CN117858940A - 细胞含有液用保存液和细胞含有液用保存容器 - Google Patents

细胞含有液用保存液和细胞含有液用保存容器 Download PDF

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Abstract

本发明提供在将细胞含有液与保存液的混合液冷藏保存的情况下能够抑制基因组DNA向细胞外漏出的细胞含有液用保存液。本发明的细胞含有液用保存液包含甲醛供体化合物(A)和作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B)，所述细胞含有液用保存液的电导率为3ms/cm以上且20ms/cm以下。

Description

细胞含有液用保存液和细胞含有液用保存容器
技术领域
本发明涉及用于保存细胞含有液的保存液。此外，本发明涉及具备所述保存液的细胞含有液用保存容器。
背景技术
血液、血浆、血清以及尿等体液中包含游离DNA(cell free DNA，cfDN A)。已知，与健康人相比，在具有恶性肿瘤的人以及罹患了传染病的人等的体液中，cfDNA以高浓度存在。
近年，在癌和基因疾病等领域中，正在进行以cfDNA为检体的检查等。以cfDNA为检体的检查与从患者处采集病变组织而进行的检查相比，对患者的负担更小。
此外，在母体血中包含来源于胎儿的游离DNA(cell free fetal DNA，cff DNA)。在出生前遗传学的检查中，也会进行以cffDNA为检体的检查。
以cfDNA为检体的检查如果不是拥有qPCR装置或下一代测序器(Next GenerationSequencer，NGS)等专用装置的专门机关的话是很难实施的。因此，在病院等处采集得到的血液等细胞含有液需要运送到专门机关处，从细胞含有液的采集到分析，需要一定程度的天数。该期间，所述细胞含有液用特定的容器保存。
在下述的专利文献1、2中，记载了通过使存在于全血中的细胞，特别是白细胞稳定化，而稳定地回收cfDNA的方法。
此外，在下述的专利文献3中，公开了一种不包含血清，含有选自羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羟乙基甲基纤维素中的至少一种水溶性纤维素类冻结保护物质作为冻结保护物质的动物细胞的玻璃化冻结保存液。在专利文献3中，记载了所述玻璃化冻结保存液优选包含特定的细胞膜透过性冻结保护物质或特定的细胞膜非透过性冻结保护物质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2013/123030A1
专利文献2：CN107083382A
专利文献3：日本特开2011-111406号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
现在，以血液等细胞含有液中包含的cfDNA为检体的检查正在被使用。血液等细胞含有液被采集至容纳有保存液的保存容器后，被运送至具有qPCR装置或下一代测序器的专门机关处。送至专门机关途中的输送也有在冻结环境下进行的，但从抑制输送成本的观点以及减少输送中的麻烦的观点出发，优选在冷藏环境下进行。
然而，在专利文献1～专利文献3所记载的现有方法中，当细胞含有液在冷藏环境下保存时，基因组DNA(gDNA)有时会从细胞漏出。例如，在以往的容纳有保存液的保存容器中，在细胞含有液在冷藏环境下保存的情况下，该细胞含有液中所含的细胞发生破坏或死亡，基因组DNA有时会从该细胞漏出。
在以cfDNA为检体的检查中，若基因组DNA向细胞外漏出，则对检查结果造成很大影响。
本发明的目的在于提供在将细胞含有液与保存液的混合液冷藏保存的情况下能够抑制基因组DNA向细胞外漏出的细胞含有液用保存液。此外，本发明的目的还在于提供具备所述细胞含有液用保存液的细胞含有液用保存容器。
解决技术问题的手段
根据本发明的广泛方面，提供一种细胞含有液用保存液(以下，有时简称为“保存液”)，其包含甲醛供体化合物(A)和作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B)，所述细胞含有液用保存液的电导率为3ms/cm以上且20ms/cm以下。
在本发明的保存液的某特定方面，所述保存液包含分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)。
在本发明的保存液的某特定方面，所述细胞膜透过性化合物(C)为多元醇。
在本发明的保存液的某特定方面，所述细胞膜透过性化合物(C)为乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇或丁二醇。
在本发明的保存液的某特定方面，所述保存液包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)。
在本发明的保存液的某特定方面，所述细胞膜非透过性化合物(D)的分子量为1000以上。
在本发明的保存液的某特定方面，所述细胞膜非透过性化合物(D)为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇或Ficol l。
在本发明的保存液的某特定方面，所述甲醛供体化合物(A)为DMDM乙内酰脲或1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲。
在本发明的保存液的某特定方面，所述化合物(B)为柠檬酸、柠檬酸盐或氯化钠。
在本发明的保存液的某特定方面，所述细胞含有液为血液。
根据本发明的广泛方面，提供一种细胞含有液用保存容器，其为采集给定量的细胞含有液的细胞含有液用保存容器，其中，所述细胞含有液用保存容器具备容器主体和容纳于所述容器主体内的保存液，所述保存液为所述的细胞含有液用保存液。
在本发明的细胞含有液用保存容器的某特定方面，所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成P。
构成P：得到相对于生理盐水1L混合有次氯酸钠7.4g的溶液Pa，将与待采集至细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述溶液Pa采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该溶液Pa与所述保存液混合而成的混合液P时，在所述混合液P中，甲醛的含量为100mg/L以上且400mg/L以下。
在本发明的细胞含有液用保存容器的某特定方面，所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成Q。
构成Q：将与待采集至细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的生理盐水采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该生理盐水与所述保存液混合而成的混合液Q时，所述混合液Q的渗透压为300mOsm/L以上且1100mOsm/L以下。
在本发明的细胞含有液用保存容器的某特定方面，所述保存液包含分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)，所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成R。
构成R：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液R时，在所述混合液R中，所述细胞膜透过性化合物(C)的含量为1vol％以上且5vol％以下。
在本发明的细胞含有液用保存容器的某特定方面，所述保存液包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)，所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成S。
构成S：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液S时，在所述混合液S中，所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量为0.5μmol/L以上且5μmol/L以下。
发明效果
本发明的细胞含有液用保存液包含甲醛供体化合物(A)和作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B)，所述细胞含有液用保存液的电导率为3ms/cm以上且20ms/cm以下。在本发明的细胞含有液用保存液中，由于具备所述的构成，因此在冷藏保存细胞含有液与保存液的混合液的情况下，能够抑制基因组DNA向细胞外的漏出。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明的细胞含有液用保存液(以下，有时简称为“保存液”)包含甲醛供体化合物(A)和作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B)，所述细胞含有液用保存液的电导率为3ms/cm以上且20ms/cm以下。
在本发明的保存液中，由于具备所述的构成，因此在将细胞含有液与保存液的混合液冷藏保存的情况下，能够抑制基因组DNA向细胞外的漏出。在本发明的保存液中，例如，即使在4℃保存细胞含有液与保存液的混合液的情况下，也能够抑制基因组DNA向细胞外漏出。本发明中，在冷藏环境下的保存中，能够有效地抑制所述细胞含有液中所含的细胞发生破坏或死亡而该细胞中的基因组DNA混入细胞含有液中。因此，在本发明中，能够提高cfDNA的保存稳定性。
所述细胞含有液是包含细胞的液体。作为所述细胞含有液，可举出体液等，具体而言，可举出全血等血液、尿和脑脊液等。血液中包含白细胞等作为细胞。
从更有效地发挥本发明的效果的方面出发，所述细胞含有液优选为血液。所述保存液优选为血液用保存液。在所述细胞含有液为血液的情况下，在本发明中，也能够有效地抑制冷藏保存中的溶血。
(细胞含有液用保存液)
所述保存液在25℃下为液态。
从发挥本发明的效果的观点出发，所述保存液的电导率为3ms/cm以上且20ms/cm以下。
所述保存液的电导率优选为3.5ms/cm以上，更优选为4ms/cm以上，进一步优选为4.5ms/cm以上，优选为18ms/cm以下，更优选为14ms/cm以下，进一步优选为10ms/cm以下，特别优选为7ms/cm以下。所述电导率为所述下限以上和所述上限以下时，能够更有效地发挥本发明的效果。此外，所述电导率为所述下限以上和所述上限以下时，在所述细胞含有液为血液的情况下，能够更有效地抑制溶血。
就所述保存液的电导率而言，使用电池常数为0.949×0.1cm-1的电池和电导率计在25.0℃下测定。具体而言，可以将电极浸渍于保存液15mL中，测定电导率。作为所述电导率计，例如可以使用HORIBA Scientific公司制“DS-71。”
<甲醛供体化合物(A)>
所述保存液包含甲醛供体化合物(本说明书中，有时记载为“甲醛供体化合物(A)”)。所述甲醛供体化合物(A)是能够使甲醛游离的化合物。通过使用所述甲醛供体化合物(A)，在将细胞含有液与保存液混合时，通过从甲醛供体化合物(A)游离的甲醛的作用，使得细胞的膜蛋白质被交联，能够提高细胞的稳定性。在包含甲醛供体化合物的以往的保存液中，在冷藏环境下的保存中，容易产生细胞含有液中所含的cfDNA的片段长度变化。与之相对，在本发明中，即使在保存液包含甲醛供体化合物的情况下，也能够不易产生cfDNA的片段长度变化。所述甲醛供体化合物(A)可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为所述甲醛供体化合物(A)，可举出：乙内酰脲化合物、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、六亚甲基四胺、N,N”-亚甲基双-[N’-(3-羟基甲基-2,5-二氧代-4-咪唑烷基)脲]、叔胺化合物、仲胺化合物和伯胺化合物等。
作为所述乙内酰脲化合物，可举出：DMDM乙内酰脲、1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、1,3-二羟甲基-5,5-乙内酰脲、及1,3-二氯-5,5-二甲基乙内酰脲等。
从更有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述甲醛供体化合物(A)优选为乙内酰脲化合物，更优选为DMDM乙内酰脲或1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲。
所述保存液中的所述甲醛供体化合物(A)的含量没有特别限定。所述保存液中的所述甲醛供体化合物(A)的含量，例如可以以在后述的混合液P中甲醛的含量满足后述的范围的方式进行适当变更。所述保存液中的所述甲醛供体化合物(A)的含量，可以根据所述细胞含有液与所述保存液的混合比、以及甲醛供体化合物(A)的种类等而适当变更。
所述保存液中的所述甲醛供体化合物(A)的含量优选为0.1w/v％以上，更优选为0.5w/v％以上，进一步优选为1w/v％以上，优选为5.0w/v％以下，更优选为4.5w/v％以下，进一步优选为4.0w/v％以下。所述甲醛供体化合物(A)的含量为所述下限以上和所述上限以下时，甲醛从所述甲醛供体化合物(A)良好地游离，其结果，能够提高细胞的稳定性，并且能够抑制cfDNA的分解。
<作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B)>
所述保存液包含为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(本说明书中，有时记载为“化合物(B)”)。通过使用所述化合物(B)，能够良好地调节保存液的离子强度，能够将保存液的电导率调节为适当的范围。所述化合物(B)可以为无机盐，可以为有机酸，可以为有机盐，也可以为它们的混合物。所述化合物(B)为选自无机盐、有机酸和有机盐中的至少1种化合物。所述化合物(B)可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为所述无机盐，可举出：氯化钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、磷酸盐、碳酸盐等和硼酸盐。作为所述磷酸盐，可举出：磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸二钾等。作为所述碳酸盐，可举出：碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾和碳酸铵等。作为所述硼酸盐，可举出硼酸钠等。所述无机盐可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为所述有机酸，可举出：柠檬酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、己二酸、酒石酸、苯甲酸、吡咯烷酮羧酸和水杨酸等。所述有机酸可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为所述有机盐，可举出：柠檬酸盐、琥珀酸盐和乙酸盐等。作为所述柠檬酸盐，可举出：柠檬酸二氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠和柠檬酸三钠。作为所述琥珀酸盐，可举出：琥珀酸二钠等。作为所述乙酸盐，可举出：乙酸钙和乙酸钠等。所述有机盐可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
所述化合物(B)的分子量可以为50以上，可以为100以上，可以为400以下，可以为300以下。作为所述无机盐的化合物(B)的分子量可以为50以上，可以为100以上，可以为300以下，可以为200以下。作为所述有机酸的化合物(B)的分子量可以为50以上，可以为100以上，可以为200以下，可以为150以下。作为所述有机盐的化合物(B)的分子量可以为50以上，可以为100以上，可以为400以下，可以为200以下。
从容易调节保存液的电导率的观点出发，所述化合物(B)优选为柠檬酸、柠檬酸盐或氯化钠。此外，DNase通过镁离子而活化，因此在所述化合物(B)为柠檬酸或柠檬酸盐的情况下，能够有效地抑制cfDNA在细胞含有液中的分解。此外，在所述化合物(B)为柠檬酸或柠檬酸盐的情况下，在所述细胞含有液为血液时，也能够发挥抗凝固作用。
就所述保存液中的所述化合物(B)的含量而言，只要保存液的电导率成为所述的范围就没有特别限定。
所述保存液中的所述化合物(B)的含量优选为0.1w/v％以上，更优选为2w/v％以上，进一步优选为3w/v％以上，优选为30w/v％以下，更优选为20w/v％以下，进一步优选为10w/v％以下。若所述化合物(B)的含量为所述下限以上及所述上限以下，则能够容易地将保存液的电导率调节为合适的范围。
所述保存液优选包含分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)、或分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)。所述保存液更优选包含分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)和分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)。在该情况下，能够更有效地发挥本发明的效果，此外，能够进一步提高细胞含有液中所含的cfDNA的保存稳定性。
某一化合物是细胞膜透过性化合物还是细胞膜非透过性化合物，通常由该化合物的分子量、电荷、极性等决定。不具有电荷的化合物能够通过被动的扩散而透过细胞膜，因此通常被分类为细胞膜透过性化合物。此外，例如，具有电荷的化合物由于被动的扩散而无法透过细胞膜，因此通常分类为细胞膜非透过性化合物。
<分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)>
所述保存液优选包含分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(本说明书中，有时记载为“细胞膜透过性化合物(C)”)。所述细胞膜透过性化合物(C)是能够透过细胞膜的化合物。所述细胞膜透过性化合物(C)与所述甲醛供体化合物(A)不同，与所述化合物(B)不同。通过使用所述细胞膜透过性化合物(C)，能够使细胞内良好地脱水，此外，能够使所述细胞膜透过性化合物(C)良好地保持在细胞内。因此，在保存中，能够有效地抑制细胞发生破坏或死亡而该细胞中的基因组DNA混入细胞含有液中。所述细胞膜透过性化合物(C)也已知为细胞的冻结保护剂。所述细胞膜透过性化合物(C)可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
所述细胞膜透过性化合物(C)的分子量为100以下。所述细胞膜透过性化合物(C)的分子量可以为30以上，也可以为50以上，还可以为95以下。
所述细胞膜透过性化合物(C)优选在0℃下为液态，优选在25℃下为液态。
作为所述细胞膜透过性化合物(C)，可举出：多元醇、二甲基亚砜和乙酰胺等。作为所述多元醇，可举出：乙二醇、丙二醇、甘油、1,3-丙二醇和丁二醇。
所述细胞膜透过性化合物(C)优选为乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇或丁二醇，更优选为乙二醇、丙二醇、甘油或二甲基亚砜。此外，所述细胞膜透过性化合物(C)优选为多元醇或二甲基亚砜，更优选为多元醇。在该情况下，能够更有效地发挥本发明的效果，此外，也能够进一步提高cfDNA的保存稳定性。
所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物(C)的含量没有特别限定。所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物(C)的含量，例如可以以在后述的混合液R中所述细胞膜透过性化合物(C)的含量满足后述的范围的方式进行适当变更。所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物(C)的含量，可以根据所述细胞含有液与所述保存液的混合比等而适当变更。
所述保存液中的所述细胞膜透过性化合物(C)的含量优选为2vol％以上，更优选为10vol％以上，进一步优选为20vol％以上，优选为50vol％以下，更优选为40vol％以下，进一步优选为35vol％以下，特别优选为30vol％以下。若所述细胞膜透过性化合物(C)的含量为所述下限以上及所述上限以下，则容易将细胞含有液与保存液的混合液(混合液R)中的细胞膜透过性化合物(C)的含量调节为后述的范围，其结果，能够更有效地发挥本发明的效果。
<分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)>
所述保存液优选包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(本说明书中，有时记载为“细胞膜非透过性化合物(D)”)。所述细胞膜非透过性化合物(D)与所述甲醛供体化合物(A)不同，与所述化合物(B)不同。通过使用所述细胞膜非透过性化合物(D)，能够有效地抑制细胞的凝集，此外，能够提高细胞膜的保护效果。因此，在保存中，能够有效地抑制细胞发生破坏或死亡而该细胞中的基因组DNA混入细胞含有液中。所述细胞膜非透过性化合物(D)可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
所述细胞膜非透过性化合物(D)的分子量为300以上。所述细胞膜非透过性化合物(D)的分子量，在能够确定该细胞膜非透过性化合物(D)的结构式的情况下，是指能够由该结构式算出的分子量，在不能确定结构式的情况下，是指重均分子量。
所述细胞膜非透过性化合物(D)的分子量(重均分子量)优选为1000以上，更优选为1万以上，进一步优选为10万以上，优选为400万以下，更优选为100万以下。所述细胞膜非透过性化合物(D)的分子量(重均分子量)为所述下限以上和所述上限以下时，能够更有效地发挥本发明的效果。
所述重均分子量是指，通过凝胶渗透色谱(GPC)测定的以聚苯乙烯换算的重均分子量。
作为所述细胞膜非透过性化合物(D)，可举出：聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇及Ficoll等。作为所述多糖类，可举出：纤维素和葡聚糖等。作为所述多糖类的衍生物，可举出：羟丙基纤维素等。
从更有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述细胞膜非透过性化合物(D)优选为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇、或Ficoll。从更有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述细胞膜非透过性化合物(D)更优选为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖或羟丙基纤维素，进一步优选为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或聚乙烯醇。
所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量没有特别限定。所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量，例如可以以在后述的混合液S中所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量满足后述的范围的方式进行适当变更。所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量，可以根据所述细胞含有液与所述保存液的混合比等而适当变更。
所述保存液中的所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量优选为1μmol/L以上，更优选为5μmol/L以上，优选为100μmol/L以下，更优选为50μmol/L以下。若所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量为所述下限以上及所述上限以下，则容易将细胞含有液与保存液的混合液(混合液S)中的细胞膜非透过性化合物(D)的含量调节为后述的范围，其结果，能够更有效地发挥本发明的效果。
<与柠檬酸和柠檬酸盐这两者不同且具有螯合作用的化合物(E)>
所述保存液优选包含与柠檬酸和柠檬酸盐这两者不同且具有螯合作用的化合物(本说明书中，有时记载为“具有螯合作用的化合物(E)”)。所述具有螯合作用的化合物(E)与柠檬酸和柠檬酸盐这两者不同。所述具有螯合作用的化合物(E)与甲醛供体化合物(A)不同，与化合物(B)不同，与细胞膜透过性化合物(C)不同，与细胞膜非透过性化合物(D)不同。DNase通过镁离子而活化，因此通过使用所述具有螯合作用的化合物(E)，能够有效地抑制在细胞含有液中的cfDNA的分解。在所述细胞含有液为血液的情况下，所述保存液优选包含抗凝剂(与柠檬酸和柠檬酸盐这两者不同的抗凝剂)作为所述具有螯合作用的化合物(E)。在该情况下，除了有效地抑制cfDNA的分解以外，还能够有效地抑制保存中的血液的凝固。所述具有螯合作用的化合物(E)可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为所述具有螯合作用的化合物(E)，可举出：乙二胺四乙酸(EDTA)和二醇醚二胺四乙酸(EGTA)等。
从更有效地抑制cfDNA的分解的观点以及在所述细胞含有液为血液的情况下更有效地抑制保存中的血液的凝固的观点出发，所述具有螯合作用的化合物(E)优选包含EDTA，优选为EDTA。
所述保存液中的所述具有螯合作用的化合物(E)的含量可以根据所述细胞含有液与所述保存液的混合比、以及具有螯合作用的化合物(E)的种类等适当变更。
<单糖类或二糖类>
所述保存液优选包含单糖类或二糖类。所述单糖类或二糖类与甲醛供体化合物(A)不同，与化合物(B)不同，与细胞膜透过性化合物(C)不同，与细胞膜非透过性化合物(D)不同，与具有螯合作用的化合物(E)不同。通过使用所述单糖类或二糖类，能够有效地提高将细胞含有液和保存液混合而成的液体的渗透压，此外，能够更有效地发挥本发明的效果。所述保存液可以包含单糖类，也可以包含二糖类，还可以包含单糖类和二糖类。
作为所述单糖类，可举出：葡萄糖、果糖和半乳糖等。所述单糖类可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为所述二糖类，可举出：蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖等。所述二糖类可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
从更有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述单糖类或二糖类优选为葡萄糖或蔗糖，更优选为葡萄糖。
所述保存液中的所述单糖类或二糖类的含量没有特别限定。所述保存液中的所述单糖类或二糖类的含量，例如可以以后述的保存液或混合液Q的渗透压满足后述的范围的方式进行适当变更。
<其他成分>
所述保存液可以包含所述成分以外的其他成分。作为所述其它成分，可举出：氨基酸、水、pH调节剂等。所述其他成分可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
所述保存液优选包含水。所述保存液100重量％中，水的含量优选为30重量％以上，更优选为40重量％以上，优选为80重量％以下，更优选为70重量％以上，进一步优选为60重量％以下。
<保存液的其他详细情况>
所述保存液的渗透压优选为300mOsm/L以上，更优选为600mOsm/L以上，优选为4000mOsm/L以下，更优选为3000mOsm/L以下。若所述保存液的渗透压为所述下限以上及所述上限以下，则能够更有效地发挥本发明的效果。
所述保存液的渗透压可以使用渗透压计(例如Advanced Instruments公司制“Osmometer 3250”)进行测定。
所述保存液的pH优选为5.0以上，更优选为6.0以上，优选为8.0以下，更优选为7.5以下。所述pH为所述下限以上和所述上限以下时，能够更有效地发挥本发明的效果。
(细胞含有液用保存容器)
本发明的细胞含有液用保存容器(以下，有时简称为“保存容器”)是采集给定量的细胞含有液的保存容器。本发明的保存容器是用于保存细胞含有液的容器。本发明的保存容器具备：容器主体和容纳于所述容器主体内的保存液。本发明的保存容器中，所述保存液为上述保存液。本发明的保存容器是用于采集给定量的细胞含有液并保存该细胞含有液与保存液的混合液的容器。本发明的保存容器用于保存所采集的细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液。本发明的保存容器优选用于冷藏保存所述混合液。
所述保存容器优选具备以下的构成P。
构成P：得到相对于生理盐水1L混合有次氯酸钠7.4g的溶液Pa，将与待采集至细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述溶液Pa采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该溶液Pa与所述保存液混合而成的混合液P时，在所述混合液P中，甲醛的含量为100mg/L以上且400mg/L以下。
需要说明的是，所述溶液Pa是模拟细胞含有液的溶液。甲醛从所述甲醛供体化合物(A)游离，而使得所述混合液P包含甲醛。
具体而言，所述混合液P如下制备。
将与待采集至所述保存容器的细胞含有液的给定量等量的所述溶液Pa采集至该保存容器。例如，在待采集5mL的血液的保存容器中，将5mL的溶液Pa采集至该保存容器。通过颠倒混合将采集的所述给定量的溶液Pa与所述保存液混合，得到混合液P。
在所述混合液P中，甲醛的含量优选为100mg/L以上，更优选为150mg/L以上，优选为400mg/L以下，更优选为300mg/L以下，进一步优选为200mg/L以下，特别优选为190mg/L以下。若所述混合液P中的所述甲醛的含量为所述下限以上和所述上限以下，则能够适当地控制细胞含有液与保存液的混合液中的甲醛的浓度。因此，能够提高细胞的稳定性，并且能够更有效地发挥本发明的效果，此外，能够抑制cfDNA的分解。需要说明的是，所述混合液P中的甲醛的含量超过400mg/L时，与为400mg/L以下的情况相比，有时cfDNA之间或cfDNA与膜蛋白质容易交联，cfDNA的保存稳定性降低。
所述混合液P中的所述甲醛的含量通过MBTH比色法求得。
所述保存容器优选具备以下的构成Q。
构成Q：将与待采集至细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的生理盐水采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该生理盐水与所述保存液混合而成的混合液Q时，所述混合液Q的渗透压为300mOsm/L以上且1100mOsm/L以下。
具体而言，所述混合液Q如下制备。
将与待采集至所述保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述生理盐水采集至该保存容器中。例如，在待采集5mL的血液的保存容器中，将5mL的生理盐水采集至该保存容器。通过颠倒混合将采集的所述给定量的生理盐水和所述保存液混合，得到混合液Q。
所述混合液Q的渗透压优选为300mOsm/L以上，更优选为350mOsm/L以上，优选为1100mOsm/L以下，更优选为1000mOsm/L以下。若所述混合液Q的渗透压为所述下限以上及所述上限以下，则能够使细胞含有液与保存液在混合液中的渗透压良好。因此，能够更有效地发挥本发明的效果。
所述混合液Q的渗透压可以使用渗透压计(例如Advanced Instruments公司制“Osmometer 3250”)进行测定。
在所述保存液包含所述细胞膜透过性化合物(C)的情况下，所述保存容器优选具备以下的构成R。
构成R：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液R时，在所述混合液R中，所述细胞膜透过性化合物(C)的含量为1vol％以上且5vol％以下。
具体而言，所述混合液R如下制备。
将待采集至所述保存容器的给定量的细胞含有液采集至该保存容器。例如，在待采集5mL的血液的保存容器中，将5mL的血液采集至该保存容器。通过颠倒混合将采集的所述给定量的细胞含有液和所述保存液混合，得到混合液R。
在所述混合液R中，所述细胞膜透过性化合物(C)的含量优选为1vol％以上，更优选为2vol％以上，优选为5vol％以下，更优选为4vol％以下。即，在所述混合液R中，所述细胞膜透过性化合物(C)的含量优选为1体积％以上，更优选为2体积％以上，优选为5体积％以下，更优选为4体积％以下。若所述混合液R中的所述细胞膜透过性化合物(C)的含量为所述下限以上及所述上限以下，则能够使细胞内更良好地脱水，此外，能够使所述细胞膜透过性化合物(C)更良好地保持在细胞内。因此，能够更有效地抑制在保存中细胞发生破坏或死亡而该细胞中的基因组DNA混入细胞含有液中。
在所述保存液包含所述细胞膜非透过性化合物(D)的情况下，所述保存容器优选具备以下的构成S。
构成S：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液S时，在所述混合液S中，所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量为0.5μmol/L以上且5μmol/L以下。
具体而言，所述混合液S如下制备。
将待采集至所述保存容器的给定量的细胞含有液采集至该保存容器。例如，在待采集5mL的血液的保存容器中，将5mL的血液采集至该保存容器。通过颠倒混合将采集的所述给定量的细胞含有液和所述保存液混合，得到混合液S。需要说明的是，所述混合液R和所述混合液S是相同的液体。
在所述混合液S中，所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量优选为0.5μm ol/L以上，更优选为1μmol/L以上，优选为5μmol/L以下，更优选为4μmol/L以下。若所述混合液S中的所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量为所述下限以上及所述上限以下，则能够更有效地抑制细胞的凝集，此外，能够进一步提高细胞膜的保护效果。因此，能够更有效地抑制在保存中细胞发生破坏或死亡而该细胞中的基因组DNA混入细胞含有液中。
在所述保存液包含所述具有螯合作用的化合物(E)的情况下，所述保存容器优选具备以下的构成T。
构成T：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液T时，所述混合液T中所述具有螯合作用的化合物(E)的含量为0.03w/v％以上且0.5w/v％以下。
具体而言，所述混合液T如下制备。
将待采集至所述保存容器的给定量的细胞含有液采集至该保存容器。例如，在待采集5mL的血液的保存容器中，将5mL的血液采集至该保存容器。通过颠倒混合将采集的所述给定量的细胞含有液和所述保存液混合，得到混合液T。需要说明的是，所述混合液R、所述混合液S和所述混合液T是相同的液体。
在所述混合液T中，所述具有螯合作用的化合物(E)的含量优选为0.04w/v％以上，更优选为0.06w/v％以上，优选为0.40w/v％以下，更优选为0.30w/v％以下。若所述混合液T中的所述具有螯合作用的化合物(E)的含量为所述下限以上及所述上限以下，则能够更有效地抑制cfDNA的分解。此外，所述具有螯合作用的化合物(E)的含量为所述下限以上和所述上限以下时，在所述细胞含有液为血液的情况下，能够更有效地抑制血液的保存中的凝固。
<容器主体>
作为所述容器主体的形状，没有特别限定。所述容器主体的形状优选为有底的容器，更优选为有底的管状容器。
所述容器主体的材料没有特别限定。作为所述容器主体的原材料，可举出：聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈等热塑性树脂；不饱和聚酯树脂、环氧树脂、环氧-丙烯酸酯树脂等热固性树脂；乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙基纤维素、乙基甲壳素等改性天然树脂；钠钙玻璃、磷硅酸玻璃、硼硅酸玻璃等硅酸盐玻璃、石英玻璃等玻璃。所述容器主体的原材料可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。
<栓体>
所述保存容器优选具备栓体。作为所述栓体，可使用以往公知的栓体。优选所述栓体是由能够气密且液密地安装于容器主体的开口的材料、形状构成的栓体。在所述细胞含有液为血液的情况下，所述栓体优选构成为采血针能够刺穿。
作为所述栓体，可举出具有与容器主体的开口嵌合的形状的栓体、片状的密封栓体等。
此外，所述栓体也可以是具备橡胶栓等栓主体和由塑料等构成的盖部件的栓体。在该情况下，在采集血液后从容器主体的开口拔出栓体时，能够抑制血液与人体接触的风险。
作为所述栓体(或所述栓主体)的材料，例如可举出：合成树脂、弹性体、橡胶、金属箔等。作为所述橡胶，可举出：丁基橡胶和卤化丁基橡胶。作为所述金属箔，可举出铝箔等。从提高密封性的观点出发，所述栓体的材料优选为丁基橡胶。所述栓体优选为丁基橡胶栓。
(保存容器和保存液的其它详细情况)
在所述保存容器中采集给定量的细胞含有液。所述保存容器是用于采集和保存给定量的细胞含有液的容器。所述保存容器是用于将所述细胞含有液与所述保存液以混合的状态保存的容器。待采集至所述保存容器中的所述细胞含有液的所述给定量根据该保存容器的尺寸等而适当变更。作为待采集至所述保存容器中的所述细胞含有液的所述给定量，例如为1mL、5mL、10mL或20mL。待采集至所述保存容器中的所述细胞含有液的所述给定量可以为0.5mL以上，可以为1mL以上，可以为5mL以上，可以为25mL以下，可以为20mL以下，可以为15mL以下。
所述保存容器优选为用于以液态保存所述细胞含有液的容器，优选为用于在不冻结的情况下保存所述细胞含有液的容器。所述保存容器优选为用于在0℃以上保存所述细胞含有液的容器，更优选为用于在1℃以上保存的容器，优选为用于在40℃以下保存的容器，更优选为用于在25℃以下保存的容器，进一步优选为用于在10℃以下保存的容器。
所述保存液优选用于在0℃以上保存所述细胞含有液，更优选用于在1℃以上保存，优选用于在40℃以下保存，更优选用于在25℃以下保存，进一步优选用于在10℃以下保存。
相对于采集的细胞含有液1mL，容纳于所述容器主体内的保存液的量优选为0.05mL以上，更优选为0.1mL以上，优选为1mL以下，更优选为0.5mL以下。所述保存液的量为所述下限以上和所述上限以下时，细胞含有液不会被过度稀释，能够更有效地发挥本发明的效果。
所述保存液优选相对于采集的细胞含有液1mL以0.05mL以上混合使用，更优选以0.1mL以上混合使用，优选以1mL以下混合使用，更优选以0.5mL以下混合使用。在该情况下，细胞含有液不会被过度稀释，能够更有效地发挥本发明的效果。
所述保存容器的内压没有特别限定。所述保存容器的内压优选被减压。在所述保存容器为减压容器的情况下，能够简便地将给定量的细胞含有液采集至保存容器中。所述保存容器也可以作为在内部被排气后被所述栓体密闭的真空采血管使用。在为真空采血管的情况下，能够与采血者的技术差异无关地简便地进行给定量的血液采集。
从防止细菌感染的观点出发，保存容器的内部优选按照ISO或JIS的基准进行灭菌。
以下，举出实施例进一步详细说明本发明。本发明不仅限于以下的实施例。
作为保存液的材料，准备以下材料。
(甲醛供体化合物(A))
1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲
DMDM乙内酰脲
咪唑烷基脲
(作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B))
柠檬酸3Na·2H2O(包含柠檬酸3Na作为有机盐)
柠檬酸·H2O(包含柠檬酸作为有机酸)
氯化钠
(细胞膜透过性化合物(C))
丙二醇
二甲基亚砜
(细胞膜非透过性化合物(D))
聚乙二醇(重均分子量50万)
葡聚糖(重均分子量20万)
(具有螯合作用的化合物(E))
EDTA(抗凝剂)
(其他)
葡萄糖
甘氨酸
水
(实施例1～实施例8及比较例2、比较例3)
保存液的制备：
相对于水，以表1～3所示的配合量配合表1～3所示的配合成分，得到保存液。需要说明的是，对于化合物(B)的有机酸和有机盐的配合量，以水合物的状态下的配合量表示。
保存容器的制备：
作为容器主体，准备长度100mm、开口部的内径14mm的聚对苯二甲酸乙二醇酯有底管(PET有底管)。在PET有底管中容纳所得到的保存液0.5mL。将保存容器内部减压至50kPa，用丁基橡胶栓密封。由此制备用于采集及保存血液5mL的保存容器。
(比较例1)
保存液的制备：
相对于水，以表3所示的配合量配合表3所示的配合成分，得到保存液。
保存容器的制备：
作为容器主体，准备长度100mm、开口部的内径14mm的聚对苯二甲酸乙二醇酯有底管(PET有底管)。在PET有底管中容纳0.05mL得到的保存液。将保存容器内部减压至50kPa，用丁基橡胶栓密封。由此制备用于采集及保存血液5mL的保存容器。
(评价)
(1)保存液的电导率
在所得到的保存液15mL中浸渍电极，测定电导率。需要说明的是，使用电池常数为0.949×0.1cm-1的电池和电导率计(HORIBA Scientific公司制“DS-71”)，在25.0℃下测定保存液的电导率。
(2)混合液P中的甲醛的含量
制备相对于生理盐水1L混合有次氯酸钠7.4g的溶液Pa。在得到的保存容器中采集5mL的溶液Pa，通过颠倒混合将溶液Pa和保存液混合，得到混合液P。通过MBTH比色法测定所得到的混合液P中甲醛的含量(mg/L)。
(3)混合液Q的渗透压
在得到的保存容器中采集生理盐水5mL，通过颠倒混合将生理盐水和保存液混合，得到混合液Q。使用渗透压计(Advanced Instruments公司制“Osmo meter 3250”)测定得到的混合液Q的渗透压。
(4)混合液R中的细胞膜透过性化合物(C)的含量
在得到的保存容器中采集血液5mL，通过颠倒混合将血液和保存液混合，得到混合液R。求出所得到的混合液R中所含的细胞膜透过性化合物(C)的含量(vol％)。
(5)混合液S中的细胞膜非透过性化合物(D)的含量
在得到的保存容器中采集血液5mL，通过颠倒混合将血液和保存液混合，得到混合液S。求出得到的混合液S中所含的细胞膜非透过性化合物(D)的含量(μmol/L)。
(6)保存稳定性(4℃)
(6-1)溶血
在得到的保存容器中采集血液5mL，通过颠倒混合将血液和保存液混合。接着，将容纳有所述混合液的保存容器在4℃的环境下保存。保存7天后，将容纳有所述混合液的保存容器离心分离，分离为包含血浆的层(上方)和包含细胞成分的层(下方)。目视确认包含血浆的层，确认在该包含血浆的层中是否产生溶血。
<溶血的判断基准>
○：在包含血浆的层中未产生溶血
×：在包含血浆的层中产生溶血
(6-2)血浆中的DNA浓度(基因组DNA向细胞外的漏出)
进行所述“(6-1)溶血”的试验后，从保存容器回收含血浆的层。使用cfDNA纯化试剂盒(QIAGEN公司制“QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit”)，对回收的血浆中所含的DNA进行纯化。需要说明的是，DNA的纯化操作在从保存容器回收血浆之日实施。
使用Qubit dsDNA HS Assay kit(Invitrogen公司)测定纯化后的提取液中的DNA浓度。接着，按照下式算出DNA浓度(每1mL血浆中所含的DNA的含量)。
DNA浓度(ng/血浆1mL)＝[A]×[B]/[C]
[A]：纯化后的提取液中的DNA浓度的测定值(ng/mL)
[B]：纯化后的提取液的总用量(mL)
[C]：DNA纯化中使用的血浆的用量(mL)
所述DNA浓度(ng/血浆1mL)越低，意味着越抑制基因组DNA向细胞外的漏出。
将组成和结果示于下述表1～表3。
[表1]
[表2]
[表3]
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Claims (15)

1.一种细胞含有液用保存液，其包含：
甲醛供体化合物(A)、和
作为无机盐、有机酸或有机盐的化合物(B)，
所述细胞含有液用保存液的电导率为3ms/cm以上且20ms/cm以下。
2.根据权利要求1所述的细胞含有液用保存液，其包含：
分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)。
3.根据权利要求2所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述细胞膜透过性化合物(C)为多元醇。
4.根据权利要求2所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述细胞膜透过性化合物(C)为乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亚砜、乙酰胺、1,3-丙二醇或丁二醇。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞含有液用保存液，其包含：
分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)。
6.根据权利要求5所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述细胞膜非透过性化合物(D)的分子量为1000以上。
7.根据权利要求5或6所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述细胞膜非透过性化合物(D)为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、多糖类、多糖类的衍生物、糖醇或Ficoll。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述甲醛供体化合物(A)为DMDM乙内酰脲或1-羟基甲基-5,5-二甲基乙内酰脲。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述化合物(B)为柠檬酸、柠檬酸盐或氯化钠。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞含有液用保存液，其中，
所述细胞含有液为血液。
11.一种细胞含有液用保存容器，其为用于采集给定量的细胞含有液的细胞含有液用保存容器，其中，
所述细胞含有液用保存容器具备：
容器主体、和
容纳于所述容器主体内的保存液，
所述保存液为权利要求1～10中任一项所述的细胞含有液用保存液。
12.根据权利要求11所述的细胞含有液用保存容器，其中，
所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成P，
构成P：得到相对于生理盐水1L混合有次氯酸钠7.4g的溶液Pa，将与待采集至细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的所述溶液P a采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该溶液Pa与所述保存液混合而成的混合液P时，在所述混合液P中，甲醛的含量为100mg/L以上且400mg/L以下。
13.根据权利要求11或12所述的细胞含有液用保存容器，其中，
所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成Q，
构成Q：将与待采集至细胞含有液用保存容器中的细胞含有液的给定量等量的生理盐水采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该生理盐水与所述保存液混合而成的混合液Q时，所述混合液Q的渗透压为300mOsm/L以上且1100mOsm/L以下。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的细胞含有液用保存容器，其中，
所述保存液包含分子量为100以下且在0℃下不冻结的细胞膜透过性化合物(C)，
所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成R，
构成R：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液R时，在所述混合液R中，所述细胞膜透过性化合物(C)的含量为1vol％以上且5vol％以下。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的细胞含有液用保存容器，其中，
所述保存液包含分子量为300以上的细胞膜非透过性化合物(D)，
所述细胞含有液用保存容器具备以下的构成S，
构成S：将所述给定量的细胞含有液采集至细胞含有液用保存容器中，得到将该细胞含有液与所述保存液混合而成的混合液S时，在所述混合液S中，所述细胞膜非透过性化合物(D)的含量为0.5μmol/L以上且5μmol/L以下。
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