CN117165580B - 一种用于稳定样本中核酸的组合物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于稳定样本中核酸的组合物、制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。本发明用于稳定生物检测样本中核酸的组合物，所述组合物包括如下质量分数的组分：1~15%份双草酸盐、1~5%份β‑环糊精、1~15%份尼泊金乙酯、1~10%份盐酸胍、0.1~5%份柠檬酸钠、1~18%份丙二醇，使用PBS补至100%。本发明组合物中各成分相互配合，协同作用，高效地抑制血浆中核酸酶活性，避免在保存、运输过程中，cfDNA被核酸酶降解；同时增强了细胞的稳定性，避免血细胞裂解，基因组DNA释放导致的对cfDNA检测的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于稳定样本中核酸的组合物、制备方法及其应用。
背景技术
生命科学领域的研究基于对生物材料或样品、矿物质或化学物质的分析。其中，生物材料或样品包括动物体表或体液样品，如口腔刮取物、唾液、痰液、血液、尿液等；核酸样品，如基因组DNA、PCR产物、基因克隆DNA及RNA等；蛋白样品，如酶、多肽等；微生物样品，包括原核生物，如细菌、古菌、病毒(如噬菌体、朊病毒)等；真核生物，如原生动物、真菌(如酵母)等；低等植物，如藻类等；高等植物和动物样品，包括各类细胞，如体细胞、干细胞、生殖细胞(精细胞和卵细胞)等，及其各类组织样品等。
细胞游离脱氧核糖核酸（cell-free deoxyribonucleic acid，cfDNA）是血液中双链DNA的组成部分之一，通过细胞凋亡或坏死释放到血液中，通常是长度为150～200个碱基对的双链片段，可从血浆中分离出来。患者血浆中cfDNA的分析正在为患者的早期临床诊断、基因突变检测以及预后的预测、耐药性等方面提供参考，并有望成为重要的液体生物标志物和指导精准治疗模式中的新方法。
准确定量低发生率的靶标cfDNA意味着从采血后的样本保存和运输过程中，要尽可能的减少白细胞的基因组释放到血液中，这样才能准确反映特定cfDNA在血液中的占比。基因组DNA（genomic DNA，gDNA）的释放将会阻碍下游的检测应用。其次，要最大限度的防止cfDNA在血液中的降解。生物样品的高度不稳定性使其在长期保存过程中仍保持生物活性变得尤其困难。尽管对核酸和蛋白样品进行冷冻干燥可以延长其保存期限，但后续再次液体化仍会造成样品活性的丧失，因此冷冻干燥不是理想的保存技术。
防止gDNA释放到血浆中的一种方法是在采血后立即处理血液。这可能会限制使用cfDNA的诊断范围，尤其是在缺少分离血浆的设备和缺乏运输前低温储存的偏远地区。另一种方法是采用特殊的采血管，其中的化学添加剂能够稳定细胞的状态，从而使样本能够在室温条件下进行短时间存放。
专利CN 105158455 B一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用，提供的技术方案可在室温或高温条件下收集、并长时间储存生物样品，有利于生物样品的稳定性，从而提高测试的精度和准确率，其用途较为广泛，但并未针对血液样本进行优化；专利CN 107760673 B一种血液中游离DNA的稳定剂和用于血液中游离DNA检测的采血管，所述稳定剂包括第一溶液和第二溶液，所述第一溶液包括：第一缓冲液、第一抗凝剂、细胞稳定剂、代谢抑制剂和第一溶剂；所述第二溶液包括：第二缓冲液、第二抗凝剂、血液生物相容性试剂、游离DNA稳定剂、防腐剂，其提供了一种血液中游离DNA的稳定剂，以使得所述血液中游离DNA在常温条件下稳定存储，然而其组成复杂，不利于工业化生产。随着人们健康意识的提高，血液检测将面临更大的需求，对于新型采血稳定剂以及相应的采血管等装置的需求越来越巨大和迫切。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于稳定样本中核酸的组合物、制备方法及其应用。本发明各成分相互配合，协同作用，高效地抑制血浆中核酸酶活性；本发明血液稳定剂能稳定血细胞，防止有核细胞破裂而释放细胞中的DNA，避免血细胞外DNA浓度增加导致的对cfDNA检测的干扰，因此对于血液检测中新型稳定剂以及相应保存容器的开发具有十分重要的价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于稳定生物检测样本中核酸的组合物，所述组合物包括如下质量分数的组分：1~15%份双草酸盐、1~5%份β-环糊精、1~15%份尼泊金乙酯、1~10%份盐酸胍、0.1~5%份柠檬酸钠、1~18%份丙二醇，使用PBS补至100%。
进一步的，所述双草酸盐由草酸铵和草酸钾以3：0.4~9摩尔比混合而成。
本发明的第二方面，提供所述用于稳定生物检测样本中核酸的组合物的制备方法，将双草酸盐、β-环糊精、尼泊金乙酯、盐酸胍、柠檬酸钠、丙二醇和PBS按照比例混合均匀，过滤，备用。
本发明的第三方面，提供所述用于稳定生物检测样本中核酸的组合物的应用，用于稳定生物检测样本中核酸。
本发明的第四方面，提供利用所述用于稳定生物检测样本中核酸的组合物制造稳定生物检测样本中核酸的产品。
进一步的，所述产品包括：采血管、采血瓶、采血袋以及含有非血液生物样品的容器。
进一步的，所述非血液生物样品包括唾液、尿液、器官、阴道分泌物、心包腹部和其他体腔的体液、细胞、器官培养基、口腔拭子。
本发明的第五方面，提供所述稳定生物检测样本中核酸的产品在生物样本检测中的应用。
本发明的第六方面，提供一种真空采血管，所述真空采血管由以下步骤制备而成：
将所述用于稳定生物检测样本中核酸的组合物置于采血管中，抽成真空负压，获得真空采血管；
所述组合物的体积用量与采血管管容积的比值为1：（10~200）；
所述真空负压≥14.4 kg/cm2；所述组合物在置于采血管前采用220nm滤膜过滤除去细菌。
本发明的第七方面，提供所述真空采血管在稳定生物检测样本中核酸中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的血液稳定剂能稳定血细胞，防止有核细胞破裂而释放细胞中的DNA，避免血细胞外DNA浓度增加导致的对cfDNA检测的干扰；本发明各成分相互配合，协同作用，高效地抑制血浆中核酸酶活性，避免在保存、运输过程中，cfDNA在体外降解被核酸酶降解。本发明的血液稳定剂能使全血样品稳定至少168小时，经处理的血液样品不会影响后续样品分析，可广泛应用于分析血浆样品中游离DNA。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本申请所用血液来源于健康家兔，符合实验动物伦理相关规定。所用尼泊金乙酯购买自默克，盐酸胍购买自赛默飞。
实施例1
组合物制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分：8%双草酸盐、2%β-环糊精、5%尼泊金乙酯、3%盐酸胍、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%；双草酸盐由草酸铵和草酸钾以3：2摩尔比混合而成。
将混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用。
实施例2
组合物制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分： 10%双草酸盐、2%β-环糊精、10%尼泊金乙酯、5%盐酸胍、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%；双草酸盐由草酸铵和草酸钾以3：2摩尔比混合而成。
将混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用。
实施例3
组合物制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分： 12%双草酸盐、2%β-环糊精、12%尼泊金乙酯、7%盐酸胍、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%；双草酸盐由草酸铵和草酸钾以3：2摩尔比混合而成。
将混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用。
实施例4
采血管1制备方法：
根据实施例1方法制备并过滤好的组合物，取0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管1。
实施例5
采血管2制备方法：
根据实施例2方法制备并过滤好的组合物，取0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管2。
实施例6
采血管3制备方法：
根据实施例3方法制备并过滤好的组合物，取0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管3。
对比例1
采血管4制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分：2%β-环糊精、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%。
将各组分混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用；
取过滤好的组合物0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管4。
对比例2
采血管5制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分：10%双草酸盐、2%β-环糊精、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%；双草酸盐由草酸铵和草酸钾以3：2摩尔比混合而成。
将各组分混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用；
取过滤好的组合物0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管5。
对比例3
采血管6制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分： 2%β-环糊精、10%尼泊金乙酯、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%。
将各组分混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用；
取过滤好的组合物0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管6。
对比例4
采血管7制备方法：
所述组合物包括如下质量分数的组分： 2%β-环糊精、5%盐酸胍、1%柠檬酸钠、15%丙二醇，使用PBS补至100%。
将各组分混合均匀的组合物采用220nm滤膜过滤，备用；
取过滤好的组合物0.1g，加入到10ml未添加其他物质的采血管中，抽成真空负压，真空负压大于16kg/cm2，构成含有组合物的采血管7。
试验例1
溶血率测试：
根据YY/T 1651.1-2019 医疗器械溶血试验进行实验。
待测血样：采集外周血，分别保存于采血管1~7中。每种采血管均采集4管血液，上下颠倒混匀15次后立即等分4份至无抗凝剂促凝剂的采血管中，每管2 mL，保存于4 ℃环境中。分别在0、3 d、7 d、14 d分离血浆，-80 ℃保存。
取20μL实验样品全血，加入25μL生理盐水制备稀释血样，其中实验样品全血，来源于待测血样步骤中采血管1~7，并保存相应时长；阴性对照：取20μL新鲜全血，加入25μL生理盐水制备稀释阴性对照；阳性对照：取20μL新鲜全血，加入25μL蒸馏水制备稀释阳性对照。
取30μL稀释待测血样、稀释阴性对照、阳性对照加入新的离心管中，向待测血样、阴性对照管中分别加入1.5mL生理盐水，向阳性对照中加入1.5mL蒸馏水，摇匀后放入到37℃水浴锅孵育1h，每20分钟进行摇匀。孵育完成后，将各管放入离心机中进行800g离心10min，吸取1mL上清至新的试管。将各样品吸取到比色皿中，在545nm波长进行吸光度测定，结果见表1。
表1.样本保存剂的溶血率测试
通过表1可以看出，在实验进行的7d内，使用采血管1~3，血液中细胞较好地维持其原有形态，发生破裂的细胞较少，在7d时采血管1~3样品的溶血率分别为2.82%、1.68%和1.65%。
而对于采血管4~7，在3d时采血管4~7中样品的溶血率分别为25.64%、22.42%、15.49%和17.75%，在7d时采血管4~7中样品的溶血率分别为40.37%、36.18%、24.57%和28.79%；由于发生大量溶血，样品中血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。
cfDNA含量测试：
血浆提取：采集外周血，分别保存于采血管1~7中。每种采血管均采集4管血液，上下颠倒混匀15次后立即等分4份至无抗凝剂促凝剂的采血管中，每管2 mL，保存于4 ℃环境中。分别在0、3 d、7 d、14 d分离血浆，-80 ℃保存。
游离核酸提取：在室温下解冻血浆样品，4 ℃、15000g离心6min。使用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit从1.0mL血浆中提取游离核酸。
Qubit定量：采用Qubit 2.0，Qubit dsDNA HS Assay kit试剂对血浆游离核酸定量，取1μL提取的游离核酸，加入199 μL混合液，使用“dsDNA：high sensitivity”模式，对游离核酸浓度进行测定。对不同保护剂、保存时间下的血液中游离核酸进行定量，结果见表2。
表2.cfDNA质量浓度（10-3mg/L)
通过表2可以看出，在实验进行的14d内，使用采血管1~3，血液中cfDNA的浓度保持相对稳定，在14d时采血管1~3样品的cfDNA质量浓度分别为11.86×10-3mg/L 、6.55×10- 3mg/L和6.27×10-3mg/L，分别为0d初始值的3.8、2.1和2.0倍。
而使用采血管4~7，血液中cfDNA的浓度迅速提升，在3d时采血管4~7中样品的cfDNA质量浓度分别为18.72×10-3mg/L、15.60×10-3mg/L、 16.22×10-3mg/L和17.78×10- 3mg/L，分别为0d初始值的6.1、5.0、5.2和5.7倍；在7d时采血管4~7中样品的cfDNA质量浓度分别为289.22×10-3mg/L、267.07×10-3mg/L、 194.38×10-3mg/L和183.46×10-3mg/L，分别为0d初始值的92.7、85.6、62.3和58.8倍。样品中细胞大量破裂，导致白细胞等有核细胞内的DNA进入血浆中，提高了细胞外DNA浓度，影响后续检测。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于稳定血液样本中核酸的组合物，其特征在于，所述组合物包括如下质量分数的组分：1~15%份双草酸盐、1~5%份β-环糊精、1~15%份尼泊金乙酯、1~10%份盐酸胍、0.1~5%份柠檬酸钠、1~18%份丙二醇，使用PBS补至100%；所述双草酸盐由草酸铵和草酸钾以3：0.4~9摩尔比混合而成。
2.权利要求1所述用于稳定血液样本中核酸的组合物的制备方法，其特征在于，将双草酸盐、β-环糊精、尼泊金乙酯、盐酸胍、柠檬酸钠、丙二醇和PBS按照权利要求1比例混合均匀，过滤，备用。
3.利用权利要求1所述用于稳定血液样本中核酸的组合物制造稳定血液样本中核酸的产品。
4.根据权利要求3所述稳定血液样本中核酸的产品，其特征在于，所述产品包括：采血管、采血瓶、采血袋以及其他含有血液样品的容器。
5.权利要求3～4任一项所述稳定血液样本中核酸的产品在血液样本检测中的应用。
6.一种真空采血管，其特征在于，所述真空采血管由以下步骤制备而成：
将权利要求1所述用于稳定血液样本中核酸的组合物置于采血管中，抽成真空负压，获得真空采血管；
所述组合物的体积用量与采血管管容积的比值为1：（10~200）；
所述真空负压≥14.4 kg/cm2；所述组合物在置于采血管前采用220nm滤膜过滤除去细菌。
7.权利要求6所述真空采血管在稳定血液样本核酸中的应用。
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