JP2013528786A - 核酸を単離および精製するためのクロマトグラフィーデバイスおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
材料および一般実験手順
ゲル濾過媒体をGE−Healthcare(Freiburg,Germany)から得、イオン交換媒体をMerck KgaA(Darmstadt,Germany)から得た。
本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「method for isolating and purifying nucleic acids」、および本願と同じ出願日を有する同じ出願人の、表題「method for precipitating anionic surfactant ions in the presence of nucleic acids」を有する同時係属中の出願は、界面活性剤イオンの供給源を含む新しい溶解バッファー、ならびに例えば、ストロンチウムイオンを加えることによって、ドデシル硫酸イオンのようなイオンおよびDNAを含む溶液から界面活性剤イオンを選択的に沈殿させる方法を記載する。上記溶解産物からのこれらの沈殿物の除去を最適化するために、TRISおよびSDSを、両方が25mmol/Lの濃度で含み、H2SO4の添加によってpH8.5に調整した溶解バッファー中で、上記サンプルを62℃で40分間インキュベートすることによって、10mgの組織の溶解から得られた溶解産物に、異なる量の0.5MのSrCl2水性溶液(それぞれ25μLおよび50μL)を加えた。沈殿溶液を加えた後、その混合物を室温または氷浴(約0℃)で10分間インキュベートした。形成された沈殿物を、次にそれぞれ、遠心分離によってか、または600μLのGE−Healthcare S1000 SFマトリックス(GE−Healthcare,Freiburg,Germany)で充填された短いゲル濾過カラム上での濾過によって除去した。
実施例1により、SrCl2溶液の添加後に形成される沈殿物の除去において、濾過がシンプルな遠心分離よりも有効であることが明らかになった。従って、ゲル濾過クロマトグラフィーに必要なマトリックスの最小限の量を、GE−Healthcare S1000 SFマトリックスを用いて決定した。結果を他の濾過方法、特にQIAshredderカラム(QIAGEN,Hilden,Germany)、シリカフリット(Mat.No:1016844,QIAGEN,Hilden,Germany)、シリカ粒子のベッド(QiaExII,QIAGEN,Hilden,Germany)を通した濾過、MiniSartフィルター(Satorius,Goettingen,Germany)の0.2μm膜を通した滅菌濾過、および市販のG25スピンカラム(GE−Healthcare)と比較した。
精製プロセスにおけるタンパク質除去の程度を評価するため、およびゲル濾過クロマトグラフィー後に得られる上記溶出液に存在するタンパク質の残留量を決定するために、S400 HR樹脂を用いて実施例2に従って精製されたサンプルを、SDSを含む市販のTRIS/HEPES4〜20%勾配ポリアクリルアミドゲル(LTF−LABORTECHNIK)において、PAGE分析によって分析した。上記ゲルを、NOVEX XCell IIシステム(Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany)を用いて、供給されたTRIS/HEPESバッファーにおいて、100ボルトで25分間泳動した。上記ゲルとともに提供された15μLの2×バッファーで、タンパク質サイズマーカーをスパイクした上記サンプル15μLを希釈した。その混合物を95℃まで5分間加熱し、次に氷浴において冷却し、その後、上記ゲルのポケットに載せた。上記ゲルを、Gradipure染料(Gradipore,Sydney,Australia)に浸すことによって一晩染色し、次に水ですすいだ。結果を図5に表す。「L」と名付けられたレーンは、Invitrogen(Karlsruhe,Germany)からのSeaBlueタンパク質標準である。レーン1において、上に記載される溶解バッファーを用いて10mgのブタ肝臓組織から得られた15μLの粗製溶解産物を分析した。レーン2において、15μLの同じ溶解産物を、上に記載される沈殿溶液の添加後に分析した(濾過ステップなしで)。比較として、レーン3において、QIAamp Kitを用いて得られ、15μLのRnアーゼAでさらに処理された15μLの溶解産物を分析した。レーン4において、RNアーゼを加えずにQIAampキットを用いて得られた15μLの溶解産物を分析した。比較として、QIAGENプロテアーゼおよびRNアーゼAを、それぞれレーン5および6において分析した。レーン7〜9のそれぞれにおいて、本発明に従うゲル濾過クロマトグラフィーによる精製後に得られた、上記溶出液のアリコート20μLを分析した(全体で100μLの溶出液を得た)。レーン10および11において、QIAampキットを用いることによって得られた、上記溶出液のアリコート20μLを分析した(全体で400μLの溶出液を得た)。多くの量のタンパク質が、塩化ストロンチウムの添加によって、すでにSDSと一緒に同時沈殿することが分かり得る。タンパク質の残りの量は、本発明に従うゲル濾過クロマトグラフィーによって効率的に除去され得、本発明の方法を用いて得られる結果は、特にQIAampキットから得られる溶出液の希釈度が4倍高いことを念頭に置くと、市販のQIAampキットを用いて得られる結果と同等である。肺のサンプルおよびマウスの尾から得られる結果は同等である(データを示さず)。
微量の残留夾雑物質(例えば、タンパク質およびRNAフラグメント)を検出するために、陰イオン交換(AEX)HPLC分析を、TMAE−Fractogel S HPLCカラムにおいて、pH7.2、1.5mL/分の流量で、CaCl2勾配を用いて行った。35容のカラム体積にわたって、5%のTRIS(pH7.2)を含む、水中0mmol/L CaCl2〜300mmol/L CaCl2の範囲に及ぶ勾配を確立した。注入体積として200μLを使用した。
10mgのブタ肝臓の12サンプルを、ゲル濾過ステップにおいて溶離剤として水を用いて本発明の方法に従って溶解および精製し、同じ溶離剤を用いQIAampカラムを用いて精製した10mgのブタ肝臓の6サンプルと比較した。結果を図8に示し、それはHPLC分析によって得られた結果を支持する。gDNAがその最大の吸光度を有する、260nmの波長での吸光度は、本発明に従う方法によって精製される上記サンプルにおいて、QIAampで精製したサンプルにおけるものよりも常に高かった。さらに、ベースラインは、本発明に従って精製された上記サンプルのスペクトルにおけるベースラインと比較して、上記QIAampで精製したサンプルのスペクトルにおいて上昇し、そのことは、上記QIAampで精製したサンプルにおいて、より多量の残留固体粒子を示し得る。
本発明に従って精製された上記サンプルにおいて、PCRインヒビターが全く存在しないことを確実にするために、ラットの尾のサンプル20mgを、上に記載されるように溶解し、上に詳細されるように本発明の方法に従って精製した。これらの精製したサンプルを次に、Rotorgeneシステム(Corbett,Sydney,Australia)におけるjun−システムを用いて、リアルタイムPCR(RT−PCR)において分析し、AEXクロマトグラフィーを用いて、gDNAを用いて得られた結果と比較した。20×jun PCRプライマー/プローブ混合物を含む市販のプライマー/プローブシステム(FAM−TAMRA,Applied Biosystems,Darmstadt,Germany)を、Applied Biosystemsからの2×TAQman PCRユニバーサルマスター混合物と組み合わせて使用した。RT−PCRを製造者の指示に従って実施した。特に、ポリメラーゼ活性化を、混合物を20分間、95℃まで加熱することによって実施し、サイクルを95℃で15秒間、二重鎖を融解することによって実施し、アニーリングを60℃で60秒間実施した。全体で、40サイクルを行った。その反応混合物は、22.5μLのgDNA含有サンプル、25μLの上記マスター混合物、および2.5μLの上記プライマー混合物からなった。本発明に従って精製されたサンプルを、PCRにおける鋳型として、希釈していない形態で、および水での希釈(係数10、100および1000)後に使用した。上記サンプルにおける高濃度のgDNAに起因して、希釈していないサンプル(図9における曲線1)は、幾分強い生成物阻害を示したが、希釈係数に関わらず、本発明の方法によって精製された全サンプルの配列を増幅することは可能であった。水で10倍希釈した上記サンプル(曲線2)は、弱い阻害のみを示した。増幅前に100倍、または1000倍に希釈した上記サンプルにおいて、それぞれ阻害を観測しなかった(曲線3および4)。比較として、標的の存在なしで反応がまた行われ(標的反応なし、NTC)、AEXクロマトグラフィーによって精製された3つのサンプルを、同じ条件下でも増幅した。
表2に列挙される異なる組織のサンプルを、上に記載されるように溶解し、ストロンチウムイオンを加えることによって上記溶解産物からSDSを沈殿させるか、または上記サンプルをQIAampプロトコルに従って溶解した。溶解(および適用可能な場合、ドデシル硫酸イオンの沈殿)後、同じ精製方法によって同じ種類の組織から得られた上記サンプルをプールし、次に100μLのアリコートに分けた。これらのアリコートを、本発明の方法に従って、またはQIAampプロトコルに従って、それぞれ精製した。上記サンプルに存在するgDNAの量を、UV/Vis分光法および/またはHPLC分析によって分析した。得られた平均結果を表2に示す。
血液サンプルの高い液体含有量に起因して、50mmol/LのTRISおよび50mmol/LのSDSを含み、H2SO4の添加によってpH8.5に調整した2倍濃縮溶解バッファー(2×)を、細胞の溶解のために使用した。同じドナーからのヒト血液40μLの2つのサンプルを、等量の2×溶解バッファーと混合した。血液タンパク質を次に10μLのQIAGENプロテアーゼ(2.5AU/ml)の添加によって枯渇させた。上記サンプルを62℃で10分間インキュベートした。SDSを、上に記載されるように沈殿によって上記溶解産物から除去し、上記サンプルを、本発明のスピンカラムを用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。5μLおよび10μLのアリコートを次に、アガロースゲルにおいて分析した(図11)。gDNAバンドは、分析された全てのサンプルにおいて現われたが、より短いフラグメントは、検出できなかった。
上に記載されるように溶解され、本発明の方法を用いて精製された、または市販のDNeasyキット(QIAGEN,Hilden,Germany)を用いるDNeasyプロトコルに従って、ラットの肝臓、腎臓、および脾臓の組織から得られた、精製gDNA 50ng(UV/Vis分光法によって見積もられた通り)を、RT−PCRの標的として使用した。新鮮組織サンプルおよび凍結組織サンプル、および市販のRNAlater試薬(QIAGEN,Hilden,Germany)において安定化されたサンプルを使用した。上記サンプルを次に、TAQmanシステムにおけるSYBR−GreenベースのRT−PCR反応において分析した。図12において分かり得るように、RT−PCR反応において得られたCT値は、分析されたサンプルの種類に関わらず、両方の方法について同等である(それぞれ新鮮、凍結、およびRNAlaterにおいて安定化)。10mmol/LのTRIS/HClおよび0.5mmol/LのEDTAを含み、pH9.0に調整したバッファーAEを、上に記載される手順に従って、上記スピンカラムを平衡化するために、および溶離剤として、使用した。
それぞれ20mgのラットの肝臓組織および脾臓組織を、上に記載されるように溶解し、本発明に従って精製した。溶解は30分以内に完了した。各実験を二重で実施した。得られた溶解産物におけるgDNAの質を、PCR反応において、およびエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルにおいて分析した(図13)。上記ゲルは過負荷されたにも関わらず、それは高分子量のgDNAバンドをはっきりと示す。上記サンプルの、260nmの波長での吸光度 対 280nmの波長での吸光度の比によって見積もられた、上記サンプルに存在するgDNAの量、ならびに純度を表3に表す。反応条件は最終的に最適化されなかったが、良好な純度の多量のgDNAを得た。
凍結ラット肝臓組織のサンプル10mgを、それぞれ上に記載されるように溶解した。沈殿剤の添加後、上記サンプルを、それぞれ水およびバッファーAEにおいて平衡化した、本発明のカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。さらに、数個のサンプルを2倍濃縮溶解バッファーに溶解し、バッファーAEにおいて平衡化した、本発明のスピンカラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。得られた溶出液をゲル電気泳動によって分析し、gDNAの量、およびSDS、ならびに上記溶出液の伝導度を決定した。SDSは、2つのサンプルにおいてのみ検出された。結果を図14に表す。
ラット肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックからの10μmの厚さのサンプルを溶解し、gDNAを単離し、そしてa)市販のQIAampキット(QIAGEN,Hilden,Germany)、およびb)本発明に従う方法およびデバイスを用いて精製した。
Claims (14)
- 好ましくはDNA、特にゲノムDNAを含む核酸を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、夾雑物質から単離および精製するためのクロマトグラフィーデバイスであって、該デバイスは、少なくとも1つのクロマトグラフィーユニットを含み、該ユニットは、
1.入り口(2)および出口(3)を有する中空本体(1)であって、好ましくはゲルベッドを形成する、固体マトリックス(4)を含む、中空本体(1)、
2.好ましくは任意のサイズの核酸が通るのを可能にし、該固体マトリックス(4)を該クロマトグラフィーユニット内に保持するように、該出口(3)と該固体マトリックス(4)との間に置かれる有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜(5)、
3.好ましくは非有孔の環(6)であって、該有孔のフリット、フィルター、フリース、または膜(5)と該マトリックス(4)との間に置かれて、該フリット、フィルター、フリース、または膜(5)の外側領域を塞いで、移動相が該マトリックス(4)を通ることなく該フリット(5)に入ることを防ぐ、非有孔の環(6)、
4.必要に応じて、該クロマトグラフィーユニットの該入り口(2)および/または出口(3)を塞ぐための少なくとも1つの取り外し可能な閉鎖デバイス(7)、および
5.必要に応じて、該マトリックス(4)を通過後の該移動相(溶出液)を収集するための少なくとも1つの収集管を含み、
ここで該固体マトリックスは、150bp〜500bp、好ましくは200bp〜400bp、および最も好ましくは250bp〜300bpのサイズ排除限界を有するゲル形成ポリマーである、
デバイス。 - 前記ゲル形成ポリマーが、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、またはそれらの混合物の群から選択され、好ましくは、デキストランとポリアクリルアミドとの混合物である、請求項1に記載のデバイス。
- 前記取り外し可能な閉鎖デバイスが、ふた用ホイル、シール、およびブレークアウェイ末端を含む群から選択される使い捨ての閉鎖デバイス、またはスクリューキャップ、およびスナップオンキャップを含む群から選択される再閉鎖可能な閉鎖デバイスである、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記クロマトグラフィーユニットの前記入り口および前記出口は、取り外し可能な閉鎖デバイスで塞がれ、前記固体マトリックスは、水、有機溶媒と水との均一混合物、または水性バッファーを含む群から選択される溶媒中で前もって膨張させた、ゲルの形態で供給され、ここで該溶媒は、使用直前に該クロマトグラフィーユニットからパージされ、遠心分離によって該マトリックス(ベッド)が確立される(前もって回転させるステップ)、請求項1〜3のいずれかに記載のデバイス。
- 好ましくはマルチウェルプレートの形態での、並行様式の複数のクロマトグラフィーユニットを含み、ここで該マルチウェルプレートの各ウェルは、1つの別個のクロマトグラフィーユニットを含む、請求項1〜4のいずれかに記載のデバイス。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のデバイスを用いる、ゲル濾過クロマトグラフィーによって、好ましくはDNA、特にゲノムDNAを含む核酸を精製するための方法であって、該方法は、
1.精製されるべき核酸を含むサンプルを提供するステップであって、ここで該サンプルは、溶液の形態、または液体溶離剤、好ましくは水性溶離剤中の懸濁物の形態である、ステップ、
2.該クロマトグラフィーユニット中のマトリックスを、好ましくは遠心分離によって確立するステップ(前もって回転させるステップ)、
3.該サンプルを、該マトリックスの上部表面にのせるステップ、
4.好ましくは、遠心分離によって該クロマトグラフィーユニットから該核酸を溶出し、同時に溶出液を収集するステップ、
を含む、方法。 - 前記サンプルが、新鮮および凍結された組織、血液、他の体液、およびグラム陰性細菌からなる群から選択される、生物学的サンプルから、好ましくは、細胞含有生物学的サンプルから得られる溶解産物である、請求項6に記載の方法。
- 前記前もって回転させるステップが、500〜900×gで1分間〜7分間、好ましくは700×gで2分間〜5分間、および最も好ましくは700×gで3分間、前記デバイスを遠心分離することによって実施される、請求項6または7に記載の方法。
- 1つのクロマトグラフィーユニット当たりのマトリックスベッドの体積が、100μL〜2mLの範囲、好ましくは500μL〜1mLの範囲、および最も好ましくは800μLである、請求項6〜8のいずれかに記載の方法。
- 600μL〜800μLのマトリックスベッド当たりの前記サンプル体積が、10μL〜100μLの範囲にある、請求項6〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーユニットから前記核酸を溶出する前記ステップは、500〜900×gで1分間〜7分間、好ましくは700×gで2分間〜5分間、および最も好ましくは700×gで3分間、前記デバイスを遠心分離することによって実施される、請求項6〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記サンプルが、先行する溶解手順によって得られる細胞含有生物学的サンプルの溶解産物であり、該溶解手順が、
1.該細胞含有サンプルを溶解バッファーと混合するステップ、
2.混合物をインキュベートして、少なくともDNA、RNA、およびタンパク質を含む溶解産物を得るステップ、
3.必要に応じて、該溶解産物に含まれる該RNAを崩壊させるステップ、
4.必要に応じて、DNA以外の溶質を選択的に沈殿させるステップ、
を含む、請求項6〜11のいずれかに記載の方法。 - 核酸、好ましくはゲノムDNAの単離および精製のためのキットであって、該キットは、
1.請求項1〜5のいずれかに記載のデバイス、
ならびに
2.溶解バッファー、
3.アルカリ金属の一価イオンおよび/またはアルカリ土類金属の二価イオンの供給源、および
4.1つまたはそれより多くの標的核酸の直接増幅のためのプライマー
を含む群から選択される、1つまたはそれより多くの成分を含む、
キット。 - ゲノムDNAの単離および精製のための、請求項1〜6のいずれかに記載のクロマトグラフィーデバイスの使用。
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