「ＳｉＳｔＬｙ Ｑａｍｐ」）によって置き換えた影響（実施例６）を示している。

実施例１：ＳＤＳ沈殿を含む、核酸を単離するための方法において、キシレンを用いてＦＦＰＥサンプルを脱蝋することの影響（「１工程単離」）
予備実験において、２５ｍｍｏｌ／ＬのＴＲＩＳおよび２５ｍｍｏｌ／ＬのＳＤＳ（ｐＨ８．５）を含み、１０μＬのＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ、２，５ＡＶ／ｍｌ）および１μＬのＲＮａｓｅ Ａ（１０Ｕ／ｍｌ）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が補充された、８０μＬのＥＰ１０００３７５９．７に記載されている溶解緩衝液中で、ＦＦＰＥ組織ブロックからの切片（各１０μｍ厚）を溶解した。その混合物をボルテックスし、次いで、５６℃で１時間インキュベートした後、９０℃、１時間の第２インキュベーション工程を行った。次いで、ＥＰ１０００３７６５．４に記載されているようにそのサンプルからドデシル硫酸イオンを沈殿させるために１０μＬの沈殿溶液を加えた（上記溶液は、１．０ｍｏｌ／ＬのＳｒＣｌ_２を含む）。その混合物をボルテックスし、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、ＥＰ１０００３７６６．２に記載されているように全溶解産物をゲル濾過カラム（２７１ｂｐのサイズ排除限界を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌレジンＳ−４００ＨＲを含む）に移し、３分間にわたる７００×ｇでの遠心分離によって核酸を溶出することによって、サンプルに存在するｇＤＮＡを単離した。

高純度かつ低ドデシル硫酸ナトリウム含量のｇＤＮＡが得られたが、様々な実施において得られた収量は様々だった。十分適切にパラフィンが溶かされていない可能性があると考えられた。

したがって、第１のアプローチでは、別個の工程においてＦＦＰＥ組織サンプルからパラフィンを除去するための溶媒としてキシレンを試験した後、溶解手順を適用し、それに続いて上に記載されたようなゲル濾過クロマトグラフィーを行った。したがって、各実験において、ラット肝臓ＦＦＰＥサンプルからの３つの切片（各１０μｍ厚）を、まず、脱蝋剤としてキシレンを用いて処理したか、または上に記載された溶解手順に直接供した。第１インキュベーション工程は、それぞれ５６℃または６２℃において行った。

１ｍＬのキシレンをそれぞれのサンプルに適用し、その混合物を１０秒間ボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、次いで、ピペット操作によって上清を分離することによって、脱蝋を行った。１ｍＬのＥｔＯＨを水相に加え、その混合物をボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。次いで、上清をピペット操作によって分離した。水相を含むチューブを開放したまま室温で約２０分間静置することにより、残留ＥｔＯＨを蒸発させた。次いで、ＤＮＡの溶解および単離を上に記載されたように行った。ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られた溶出液中のＳＤＳの残留量を、ＥＰ１０００３７６５．４に記載されているように測定した。

結果を図１に表す（柱２：キシレン脱蝋工程ありおよび６２℃での第１インキュベーション工程；柱３：キシレン脱蝋工程なしおよび６２℃での第１インキュベーション工程；柱４：キシレン脱蝋工程ありおよび５６℃での第１インキュベーション工程；柱５：キシレン脱蝋工程なしおよび５６℃での第１インキュベーション工程）。比較のために、同じＦＦＰＥブロックからの３つの切片（各１０μｍ）を、ＱＩＡａｍｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示書に従って使用して（５６℃、１時間の第１インキュベーション工程に続く、９０℃、１時間の第２インキュベーション工程を含む）処理した（図１中の柱１）。

図１から、脱蝋剤としてキシレンを使用することにより、それぞれＥＰ１０００３７５９．７、ＥＰ１０００３７６５．４およびＥＰ１０００３７６６．２に記載されているいわゆる「１工程」精製手順において、ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られた溶出液中に残留するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の量に対する望まれない影響がもたらされることが見て取れる。

実施例２：ＳＤＳ沈殿を含む、核酸を単離するための方法における、種々のアルカンを用いたＦＦＰＥサンプルの脱蝋の影響
次に、キシレンの代わりに、種々の鎖の長さの直鎖状アルカン、すなわち、トリデカン（図１において「１」と表示されている）、テトラデカン（図２における「２」）、ペンタデカン（図２における「３」）およびヘキサデカン（図２における「４」）を脱蝋剤として使用した。これらの溶媒のすべてが、わずか数分（約１〜２分）以内に室温においてパラフィン包埋サンプル中の固形パラフィンを完全に溶かすことができた。脱蝋し、有機液相を除去した後、実施例１に記載されたような「１工程単離プロセス」に従ってサンプルを処理した。いかなる脱蝋工程もなしに、さらなるサンプルを処理した（図２における「５」）。

まず、それぞれのアルカンでＦＦＰＥ組織切片を脱蝋し、次いで、上に記載されたいわゆる１工程プロトコルに従ってサンプルに存在するｇＤＮＡを単離することによって得られた溶出液に存在するＳＤＳの量を図２に表す。ＳＤＳの量は、上に記載されたように測定された。

各実験を４回行った。いくつかのサンプルでは、ＳＤＳの量が少なすぎて、測定のために適用された手順を用いて検出できなかった。

実施例３：二相系における同時の脱蝋および溶解
ＦＦＰＥブロックからの４つの切片の各々（各１０μｍ）を、１００μＬの実施例１に記載された溶解緩衝液、１０μＬのプロテイナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ならびにそれぞれ１００μＬのｎ−デカン、ｎ−ドデカン、ｎ−ヘキサデカン、灯油およびオクチルエーテルと混合し、切片全体が溶けるまでボルテックスした（これは、各場合において室温で１分未満を要した）。次いで、その混合物を５６℃で５分間インキュベートした。その混合物を約２００００×ｇで５分間遠心分離することにより、水相を有機相から分離した。その水相を取り出し、９０℃で１時間インキュベートした。次いで、１０μＬの実施例１に記載されたＳｒＣｌ_２溶液を加え、その混合物をボルテックスし、氷浴内で１０分間インキュベートした。次いで、その混合物を最高速度で５分間遠心分離し、１００μＬの上清の核酸を、実施例１に記載された１工程プロトコルを用いて精製した。

得られたｇＤＮＡをＰＣＲにおいて増幅した。１８Ｓ ｒＤＮＡとアニーリングするプライマー対を用いて、２５μｌのＰＣＲサンプル中２μｌの溶出液を増幅した（これは、１４９ｂｐのフラグメントをもたらす）。２倍濃縮のＳｙＢｒ−Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（１２．５μＬ）、１．２５μＬの順方向および逆方向１８Ｓプライマーの各々（ｃ＝１０μＭ）、ならびに鋳型として２μＬの溶出液および８μｌの水を使用した。反応をＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ）において行った。９４℃で１５秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長を行った。合計で、４０サイクルを行った。得られたＣｔ値を図３に示す。それぞれｎ−デカン、ｎ−ドデカン、ｎ−ヘキサデカン、灯油またはオクチルエーテルの各々を使用して、上に記載された二相溶解手順を用いることにより、その後のＰＣＲにおいて容易に増幅され得るｇＤＮＡを得ることができることが見て取れる。ｎ−ヘキサデカンおよびオクチルエーテルは、その後のＰＣＲにおいて最低のＣｔ値をもたらした；しかしながら、オクチルエーテルを用いたときは、溶出液中のＳＤＳの残留量は、ヘキサデカンを用いたときよりも多かった。

さらなる実験において、上に記載された手順を使用し、各溶媒についてそれぞれ６回の実施を行って、テトラデカンおよびヘキサデカンを比較した。ゲル濾過クロマトグラフィー後に得られた、精製されたｇＤＮＡを含む溶出液を、それぞれ、得られたまま（図４において「無希釈」と表示されている）または水で１０倍希釈した後のものとして、ＰＣＲにおいて使用した。結果を図４に表す。

実施例４：二相混合物中で溶解されたＦＦＰＥサンプルから増幅され得るフラグメントの長さの範囲に対する調査
上記サンプル中の架橋およびその除去の影響に起因して、ＦＦＰＥサンプルから単離および／または増幅され得る核酸フラグメントの最大長が限定されることは、当業者に周知である。本発明に記載の二相溶解手順が、ＰＣＲにおいて処理され得るフラグメント長をさらに限定するか否かを試験するために、脱蝋剤としてｎ−ヘキサデカンを使用してＦＦＰＥサンプルを脱蝋し、溶解し、そして上記１工程プロトコルによって、得られた混合物を精製した後に得られた溶出液を用いて、４つの異なる標的長について試験を行った。表１に示されるように、それぞれ７８ｂｐ、４６３ｂｐ、７２５ｂｐおよび８１５ｂｐのフラグメントを、ＰＣＲ反応において容易に増幅することができた。いくつかの追加のより短いフラグメントのみが、８１５ｂｐフラグメントのＰＣＲ反応物から得られた電気泳動ゲルにおいて観察された（データ示さず）。

実施例５：ＦＦＰＥラット肝臓サンプルからのｇＤＮＡの単離および精製
ＦＦＰＥラット肝臓ブロックからの各１０μｍ厚の２つの切片を、１５０μＬの実施例１に記載された溶解緩衝液、１０μＬのプロテイナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１μＬのＲＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１５０ｍＬのｎ−ヘキサデカンと混合した。そのサンプルをボルテックスし、次いで、５６℃で約１０分間インキュベートした。次いで、相を分離するためにサンプルを最高速度で遠心分離し、ＤＮＡを含む１３０μＬの下の水相を、ピペット操作によって取り出し、新しいチューブに移した。その水性サンプルを９０℃で３０分間インキュベートした後、蓋の内側から液滴を除去するためにそのサンプルを短時間にわたって遠心分離してもよく、その後、１０μＬの実施例１に記載されたＳｒＣｌ_２溶液を加えた。その混合物をボルテックスし、次いで、氷浴内で１０分間インキュベートした。次いで、全混合物を、実施例１に記載されたように、予め遠心分離（７００×ｇ，３分間）した１工程カラム上に移した。そのカラムを７００×ｇで３分間遠心分離することによって、ｇＤＮＡを精製した。次いで、精製されたｇＤＮＡを含む溶出液を、下記に記載されるように分析した。得られたＤＮＡは、任意のさらなる精製工程なしに、下流の適用において直接使用することができる。

１０μＬの溶出液を、実施例３に記載されたように１８Ｓ ＲＴ−ＰＣＲにおいて増幅したところ、そのＰＣＲにおいて溶出液を予め希釈せずに使用した場合、１５．１２というＣｔ値が得られた。溶出液に存在するＳＤＳの残留量は、約１〜３μＭもの少なさだった。

実施例６：ＱＩＡａｍｐプロトコルにおいてキシレンの代わりにヘキサデカンを用いる脱蝋
ＦＦＰＥラット肝臓ブロックの２つの切片（各１０μｍ）を、ＦＦＰＥ ＱＩＡａｍｐキットを製造者の指示書に従って使用して（脱蝋のためにキシレンを使用して）（代替法ａ）、脱蝋のためにｎ−ヘキサデカンを使用し、溶解の前にその脱蝋剤を除去して（代替法ｂ）、または本発明に従って、サンプルを溶解しつつ、同時に脱蝋のためにｎ−ヘキサデカンを使用して（代替法ｃ）、処理した。

代替法ａ）（図５において「Ｑａｍｐ」と表示されている）
ＱＩＡａｍｐの標準的なプロトコルに従って、ＦＦＰＥブロックからの１０μｍの切片を、１ｍＬのキシレンに懸濁し、１０秒間ボルテックスすることによって混合し、次いで、最高速度で２分間遠心分離した。ピペット操作によって上層を除去した後、１μＬのエタノールを加え、混合し、遠心分離し、ピペット操作により上相を除去することによって、残留キシレンを抽出した。次いで、残留エタノールが蒸発するまで、チューブを開放したまま室温で約２０分間インキュベートした。ペレットを溶解するために、それを１８０μＬの緩衝液ＡＴＬ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁し、２０μＬのプロテイナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２，５ＡＵ／ｍｌ）を加え、ボルテックスすることによってサンプルを混合した。次いで、サンプルを、第１インキュベーション工程において５６℃で１時間インキュベートした後、９０℃で１時間にわたって第２インキュベーション工程を行った。室温まで冷却した後、ＲＮＡ消化のためにそのサンプルに１μＬのＲＮａｓｅ Ａ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。２００μＬの緩衝液ＡＬを加え、その混合物をボルテックスした。次いで、２００μＬのエタノールを加え、その混合物を再度ボルテックスし、次いで、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移した。上記カラムを６０００×ｇで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、カラムを、５００μＬの第１洗浄緩衝液ＡＷ１（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に続いて５００μＬの緩衝液ＡＷ２（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した（両方の場合において、６０００×ｇで１分間遠心分離することによって洗浄緩衝液をカラムに通した）。次いで、そのカラムを最高速度で約３分間遠心分離することにより、残留する微量の緩衝液を除去した後、最後に、１００μＬのＲＮａｓｅ非含有水をそのカラムの内側の膜に適用し、それを室温で約１分間インキュベートし、最後にそのカラムを最高速度で１分間遠心分離することによって、精製されたｇＤＮＡを溶出した。

代替法ｂ）（図５において「Ｈｅｘ Ｑａｍｐ」と表示されている）
切片に、１８０μＬの緩衝液ＡＴＬ、２０μＬのプロテイナーゼＫおよび１００μＬのヘキサデカンを加え、その混合物をボルテックスし、次いで、５６℃で１０分間インキュベートした。その混合物を最高速度で２分間遠心分離し、下の水相を分離し、新しいチューブに移した。サンプルのさらなる処理を、上で述べたＱＩＡａｍｐプロトコルに従って、９０℃における１時間のインキュベーション工程から開始して行った。

代替法ｃ）（図５において「Ｌｙ Ｑａｍｐ」と表示されている）
本発明に従って改変されるプロトコルでは、切片をまずキシレンで処理せず、１５０μＬの実施例１に記載された溶解緩衝液、１０μＬのプロテイナーゼＫ、１μＬのＲＮＡｓｅ Ａおよび１５０μＬのヘキサデカンを切片に加える。その混合物をボルテックスし、５６℃で１０分間インキュベートした。遠心分離後、１２０μＬの下の水相を新しいチューブに移し、９０℃で３０分間インキュベートした。２００μＬの緩衝液ＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および２００μＬのエタノールをサンプルに加え、次いで、ＱＩＡａｍｐプロトコルに従ってＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを使用し、１００μＬの水で溶出して、核酸を精製した。

次いで、得られたｇＤＮＡを、２倍濃縮のＳｙＢｒ−Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（１２．５μＬ）、１．２５μＬの順方向および逆方向１８Ｓプライマーの各々（ｃ＝１０μＭ）、ならびに鋳型として、１０μＬの溶出液（それぞれ水を用いて１：１０または１：１００の比で希釈された）を用いる１８Ｓ−ＰＣＲにおいて増幅した。反応をＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ）において行った。９４℃で１５秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長を行った。合計で、４０サイクルを行った。

結果を図５に表す。脱蝋のためにヘキサデカンを使用したとき、得られたＣｔ値が、脱蝋のために有毒なキシレンを用いたときとほぼ同程度に良好であったことが理解できる。さらに、溶解および脱蝋だけでなく、ＲＮＡ消化も、多相系において行われ得ることが理解できる。

実施例７：同じＦＦＰＥサンプルからのＲＮＡとＤＮＡの両方の単離
この実験では、ラット腎臓ＦＦＰＥ組織からの１８個の切片（切片１つあたり１０μｍ、１実施あたり２つの切片）を、同時係属中の欧州出願１０００１９９５．９に記載されている方法に従って、溶解工程の前の脱蝋のために種々の溶媒を使用して、または本発明に記載の多相溶解手順を用いて、処理した。２つのさらなるサンプルを比較するために、ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示書に従って使用して、ＲＮＡを単離した（サンプル１９および２０）。

Ａ．脱蝋および溶解
Ａ１ 溶解前の別個の脱蝋工程におけるキシレンの使用（サンプル１および２）
１ｍＬのキシレンを切片に加えた。その混合物を１０秒間ボルテックスし、次いで、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、１ｍＬのエタノールを、残っているペレットに加えた。その混合物をボルテックスし、次いで、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、バイアルを３７℃で１０分間インキュベートすることにより、残っているエタノールを蒸発させた。

Ａ２ 溶解前の別個の脱蝋工程におけるヘプタン／メタノールの使用（サンプル３〜８）
１ｍＬのヘプタンを切片に加えた。その混合物を１０秒間ボルテックスし、次いで、それぞれ室温で１時間（サンプル３および４）もしくは１５分間（サンプル５および６）インキュベートするか、または単に室温で数秒間、振盪した（サンプル７および８）。次いで、５０μＬのメタノールを加え、その混合物を１０秒間ボルテックスし、次いで、９，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、ペレットを放置して、室温で５分間乾燥させた。

Ａ３ 溶解前の別個の脱蝋工程におけるヘキサデカンの使用（サンプル９〜１２）
１ｍｌのヘキサデカンを各切片に加えた。その混合物を１０秒間ボルテックスし、次いで、室温で１時間静置するか（サンプル９、１０）、または数秒間、振盪することによってさらに混合した（サンプル１１、１２）。次いで、その混合物を室温において最高速度で（約２００００×ｇ）または９，０００×ｇで遠心分離した（サンプル１１、１２）。上清を慎重に除去した後、バイアルを３７℃で１０分間インキュベートすることにより、残っている有機溶媒を蒸発させた。

上記脱蝋手順Ａ１〜Ａ３から得られた各ペレットに、１５０μＬの緩衝液ＰＫＤ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μＬのプロテイナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。その混合物をボルテックスし、次いで、振盪インキュベーターにおいて１５分間にわたって、５６℃、１，４００ｒｐｍでインキュベートした。次いで、そのサンプルを氷上で３分間インキュベートし、その後、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより、主にＲＮＡを含む上清、および主にＤＮＡを含むペレットを得た。

Ａ４ 本発明に記載の同時の溶解を伴った脱蝋（サンプル１３〜１８）
１５０μＬの緩衝液ＰＫＤを切片に加えた後、１０μＬのプロテイナーゼＫおよび２００μＬのｎ−ヘキサデカンを加えた。その混合物を手作業で振盪し、次いで、振盪インキュベーター上で５６℃、１，４００ｒｐｍで１５分間インキュベートした。次いで、そのサンプルを２０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、４つの「相」を得た（上から下に向かって数えて）：１．無色透明の液体、２．白っぽい濁った液体、３．わずかにグリース状の透明の液体、および４．ペレット。

サンプル１３〜１５では、相１および２を分離し、廃棄した。相３をペレット（相４）から分離し、さらなる処理のために新しいチューブに移した。

サンプル１６〜１８の各々では、すべての液相（１〜３）を一緒にペレットから取り出し、最高速度で１分間遠心分離した。再度、３つの液相を得た。上記３つの液相を互いから分離した。上の液相（本明細書中、以後、「ｏＰ」と表示されている）を新しいチューブに移し、中間の白っぽい相を廃棄し、下の水相（本明細書中、以後、「ｕＰ」と表示されている）を新しいチューブに移した。

Ｂ．オンカラムＤＮａｓｅ消化を用いた、液相からのＲＮＡの単離
サンプル１〜１８から得られた液相を、サーモシェーカーにおいて８０℃、４５０ｒｐｍで１５分間インキュベートし、次いで、５分間、室温に冷却した。３２０μＬの緩衝液ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、サンプルを混合した。次いで、１．１２ｍＬのエタノールを加え、そのサンプルを十分に混合し、７００μＬという最大容積を有するアリコートにおいてＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に適用した。各アリコートを適用した後、そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。オンカラムＤＮａｓｅ消化のために、そのカラムをまず、１．５Ｍ ＧＴＣおよび７５％エタノールを含む５００μＬの緩衝液で洗浄した（そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって）。フロースルーを廃棄し、７０μＬの緩衝液ＲＤＤ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と１０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ溶液（２，７ＫＵ／μｌ）とを混合し、そのカラムに加え、次いで、それを室温で１５分間インキュベートした。ＧＴＣおよびエタノールを含む５００μＬの上で述べた緩衝液を上記カラム上に加え、そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。各フロースルーを収集し、再結合のために同じカラムに再度適用した。そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ここで、フロースルーを廃棄した。７００μＬの緩衝液ＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をカラム上に加え、そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、ＲＰＥ処理を繰り返した。次いで、そのカラムを、蓋を開けて１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。３０μＬの水を、そのカラムの膜上に直接ピペットで加え、室温で１分間インキュベートし、次いで、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより、およそ３０μＬの溶出液を得て、それを収集し、さらに処理するまで−２０℃で保管した。

Ｃ．ＲＮａｓｅ消化なしでのペレットからのＤＮＡの単離
１８０μＬの緩衝液ＡＴＬ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各ペレットに加えた後、２０μＬのプロテイナーゼＫを加えた。そのサンプルを、振盪インキュベーターにおいて１，４００ｒｐｍ、５６℃で１時間インキュベートした後、９０℃、２時間の第２インキュベーション工程を行った。２００μＬの緩衝液ＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加え、直ちにそのサンプルを十分に混合し、次いで、２００μＬのエタノールを加え、再度直ちにサンプルを十分に混合した。その混合物の各々をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にピペットで加えた。上記カラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。７００μＬの緩衝液ＡＷ１を使用し、そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、そのカラムを洗浄した。フロースルーを廃棄し、７００μＬの緩衝液ＡＷ２を使用し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、そのカラムを洗浄し、再度、フロースルーを廃棄した。次いで、７００μＬのエタノールを各カラム上に加え、そのカラムを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、カラムを、蓋をあけて１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、膜を乾燥させた。３０μＬの緩衝液ＡＴＥ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を各カラムの膜上に直接ピペットで加え、そのカラムを１時間インキュベートし、次いで、１０，０００ｒｐｍで１時間、遠心分離して、フロースルーを収集することにより、各カラムのおよそ３０μＬの溶出液を得た。その溶出液を、さらに処理するまで−２０℃で保管した。

表１には、種々のサンプルがどのように処理されたのかに関する簡潔な概要が与えられている。

ＲＮＡの量（追加の「ａ」で表示される）およびＤＮＡの量（追加の「ｂ」で表示される）を、それぞれＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）において光学的に測定した。結果を表２に示す。

これらの結果から、ＲＮＡとＤＮＡの両方について、本発明に従って二相混合物において溶解されたサンプルから得られた核酸の量が、十分確立された標準的な方法を用いて得られた量に匹敵することを理解できる。ＲＮＡの単離に関して、本発明の方法を用いてＮａｎｏｄｒｏｐにおいて光学的に測定された収量は、他の方法と比べて、いくらか少ない。しかしながら、以下のＲＴ−ＰＣＲ実験では、得られたＣｔ値を比較することによって、サンプル中のＲＮＡがより少量であることを確認することはできない。ＤＮＡの単離に関して、本発明の方法は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して光学的に測定されたとき、最高収量をもたらした。

得られたＲＮＡを、製造者のプロトコルに従ったいわゆるナノアッセイにおいてＡｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｅｂｌｉｎｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）においてさらに分析した。表３には、得られたＲＮＡ完全性の数が示されている。

これらの結果は、得られたＲＮＡの量だけでなく質も、当該分野において十分に確立された方法を用いて得られるものと少なくとも匹敵することを示している。

種々の手順を用いて単離されたＲＮＡの量および質をさらに評価するために、標的としてそれぞれｃｊｕｎおよびＭａｄｈ７を用いるＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳｙＢｒ−Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造者の標準的なプロトコルに従って行った。

これらの実験において得られたＣｔ値を表４に示す。

この場合も、本発明に記載の二相脱蝋／溶解手順を用いて得られた結果は、確立された標準的な手順を用いて得られた結果に匹敵する。

同じことが、５μＬのサンプル容積につき２０μｇのＲＮＡという濃度に希釈された溶出液のアリコートを使用する、マイクロＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳ）を製造者の標準的なプロトコルに従って使用したｃＤＮＡ合成についても当てはまる。

ｍｉＲ１６およびｍｉＲ３０ｂに対して得られた結果もまた、標準的な方法を用いて得られた結果に匹敵する（ｍｉＲ＝マイクロＲＮＡ）。

さらなる実験において、上に記載された種々の手順を用いて単離されたＤＮＡの量および質を、製造者の標準的なプロトコルに従ってｐｒｎｐ７８ｂｐを増幅するＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳｙＢｒ−Ｇｒｅｅｎ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ＰＣＲ反応において評価した。結果を表６に示す。

この場合も、本発明の方法を用いて得られた結果は、当該分野において確立された方法を用いて得られた結果に匹敵するか、またはそれよりも良い。

Claims (15)

1. ワックス包埋サンプルから核酸を抽出するための方法であって：
   １．ワックス可溶化剤であって、少なくとも１つの水と不混和性の有機溶媒を含む、ワックス可溶化剤と、該サンプルとを接触させる工程、
   ２．工程１において得られた混合物を必要に応じてインキュベートする工程、
   ３．依然として該ワックス可溶化剤を含む該混合物に水性溶解緩衝液を加える工程、
   ４．工程３において得られた混合物をインキュベートすることにより、少なくとも有機相および水相を含む二相混合物または多相混合物を得る工程であって、該有機相は、溶けたワックスおよび該ワックス可溶化剤を本質的に含み、該水相は、該核酸を含む、工程
   を包含し、ここで、工程１および工程３は、１つの組み合わされた工程としてもまた行われ得る、方法。
2. ５．必要に応じて、前記水相から前記有機相を分離する工程、
   ６．該水相から前記核酸を単離および／または精製する工程
   をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルが、パラフィン包埋サンプル、好ましくは、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル（ＦＦＰＥサンプル）であり、前記ワックス可溶化剤が、少なくとも１つの有機溶媒であって、好ましくは、直鎖状、分枝状および環状のＣ_１０〜Ｃ_１６アルカンまたはその混合物を含む群から選択される、有機溶媒、より好ましくは、Ｃ_１３〜Ｃ_１６アルカンまたはその混合物を含む群から選択される、有機溶媒、最も好ましくは、テトラデカン、ペンタデカンまたはヘキサデカンである、有機溶媒を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 色素／着色料が、前記ワックス可溶化剤中に含められ得る、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 工程２に記載の、前記ワックス可溶化剤と前記ワックス包埋サンプルとの前記混合物をインキュベートする工程が、１５℃から８５℃、好ましくは、２０℃から５５℃、より好ましくは、室温から３５℃の範囲内の温度、最も好ましくは、室温において、好ましくは、１秒から３時間、より好ましくは、１０秒から１時間、さらにより好ましくは、２０秒から３０分間、最も好ましくは、３０秒から１５分間行われる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記溶解緩衝液が、好ましくは、Ｔｒｉｐｓ、Ｍｏｐｓ、Ｍｅｓ、Ｈｅｐｅｓ、リン酸塩、ホウ酸塩および炭酸塩を含む群から選択される緩衝剤、ならびに、好ましくは、陰イオン洗浄剤および両性イオン洗浄剤を含む群から選択される洗浄剤を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 前記溶解緩衝液が、キレート剤、還元剤、無機塩、ｐＨ指示薬および安定剤を含む群から選択される１つ以上の物質をさらに含み、かつ、好ましくは、４から１１、好ましくは、７から１０、最も好ましくは、８から９の範囲内のｐＨを有する、請求項６に記載の方法。
8. 前記溶解緩衝液のほかに、タンパク分解剤が、工程３において前記混合物に加えられるか、またはタンパク分解剤が、工程３において前記サンプルに加えられる前記溶解緩衝液に予め含められており、該タンパク分解剤が、プロテアーゼおよび非酵素的タンパク分解性化合物を含む群から選択され、好ましくは、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロナーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、ブロモシアン、組換えＢａｃｉｌｌｕｓプロテアーゼ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅまたはそれらの混合物である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 工程４に記載の、前記サンプルに前記水性溶解緩衝液を加えた後に得られる前記混合物をインキュベートする工程が、１５℃から９５℃、好ましくは、２０℃から７０℃、最も好ましくは、３７℃から６５℃の範囲内の温度において、好ましくは、３０秒から２４時間、より好ましくは、５０秒から１２時間、さらにより好ましくは、５０秒から５時間、最も好ましくは、１分から２時間行われる、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
10. 工程６に記載の、前記水相に含まれる前記核酸を単離および／または精製する工程が、少なくともクロマトグラフィーおよび／または固相ベースの方法、好ましくは、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびカオトロープ非含有親和性結合を含む群から選択される方法を用いて行われる、請求項２から９のいずれかに記載の方法。
11. 前記溶解緩衝液が、陰イオン界面活性物質イオンを含み、該イオンが、工程４に記載のインキュベートの後に、好ましくは、Ｒｂ^＋、Ｃｓ^＋、Ｃａ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｂａ^２＋またはそれらの混合物を含む群から選択されるアルカリ金属の一価イオンおよび／またはアルカリ土類金属の二価イオンを用いた沈殿によって前記サンプルから本質的に除去され、その後、好ましくは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、前記水相から前記核酸が単離および／または精製される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記核酸が、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む群から選択され、好ましくは、ＤＮＡ、より好ましくは、少なくとも１００ｂｐの長さを有するＤＮＡである、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 直鎖状、分枝状および環状のＣ_１０〜Ｃ_１６アルカンまたはその混合物を含む群から選択される溶媒、より好ましくは、Ｃ_１３〜Ｃ_１６アルカンまたはその混合物を含む群から選択される溶媒、最も好ましくは、ヘキサデカンである溶媒の、架橋ワックス包埋サンプル、好ましくは、ＦＦＰＥサンプルから核酸を抽出、単離および／または精製するための方法においてワックス包埋サンプルからワックスを除去するための使用であって、ここで、該サンプル中の架橋を溶解する工程は、１つ以上の該溶媒と水性溶解緩衝液との二相混合物または多相混合物において行われる、使用。
14. 請求項１から１２のいずれかに記載の方法に従ってワックス包埋サンプルから核酸を抽出、単離および／または精製するためのキットであって、
    （１）ワックス可溶化剤、好ましくは、請求項３に記載のワックス可溶化剤、および必要に応じて
    （２）工程３に記載の二相系または多相系において溶解を行うための指示書
    を備える、キット。
15. （３）水性溶解緩衝液、好ましくは、請求項７または８に記載の溶解緩衝液、
    （４）タンパク分解剤、好ましくは、請求項８に記載のタンパク分解剤、ならびに
    （５）クロマトグラフィー用および／または親和性結合用の固相
    を含む群から選択される１つ以上の追加の構成要素をさらに備える、請求項１４に記載のキット。

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