CN112941148A - 一种核酸引物保存液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸引物保存液的制备方法，其特征在于：保存液以1000mL计，包括如下组分：硫柳汞2‑3份、1MTris‑HCL0.2‑0.4份；0.5M金属螯合剂0.1‑0.3份；酸度调节剂、缓冲液；余量为纯水；将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；向第一步中得到的第一混合物中添加酸碱调节剂，并混合，调节pH值为8.0，再加入硫柳汞，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液；本发明的核酸保存液能够提高核酸在溶液中稳定性，延缓核酸降解，从而能够增长核酸在液体状态的保存周期。同时能够有效避免反复冻溶，减少实验操作步骤，缩短整个实验进程。

Description

一种核酸引物保存液的制备方法

技术领域

本发明属于核酸保存技术领域，涉及一种保存液的制备方法，具体为一种核酸引物保存液的制备方法。

背景技术

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。核酸的性能不稳定，容易变性，因此，在研究过程中，通常将核酸置于超低温(-70℃)下进行长期保存，然而，该保存方式易对核酸的结构造成影响，且研究过程中需要进行反复冻溶。

目前溶解核酸主要是以TE溶液为主，使用超纯水作为溶剂。TE溶剂相对超纯水来说保存周期有一定延长，室温条件下一般在1个月左右就会出现明显降解。通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，三组不同样品分别分装四管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；样品3编号3-A,3-B,3-C；3-D。第一周验证编号A的三组样品，第二周验证编号B的三组样品，第三周验证编号C的三组样品，第四周验证编号D的三组样品。纯度数据如图表所示。(如图2所示)

现有技术中采用了硫柳汞左右稳定剂，最终获得的保存液可在室温下保存核酸，相同条件下保存周期延长至1年。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决核酸的性能不稳定，容易变性，因此，在研究过程中，通常将核酸置于超低温(-70℃)下进行长期保存，然而，该保存方式易对核酸的结构造成影响，且研究过程中需要进行反复冻溶；目前溶解核酸主要是以TE溶液为主，使用超纯水作为溶剂。TE溶剂相对超纯水来说保存周期有一定延长，室温条件下一般在1个月左右就会出现明显降解的问题，而提出一种核酸引物保存液的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种核酸引物保存液的制备方法，保存液以1000mL计，包括如下组分：硫柳汞2-3份、1M Tris-HCL0.2-0.4份；0.5M金属螯合剂0.1-0.3份；酸度调节剂、缓冲液；余量为纯水；

该保存液的制备方法包括以下步骤：

第一步：将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；

第二步：向第一步中得到的第一混合物中添加酸碱调节剂，并混合，调节pH值为8.0，再加入硫柳汞，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。

优选的，所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。

优选的，金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，与二价金属离子结合；二价金属离子为Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺。

优选的，对保存在保存液中的核酸进行检测：通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，包括以下步骤：

将三组不同样品分别分装五管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；1-E；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；2-E；样品3编号为3-A,3-B,3-C；3-D；3-E；第一月验证编号中含有A的三组样品，第四月验证编号中含有B的三组样品，第七月验证编号中含有C的三组样品，第十一月验证编号中含有D的三组样品，第十四月验证编号中含有E的三组样品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过上述技术方案，形成相应的保护液，当外界的温度、压强等因素发生变化时，三羟甲基氨基甲烷与纯水形成的缓冲液，当与碱性试剂反应时可以有效防止核酸析出，可保护被保存的核酸不易受外界因素的影响，进而保持核酸处于较好的状态。乙二胺四乙酸二钠作为一种金属螯合剂，能与Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子结合，从而达到去除保存液中不可避免出现的二价金属离子，进而起到保护核酸免受金属离子影响的作用。当将保存液中的Mg²⁺螯合后，从而有助于抑制多数依靠Mg²⁺作用的核酸酶的生长，进而降低核酸酶对核酸降解的风险，使核酸维持原始的组织结构，在检测核酸的过程中，可使检测结果较为准确。此外三羟甲基氨基甲烷与酸度调节剂同时使用，可起到一定的酸度调节剂作用，使保存液的pH值保持在8.0的范围内。保存液的pH值保持在8.0的范围内，可有效减少核酸水解的可能，使核酸维持原有的组织结构，且对核酸的保存的时间较长，12个月后，对被保存的核酸进行检测时，被保存后的核酸仍然具有12个月之前的组织结构特征。通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，三组不同样品分别分装五管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；1-E；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；2-E；样品3编号为3-A,3-B,3-C；3-D；3-E。第一月验证编号A的三组样品，第四月验证编号B的三组样品，第七月验证编号C的三组样品，第十一月验证编号D的三组样品，第十四月验证编号E的三组样品；纯度数据如图1所示；

本保存液中的组分数量较少，且生产成本较低。为了稳定溶剂环境，避免微生物等影响，在上述试剂中增加保护剂。进一步优选为：所述防腐剂为硫柳汞。通过上述技术方案，硫柳汞具有优异的抑制微生物生长的作用，从而使本申请中的保存液的整体环境维持较为稳定，进而有助于减少微生物等对核酸的降解影响。本发明的目的二在于提供一种核酸保存液的制备方法，使获得的核酸保存液具有均匀、稳定的质地的效果。

为实现上述目的二，本发明提供了如下技术方案：一种核酸保存液的制备方法，包括如下步骤：步骤一，三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与80ml纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；步骤二，向步骤一中获得的第一混合物中加入酸碱调节剂，充分混合，调节pH值为8.0，再加入防腐剂，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。通过上述技术方案，先将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水混合充分，再加入酸碱调节剂进行pH值调节，有助于提高形成的核酸保存液中的各组分混合的均匀性，进而使获得的pH值更为准确。

上述核酸保存液能够提高核酸在溶液中稳定性，延缓核酸降解，从而能够增长核酸在液体状态的保存周期。同时能够有效避免反复冻溶，减少实验操作步骤，缩短整个实验进程。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明中新型溶液的核酸纯度检测表。

图2为本发明以TE溶液为主，使用超纯水作为溶剂的核酸纯度检测表。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1-2所示，一种核酸引物保存液的制备方法，保存液以1000mL计，包括如下组分：硫柳汞2份、1M Tris-HCL0.2份；0.5M金属螯合剂0.1份；酸度调节剂、缓冲液；余量为纯水；

该保存液的制备方法包括以下步骤：

第一步：将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；

第二步：向第一步中得到的第一混合物中添加酸碱调节剂，并混合，调节pH值为8.0，再加入硫柳汞，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。

所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。

金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，与二价金属离子结合；二价金属离子为Mg²⁺、Ca^{2 +}、Mn²⁺、Fe²⁺。

对保存在保存液中的核酸进行检测：通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，包括以下步骤：

将三组不同样品分别分装五管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；1-E；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；2-E；样品3编号为3-A,3-B,3-C；3-D；3-E；第一月验证编号中含有A的三组样品，第四月验证编号中含有B的三组样品，第七月验证编号中含有C的三组样品，第十一月验证编号中含有D的三组样品，第十四月验证编号中含有E的三组样品。

实施例2

一种核酸引物保存液的制备方法，保存液以1000mL计，包括如下组分：硫柳汞2.5份、1M Tris-HCL0.3份；0.5M金属螯合剂0.2份；酸度调节剂、缓冲液；余量为纯水；

该保存液的制备方法包括以下步骤：

第一步：将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；

第二步：向第一步中得到的第一混合物中添加酸碱调节剂，并混合，调节pH值为8.0，再加入硫柳汞，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。

所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。

金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，与二价金属离子结合；二价金属离子为Mg²⁺、Ca^{2 +}、Mn²⁺、Fe²⁺。

对保存在保存液中的核酸进行检测：通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，包括以下步骤：

将三组不同样品分别分装五管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；1-E；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；2-E；样品3编号为3-A,3-B,3-C；3-D；3-E；第一月验证编号中含有A的三组样品，第四月验证编号中含有B的三组样品，第七月验证编号中含有C的三组样品，第十一月验证编号中含有D的三组样品，第十四月验证编号中含有E的三组样品。

实施例3

一种核酸引物保存液的制备方法，保存液以1000mL计，包括如下组分：硫柳汞3份、1M Tris-HCL0.4份；0.5M金属螯合剂0.3份；酸度调节剂、缓冲液；余量为纯水；

该保存液的制备方法包括以下步骤：

第一步：将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；

第二步：向第一步中得到的第一混合物中添加酸碱调节剂，并混合，调节pH值为8.0，再加入硫柳汞，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。

所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。

金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，与二价金属离子结合；二价金属离子为Mg²⁺、Ca^{2 +}、Mn²⁺、Fe²⁺。

对保存在保存液中的核酸进行检测：通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，包括以下步骤：

将三组不同样品分别分装五管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；1-E；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；2-E；样品3编号为3-A,3-B,3-C；3-D；3-E；第一月验证编号中含有A的三组样品，第四月验证编号中含有B的三组样品，第七月验证编号中含有C的三组样品，第十一月验证编号中含有D的三组样品，第十四月验证编号中含有E的三组样品。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (4)

1.一种核酸引物保存液的制备方法，其特征在于：保存液以1000mL计，包括如下组分：硫柳汞2-3份、1M Tris-HCL0.2-0.4份；0.5M金属螯合剂0.1-0.3份；酸度调节剂、缓冲液；余量为纯水；

该保存液的制备方法包括以下步骤：

第一步：将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠与纯水充分混合直至完全溶解，形成第一混合物；

第二步：向第一步中得到的第一混合物中添加酸碱调节剂，并混合，调节pH值为8.0，再加入硫柳汞，最后加入纯水定容至100ml，获得核酸保存液。

2.根据权利要求1所述的一种核酸引物保存液的制备方法，其特征在于，所述酸度调节剂包括冰乙酸、聚丙烯酸中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的一种核酸引物保存液的制备方法，其特征在于，金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，与二价金属离子结合；二价金属离子为Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺。

4.根据权利要求1所述的一种核酸引物保存液的制备方法，其特征在于，对保存在保存液中的核酸进行检测：通过分析型高效液相色谱进行纯度验证实验，包括以下步骤：

将三组不同样品分别分装五管，样品1编号为1-A；1-B；1-C；1-D；1-E；样品2编号为2-A,2-B,2-C；2-D；2-E；样品3编号为3-A,3-B,3-C；3-D；3-E；第一月验证编号中含有A的三组样品，第四月验证编号中含有B的三组样品，第七月验证编号中含有C的三组样品，第十一月验证编号中含有D的三组样品，第十四月验证编号中含有E的三组样品。

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