CN108546646B - 用于基因检测的微生物样本保存液及其制备方法、试剂盒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于基因检测的微生物样本保存液及其制备方法、试剂盒与应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的用于基因检测的微生物样本保存液，更加有效、全面的微生物灭活能力；使用较低浓度的乙醇，在样本存放过程中能够更加彻底灭活细菌，避免高浓度乙醇造成的细菌应激反应而使灭活失败。在不破坏细胞结构的前提下，具有良好的渗透性，有效破坏细菌和病毒的蛋白活性与各类核酸酶活性，使其不再具有感染或增殖能力，灭活效果彻底。使用含有甘油的细胞保护剂和生理浓度缓冲液，能够维持微生物的细胞结构，避免细胞结构破裂，从而保护细胞内核酸的完整；没有高毒性组分或挥发组分，使用过程中不会产生挥发性毒害。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及用于基因检测的微生物样本保存液及其制备方法、试剂盒与应用。
背景技术
目前市场的口腔\粪便细菌保存液都是以乙醇\甲醇\SDS为主要成分，制备成弱碱性的等渗溶液，能够对样本中的细菌进行杀灭，但是会对细胞结构造成破坏，致使细胞内含物释放出来，不能用于免疫或者其他方法的检测。同时，保存液中的甲醇\异硫氰酸胍具有挥发性或较高的毒性，在使用过程中容易造成挥发，对操作人员造成伤害。
现有的保存液使用高纯度的乙醇灭活；部分菌对高浓度乙醇会产生应激反应，导致灭活效果降低；含有保护核酸成分，但是保存液中大量的表面活性剂也会造成细胞破裂，致使核酸等处于暴露环境，易被降解破坏；部分灭活剂的毒性较高，使用过程中操作失误会对使用人员产生毒害。
发明内容
本发明的第一目的在于提供用于基因检测的微生物样本保存液，该保存液具有更有效的微生物灭活能力。
本发明的第二目的在于提供上述的用于基因检测的微生物样本保存液在微生物样本保存中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，通过简单方法制备出大量的，效果良好，性能稳定的保存液。
本发明的第四目的在于提供一种用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒。
本发明的第五目的在于提供上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在微生物样本保存中的应用。
本发明的第六目的在于提供上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在细胞样本保存中的应用。
本发明的第七目的在于提供上的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在细菌灭菌中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
用于基因检测的微生物样本保存液，按照重量份计，微生物样本保存液包括乙二胺四乙酸二钠8.2-13.4份、盐酸胍2.7-4.3、NaCl2.5-4.4份和Tris·HCl0.8-1.5份；按照体积份数计，还包括DMSO17-26份，甘油0.7-1.5份，其中每重量份固体对应每体积份的液体。
上述的用于基因检测的微生物样本保存液在微生物样本保存中的应用。
一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，按重量份计，取乙二胺四乙酸二钠8.2-13.4份、盐酸胍2.7-4.3份、NaCl2.5-4.4份和Tris·HCl0.8-1.5份；按体积份计，取DMSO17-26份，甘油0.7-1.5份，每份固体物质对应每份液体物质，将乙二胺四乙酸二钠、NaCl、Tris·HCl、DMSO和甘油混合，与45-55体积份的乙醇混合，用水定容至100体积份，调整pH。
一种用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒，试剂盒包括上述的用于基因检测的微生物样本保存液。
上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在微生物样本保存中的应用。
上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在细胞样本保存中的应用。
上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在细菌灭菌中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的用于基因检测的微生物样本保存液，更加有效、全面的微生物灭活能力；使用较低浓度的乙醇，在样本存放过程中能够更加彻底灭活细菌，避免高浓度乙醇造成的细菌应激反应而使灭活失败。在不破坏细胞结构的前提下，具有良好的渗透性，有效破坏细菌和病毒的蛋白活性与各类核酸酶活性，使其不再具有感染或增殖能力，灭活效果彻底。使用含有甘油的细胞保护剂和生理浓度缓冲液，能够维持微生物的细胞结构，避免细胞结构破裂，从而保护细胞内核酸的完整；没有高毒性组分或挥发组分，使用过程中不会产生挥发性毒害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的样本DGGE检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的用于基因检测的微生物样本保存液及其制备方法、试剂盒与应用进行具体说明。
用于基因检测的微生物样本保存液，按照重量份计，微生物样本保存液包括乙二胺四乙酸二钠8.2-13.4份、盐酸胍2.7-4.3份、NaCl2.5-4.4份和Tris·HCl0.8-1.5份；按照体积份数计，还包括DMSO17-26份，甘油0.7-1.5份，其中每重量份固体对应每体积份的液体。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，微生物样本保存液包括乙二胺四乙酸二钠9.1-12.5份、盐酸胍3.2-4.1份、NaCl2.7-3.7份和Tris·HCl1.0-1.3份；按照体积份数计，还包括DMSO20-24份，甘油0.9-1.3份，其中每重量份固体对应每体积份的液体。
上述的用于基因检测的微生物样本保存液在微生物样本保存中的应用。
一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，按重量份计，取乙二胺四乙酸二钠8.2-13.4份、盐酸胍2.7-4.3份、NaCl2.5-4.4份和Tris·HCl0.8-1.5份；按体积份计，取DMSO17-26份，甘油0.7-1.5份，每份固体物质对应每份液体物质，将乙二胺四乙酸二钠、NaCl、Tris·HCl、DMSO和甘油混合，与45-55体积份的乙醇混合，用水定容至100体积份，调整pH。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，乙醇为无水乙醇，水为双蒸去离子水。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，调整pH为7.3-7.5。
一种用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒，试剂盒包括上述的用于基因检测的微生物样本保存液。
上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在微生物样本保存中的应用。
上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在细胞样本保存中的应用。
上述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在细菌灭菌中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供用于基因检测的微生物样本保存液，微生物样本保存液包括DMSO17mL、甘油0.7mL、乙二胺四乙酸二钠8.2g、NaCl2.5g、盐酸胍、盐酸胍2.7g和Tris·HCl0.8g。
本实施例还提供一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
1.1量取DMSO20mL和甘油0.7mL，称取乙二胺四乙酸二钠8.2g、NaCl2.5g、盐酸胍、盐酸胍2.7g和Tris·HCl0.8g，并在烧杯中混合；
1.2向烧杯中加入无水乙醇45mL溶解；
1.3用双蒸去离子水定容至100mL；
1.4混匀后，用盐酸调节pH值到7.3。
制得用于基因检测的微生物样本保存液，因此可以将微生物样本保存液用于微生物样本保存。
也可以将微生物样本保存液制备成用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒。
可以将微生物样本保存的试剂盒用于微生物样本保存和细胞样本保存；还可以应用到细菌灭菌中。
实施例2
本实施例提供用于基因检测的微生物样本保存液，微生物样本保存液包括DMSO20mL、甘油0.9mL、盐酸胍3.2g、乙二胺四乙酸二钠9.1g、NaCl2.7g和Tris·HCl1.0g。
本实施例还提供一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
1.1量取DMSO20mL和甘油0.9mL，称取乙二胺四乙酸二钠9.1g、NaCl2.7g、盐酸胍、盐酸胍3.2g和Tris·HCl1.0g，并在烧杯中混合；
1.2向烧杯中加入无水乙醇50mL溶解；
1.3用双蒸去离子水定容至100mL；
1.4混匀后，用盐酸调节pH值到7.4。
制得用于基因检测的微生物样本保存液，因此可以将微生物样本保存液用于微生物样本保存。
也可以将微生物样本保存液制备成用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒。
可以将微生物样本保存的试剂盒用于微生物样本保存和细胞样本保存；还可以应用到细菌灭菌中。
实施例3
本实施例提供用于基因检测的微生物样本保存液，微生物样本保存液包括DMSO24mL、甘油1.3mL、乙二胺四乙酸二钠12.5g、NaCl3.7g、盐酸胍4.1g和Tris·HCl1.3g。
本实施例还提供一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
1.1量取DMSO24mL和甘油1.3mL，称取乙二胺四乙酸二钠12.5g、NaCl3.7g、盐酸胍、盐酸胍4.1g和Tris·HCl1.3g，并在烧杯中混合；
1.2向烧杯中加入无水乙醇52mL溶解；
1.3用双蒸去离子水定容至100mL；
1.4混匀后，用盐酸调节pH值到7.5。
制得用于基因检测的微生物样本保存液，因此可以将微生物样本保存液用于微生物样本保存。
也可以将微生物样本保存液制备成用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒。
可以将微生物样本保存的试剂盒用于微生物样本保存和细胞样本保存；还可以应用到细菌灭菌中。
实施例4
本实施例提供用于基因检测的微生物样本保存液，微生物样本保存液包括DMSO26mL、甘油1.5mL、盐酸胍4.3g、乙二胺四乙酸二钠13.4g、NaCl4.4g和Tris·HCl1.3g。
本实施例还提供一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
1.1量取DMSO26mL和甘油1.5mL，称取乙二胺四乙酸二钠13.4g、NaCl4.4g、盐酸胍、盐酸胍4.3g和Tris·HCl1.5g，并在烧杯中混合；
1.2向烧杯中加入无水乙醇55mL溶解；
1.3用双蒸去离子水定容至100mL；
1.4混匀后，用盐酸调节pH值到7.5。
制得用于基因检测的微生物样本保存液，因此可以将微生物样本保存液用于微生物样本保存。
也可以将微生物样本保存液制备成用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒。
可以将微生物样本保存的试剂盒用于微生物样本保存和细胞样本保存；还可以应用到细菌灭菌中。
实验例1
本实验例利用实施例2提供的用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法制备得到微生物样本保存液记性保存效果的检验。
对粪便、口腔微生物样本使用保存液进行保存后，室温下存放24h以内以及1d、7d、30d后，进行丰度检测、PCR与测序验证。
丰度检测采用三个患者的粪便样本(样本1、样本2和样本3)使用本发明的保存液保存不同时长后，进行检测，丰度检测结果如表1所示。
表1离体样本丰度检测
从表1中可以明显看出，使用了本发明实施例提供的微生物样本保存液丰度没有明显降低，效果明显。
用样本1进行和使用2种普通保存液保存的样本(普1和普2)保存不同时间后，进行PCR扩增和测序验证和16sDNA V3区的DGGE指纹图谱分析。结果如表2所示。
表2不同保存时间的样本Dice系数
表2中，均以0h的样本为参考值100％，可以看出，随着保存时间的延长，普1和普2样本的相似度降低明显，而选用本发明的保存液相似度降低明显高于普1和普2样本，可以看出本发明的微生物样本保存液的保持效果明显。
DGGE的结果如图1所示，使用本发明的保存液(S1)的样品保持效果较好。
综上所述，本发明提供的用于基因检测的微生物样本保存液保持效果较好，能较好的保证样本保存较长时间后依然有效，保真效果较好。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (7)
1.用于基因检测的微生物样本保存液，其特征在于，按照重量份计，所述微生物样本保存液仅含如下成分：乙二胺四乙酸二钠9.1 g/100mL、盐酸胍3.2 g/100mL、NaCl 2.7 g/100mL和Tris·HCl 1.0 g/100mL；按照体积份数计，还含有DMSO 20 mL/100mL，甘油0.9mL/100mL，50 mL/100mL的乙醇，其余为水。
2.如权利要求1所述的用于基因检测的微生物样本保存液在微生物样本保存中的应用。
3.一种用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，其特征在于，按重量份计，取乙二胺四乙酸二钠9.1份、盐酸胍3.2份、NaCl 2.7份和Tris·HCl 1.0份；所述重量份为g；按体积份计，取DMSO 20份，甘油0.9份，每份固体物质对应每份液体物质，将所述乙二胺四乙酸二钠、所述盐酸胍、所述NaCl、所述Tris·HCl、所述DMSO和所述甘油混合，与50体积份的乙醇混合，用水定容至100体积份，所述体积份为mL，调整pH。
4.根据权利要求3所述的用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，其特征在于，所述乙醇为无水乙醇、所述水为双蒸去离子水。
5.根据权利要求3所述的用于基因检测的微生物样本保存液的制备方法，其特征在于，调整所述pH为7.3-7.5。
6.一种用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的用于基因检测的微生物样本保存液。
7.如权利要求6所述的用于基因检测的微生物样本保存的试剂盒在微生物样本保存中的应用。
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