CN105158455A - 一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用。本发明提供的技术方案可在室温或高温条件下收集、并长时间储存生物样品,有利于生物样品的稳定性,从而提高测试的精度和准确率。其中,生物样品包括但不限于组织(比如血液)、细胞、核酸和蛋白质等。
Description
技术领域
本发明涉及生物样品采集、运输、存储、检测技术,具体涉及一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用。
背景技术
在生化检验和相关领域中,通常需要收集、存储、并在相当一段时间内保存生物样品,比如动物组织、血液、细胞、细胞组分、蛋白和核酸等,直到该样品得到检验。例如,在组织学、细胞学、肿瘤学、遗传学、病毒学、血液学、免疫学和蛋白质的相关研究中,器官以及其组成部分通常保存在防腐溶液中。样品的好坏直接决定了生化检验的结果的可信度。影响检验结果可重复性的最大因素是原始样品的分析前变异。
生物材料和样品的完整性对其生化检验的精确度及准确性至关重要。本发明涉及到的生物材料和样品包括DNA、RNA、血液、尿液、排泄物、口腔标本、细菌、古细菌、病毒、噬菌体、植物、藻类、酵母菌、微生物、聚合酶链式反应产物、复制的DNA、蛋白质、酶、多肽、真核生物、原核生物、细胞、组织、生殖细胞、干细胞以及疫苗。以上生物材料被大量应用在诸多领域,包括但不限于教学辅助和疾病的诊断与治疗。
这些样品通常从适当渠道取得并登记储存以备未来的使用和分析。一般情况下样品需在要由冰、干冰或者其他冷冻设备创造的冷藏环境中运输和保存,其目的在于使样品保持完整、无菌并且稳定。然而对于那些需要在不同国家甚至大洲运输的样品来说,由于运输途中缺乏冷藏设备所必须的供电装置,样品无法实现足够长时间的低温保存。
在很多生化研究中,分离完整的RNA是必不可少的一步。例如反转录mRNAs的复制,和当下流行的杂交法分析mRNA的丰度。在我们对乳酸脱氢酶基因表达调控机制的研究中,需要从不同哺乳动物组织中的多个样品提取大量的RNA,而这必不可少的一步却是传统方法所无法很好完成的。基于异硫氰酸胍的方法对动物组织效果不佳,因为与细胞不同的是,用此方法处理过得组织含有大量碎片,并会与溶液中的RNA作用,导致在CSCl离心法分离RNA的过程中,一部分RNA会吸附在离心管壁上,从而降低了分离的RNA的浓度。加入肝素的缓冲溶液可以减少RNA的吸附,但其代价昂贵并且效果不稳定。
有文献报道称金精三羧酸(ATA)是一种有效的抑制剂,它可以抑制包括核糖核酸酶在内的许多与核酸结合的酶的活性。随后有研究表明在一系列核糖核酸抑制剂中,ATA效果最佳,即在25℃分离老鼠和蟾蜍肝脏细胞RNA的实验中,加入ATA的样品中的RNA的浓度和长度都保持的最好。ATA抑制核糖核酸酶活性的原理是与RNA直接竞争该酶上的活性中心,从而降低RNA与核糖核酸酶结合的概率。
然而,ATA也会与RNA或DNA结合,从而导致用该方法分离出的RNA或DNA中混有相当浓度的ATA,可能对生物样品的检验产生影响。
通过有识别力的标记物标记特定的白细胞从而检测其含量已经成为一种常规的检测药物是否有效的方法。该方法已经应用于包括HIV/AIDS在内的多种疾病。实际上用流式细胞术检测CD4+T细胞含量是当下检验病人接受抗逆转录病毒治疗效果的黄金标准。然而此方法的一个重要局限在于随着样品储存和运输时间的延长,表型标记物变得越来越不稳定。美国疾病控制预防中心出台标准,建议对CD4+T细胞的分析应该在用含有K3EDTA或者肝素的血液采集管收集样品后的72小时内完成。但是一般情况下,来自存放超过48小时的样品的检验结果就被认为不可信。因此延长样品在室温下保存的寿命会减少临床检验中的误差,从而提高了流式细胞术检测病人生理指标的可重复性。另外,延长血液样品室温保存时间可能减少临床上进行流式细胞术的整体成本。运输的成本也会降低因为样品不再需要隔夜送达。对检验方来说,由于几天的样品可以集中处理,从而节省了仪器运转、维护的成本,也节省了人力。最后提高样品在室温下的稳定性减少了过期样品的数量,从而节省了样品重新采集及处理费用。延长样品保存时间最大的价值体现在欠发达国家和地区。住在农村地区的病人由于远离往往位于城市中的医院或实验室,从而无法将血液样品及时送达。根据联合国艾滋病规划署2003年底的统计数据,世界范围内大概有四千万人口感染了HIV/AIDS,将近三分之二的感染人口住在撒哈拉以南非洲(联合国艾滋病规划署2004年数据)。最近的报告显示资源匮乏的国家缺乏诊断和监测艾滋病感染人群的手段,部分原因是由于血液样品在送达实验室之前就已经变质。为了克服样品运输过程中变质的问题,发展流式细胞检测分析法以外的其他方法成为了必须。其中最著名的是ELISATRAxCD4检测试剂盒(TCellDiagnostics,Cambridge,MA,USA)。当样品浓度高于200细胞每微升的时候,该方法取得了与流式细胞术类似的检验结果。但是当细胞浓度低于200细胞每微升时,由于该方法无法给出准确结果使得38%的病人无法得到诊断。值得一提的是TRAx检测试剂盒不久后就将停止生产,使得重复已发表的实验结果困难重重。
代谢抑制剂:以下所述代谢抑制剂的作用得到了检测:碘乙酸钠、氟化钠、氟代乙酸钠、丙二酸钠、2,4-二硝基苯、叠氮化钠、乌本苷和环己酰亚胺。其用于检测时的浓度均为10-3M。能够抑制糖酵解过程的碘乙酸盐对细胞吞噬作用同样有强烈抑制效果。这个现象证实了糖酵解是细胞吞噬作用的主要能量来源。与此相反,氟化物虽然也能有效抑制糖酵解过程,但是对细胞吞噬作用并没有影响。其原因可能在于氟化物只能在体外非生理温度(0℃)情况下阻碍无氧糖酵解过程。氟乙酸盐和丙二酸盐是两种干扰克雷布斯循环(柠檬酸循环)的化合物,并不抑制细胞吞噬作用,但是众所周知的是在巨噬细胞中克雷布斯循环的活性受到了极大的抑制。2,4-二硝基苯和叠氮化钠,作为抑制氧化磷酸化过程的两种化合物,与细胞接触三小时后即产生对细胞吞噬作用的抑制效果。乌本苷阻碍Na+和K+通过细胞膜的运输,干扰了细胞膜的正常运动,从而抑制了细胞吞噬作用。环己酰亚胺影响细胞吞噬作用的机理还在进一步调查当中。这类化合物可以抑制蛋白质的合成,很有可能是通过对细胞膜再生的影响来调控细胞吞噬作用。
固定剂:在组织学、病理学和细胞生物学领域,固定是组织切片准备的关键一步,它可以保持生物组织不衰退,从而使组织不发生自溶和腐烂。组织的结构是由细胞周围大分子的形状和大小来决定的。细胞内的大分子主要是蛋白和核酸。固定作用可以终止任何进行中的生化反应,也可以增强相关组织的机械强度和稳定性。组织固定的广泛意义在于准备染过色的组织薄切片时保持细胞和组织不受损坏。其作用机理为通过凝固的方式使蛋白质变性,或形成加成化合物,或二者兼有。能与两种不同的大分子反应并将它们结合在一起的化合物通常能最有效的稳定这些大分子的结构,这种现象被称作交联。固定组织有以下几种目的:第一,杀死该组织从而防止自我分解和腐败。第二,保持生物样品(组织或细胞)的自然状态从而取得可靠性高的检验结果。一个好的固定剂需满足以下几个条件:第一,使体内固有的生物大分子失活—特别是可以消化或破坏样品蛋白水解酶。第二,保护样品免收外界干扰。固定剂对组织样本中存在或者固定后增殖的大多数常见微生物是有毒性的(尤其是细菌)。
另外,许多固定剂可以通过化学作用改变被固定材料的性质,使得它对于机会性微生物(opportunisticmicroorganisms)不具有诱惑性(消化不了或者存在毒性)。最后,固定剂通常可以在分子水平改变细胞或组织来增强它们的机械强度和稳定性。这种增强的强度与刚度可以更好地保护样本的形态(形态与结构)用于后期分析。
PCR聚合酶抑制剂:Taq聚合酶或多或少可以被生化实验或分子生物学试验中使用的多种化学物质抑制活性。这些化学物质包括DMSO、EDTA、盐酸胍盐、尿素、琼脂和琼脂糖。DNA分离流程中的某些化学物质也具有抑制作用,>5mM的醋酸钠、0.005%甲基溴化铵、0.005%的钠十二烷基硫酸盐或者>20%的甲酰胺,在给定的浓度中这些化学物质都属于完全抑制剂。其他重要的抑制因素包括RNA酶抑制剂金精三羧酸(ATA)和血液抗凝剂等,它在低至0.01ug/ml便具有抑制PCR扩增的作用。植物类多糖如多聚糖、酸性粘多糖、茶多酚、米淀粉、果胶、硫酸葡聚糖和β-葡聚糖等也具有一定的抑制性。最后,紫外照射聚苯乙烯类塑料,这常用于如微量滴定盘的杀毒灭菌,可以释放出水溶性Taq聚合酶抑制剂。
防腐剂:防腐剂是一种添加到包括食物、药品、颜料、生物样品、木材和饮料等产品中的物质,它可以阻止细菌生长造成的腐败变质作用或者其他不良化学变化。通常来说防腐可以通过两种途径来实现:化学方法和物理方法。化学防腐需要添加化学物质进产品中。物理防腐需要冷藏或者干燥。他们运用于食物、化妆品和多种其他产品中。食物防腐添加剂可以减少食物来源的感染、减少微生物造成的损害、保持食物新鲜性和营养价值。一些物理防腐技术包括脱水、紫外线照射、冷冻干燥和冷藏。而化学防腐和物理防腐经常联合使用。
抗菌剂可以防止细菌造成的降解作用。一种非常传统和古老的抗菌方法是通过酸洗和加蜂蜜改变pH值水平来抑制微生物的生长。当前通用的抗菌防腐剂是乳酸。常用的抗菌防腐剂在下面列出。硝酸盐类和亚硝酸盐类也属于抗菌剂。这些化合物抗菌的机理为抑制细菌生长或抑制某些特异性酶的活性。
常见的防腐剂如:苯甲酸、苯甲酸钠、羟苯酸盐、乳酸、亚硝酸盐、硝酸盐、丙酸、丙酸钠、二氧化硫、亚硫酸盐、山梨酸和山梨酸钠。
苯酚和苯二胺的衍生物(比如,A、B式所示化合物)是汽油中常用的抑制粘性物质形成的抗氧化剂。
抗氧化剂:抗氧化剂是一种可以阻止其他分子被氧化的分子。氧化作用是导致电子丢失或者氧化态升高的化学反应。氧化反应过程可以产生游离自由基,然后这些游离自由基可以启动连锁反应。当这些连锁反应发生在细胞中的时候,便会造成细胞的损伤或者凋亡。抗氧化剂可以依靠清除游离自由基中间产物来终止连锁反应,也可以抑制其他氧化反应过程。它们实现这个作用的方式是自身被氧化,所以很多抗氧化剂是还原剂,比如硫醇、抗坏血酸(维生素C)和多酚类。
虽然氧化反应对生命至关重要,但也具有破坏性;在植物和动物复杂的系统中包含着多种类型的抗氧化物,例如谷胱甘肽,维他命C,维他命A,维他命E以及一些包括过氧化氢酶,超氧化物岐化酶和多种氧化物酶在内的酶。抗氧化剂含量不足或者抗氧化酶活性受到抑制,都会导致氧化应激从而损坏或者杀伤细胞。氧化应激通过含氧分子过度反应和慢性炎症对细胞结构和功能造成损伤。氧化应激在人类多种疾病中扮演较为重要的角色,包括癌症。在药理学,针对抗氧化的研究较为深入,尤其是针对中风和神经退行性疾病的治疗。由于这些原因,氧化应激可以被认为是一些疾病的原因和后果。
抗氧化剂广泛用作膳食补充剂,研究显示它们可以用于预防多种疾病,比如癌症、冠心病和高原反应。虽然最开始的研究显示抗氧化剂补充剂可以改善健康,但后来针对β-胡萝卜素、维生素A和维生素E单独或复合使用的大量实验表明补充剂无法降低死亡率甚至可能增高死亡率。在随机样本实验中,受试者服用抗氧化剂如β-胡萝卜素、维生素E、维生素C和硒后,患癌症的风险并没有降低,甚至有的会增高。补充硒或者维生素E没有降低心血管疾病的发生风险。
氧化反应使很多食物变质,尤其是那些富含脂肪的食物。当暴露在氧气中时,脂肪会快速变得腐臭。抗氧化剂可以预防或抑制氧化反应过程。最常用的抗氧化剂添加物是抗坏血酸(维生素C)和抗坏血酸盐。因此,抗氧化剂常添加进油、奶酪和薯条中。其他的抗氧化剂包括苯酚衍生物水杨酸、丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚和没食子酸丙酯。这些药剂可以抑制氢过氧化物的形成。其他的防腐剂包括乙醇和甲基氯异塞唑晽酮。
常见的抗氧化剂如:抗坏血酸、抗坏血酸钠、丁羟甲苯、叔丁基羟基茴香醚、没食子酸、没食子酸钠、二氧化硫、亚硫酸盐和生育酚。
体内的大部分的核酸物质(DNA和RNA)都处于细胞中,但是循环血液中也可以发现相当数量的胞外核酸。从Mandel和Metais在1948年发现游离DNA开始,科研人员发现利用游离DNA可以从两个方面追踪和鉴别癌症患者:一是游离DNA水平的升高;二是肿瘤相关特异性游离DNA的出现。肿瘤特异性游离DNA被发现存在于多种癌症中,有限性列出如下:血液、结直肠、胰腺、皮肤、头颈部、肺部、乳房、胃、前列腺和子宫等相关癌症。这说明游离DNA是所有癌症的特点,可能反应癌症的病理过程,这可以用于癌症诊断、监控疾病进展和确定治疗效果等。这些血液中游离的DNA和RNA的来源可能有两种。一种是细胞合成新的核酸并将它们主动释放进入循环系统。另一种是细胞坏死或凋亡后核酸被动进入循环系统。
发明内容
本发明提供了一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用。本发明提供的技术方案在保证样本完整性和稳定性的前提下,允许生物样品(比如,血液样本)更长时间的储存和运输,有利于提高生物样品的检测精度和准确性。本发明提供的生物样品稳定试剂,可选地,根据不同的生物样品,还可包括其他本领域可接受的基质、载体、稀释剂等。
本发明提供的生物样品采集装置包括本发明提供的生物样品稳定试剂;其形式可以是试管、袋子和玻片等采集容器,材质不限于PET、玻璃等,采集容器内设置有本发明提供的生物样品稳定试剂。本发明提供的生物样品采集系统包括了本发明提供的生物样品采集装置。在本发明的一个实例中,本发明利用含有基质的新型血液采集管去采集和保存含有白细胞和红细胞的血液样本,在室温中储存14天后仍然可以保持细胞的稳定性,并准确用于血清游离DNA和RNA的测试和流式细胞技术对细胞免疫表型的测试。14天的稳定期给予样品充足的时间被转运到临床实验室进行检验,同时又保证了样品的质量不受长时间存放的影响,以及检验的结果的可重复性。本样本稳定系统(包括本发明所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置和试剂中的至少一种)可以满足用户工作中对样品稳定性的要求。本发明允许采集、运送和储存生物样品中的细菌、病毒和其他生物目标,从而促进性传播疾病和病原体的检测,以及基因组分析、基因表达和肿瘤标记物的研究。
延长免疫抗原稳定性并通过流式细胞术来监测病人对多种疾病的免疫调控具有重要现实意义。此项技术将会得到更广泛的应用如果可以在任何一个工作日采集样品并在最多两周后才进行检验,即方便了样品存储和运输。两周时间的稳定性可以减少因为样本过期而产生的多余开支,并为分子生物学检测和流式细胞述检测等临床实验室提供更大灵活性。样品稳定性延长的最大价值在基础资源差的国家更能得到体现。尤其重要的是,对这些能够稳定保存较长时间的样品来说,其检验结果的精确度和准确率也得到了保证。
本发明找到了一个强健可靠的方法稳定待检验的生物样品,比如在血液样本中检测血清游离DNA和RNA水平。它的关键是既要保证血细胞的稳定性避免胞内DNA和RNA释放进入血清又要保护血清游离DNA和RNA不被核酸酶降解。
本发明提供了一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂特别适合在缺少冷藏、冷冻条件下长时间保持细胞活性和保护核酸。可以理解的是,本发明提供的技术方案并不排除同时采用冷藏、冷冻等保存措施。本发明保障了尿液、血液、唾液和其他生物液体的分析的精度。
采血后血液样本中的血细胞被固定住,以避免细胞中的DNA和RNA渗漏进血清中;血细胞中的全部DNA和RNA在采血的时候被完好保存的原因是血细胞的蛋白表达谱被固定了,这样细胞的蛋白表达谱便能一直保持和采血时候一致;并且血清游离DNA和RNA可以通过核酸酶和蛋白质酶的复合作用保持稳定。
本发明涉及的一种样品检验为从血液样本中分离出游离的DNA和RNA,然后分析游离的RNA来确定特定疾病的存在与否和严重程度。该样品可以直接用PCR或者RT-PCR的方法来分析并确定特定疾病的存在与否和严重程度。
本发明一实施例中,将蛋白酶抑制剂、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂,氧清除剂、三重态猝灭剂、和能量来源的ATP等混合在一起作为保存基质,再和一个亲水的载体结合在一起,使其能在接触生物样本后非常容易释放并再水化,即时保留住了生物样本的完整性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同配方的生物样品稳定试剂采集的DNA样品的稳定性随时间的变化结果;
图2为本发明实施例提供的不同配方的生物样品稳定剂处理的临床样品中目标DNA的检测-模拟游离DNA的检测结果;
图3为本发明实施例提供的生物样品稳定剂处在不同温度下对核酸酶抑制剂效果的检测结果;
图4为本发明实施例提供的流感取样的扩增流程示意图及检测结果。
具体实施方式
恰当保存DNA、RNA、蛋白质(包括抗原、抗体)和细胞对检验分析的可靠性意义重大。通常保存和运输这些样品需要昂贵的设备和电源,比如冰箱和发电机等。但即便如此,冷冻保存以上生物样品仍是现在普遍的做法。针对该问题,本发明提供了一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用。本发明提供了的技术方案在常温条件下可使采集的生物样品(特别是血液样品)较长时间地保持初始状态。
本发明适用于在常温下保存生物样品。所述生物样品包含但不局限于DNA、RNA、血液、血清、血浆、唾液、尿液、器官、阴道分泌物、心包腹部和其他体腔的体液、细胞、器官培养基、口腔拭子、细菌、病毒、PCR产物、克隆的DNA、蛋白质和组织。
第一方面,本发明提供了的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂,包括但不限于抗氧化剂、抗微生物剂、抗真菌剂、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂、颗粒酶抑制剂、细胞粘着抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、和蛋白酶抑制剂。
在本发明一实施例中,本发明提供了的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂包括如下组分:质量分数0.1%~1.5%的DNA酶抑制剂;质量分数0.2%~2%的RNA酶抑制剂;质量分数10%~20%的固定剂/防腐剂;质量分数0.01%~1%的代谢抑制剂;质量分数0.5%~5%的抗氧化剂;质量分数5%~15%的三线态淬灭剂;质量分数5%~15%的再水化强化剂;余量为水。
在本发明一实施例中,所述DNA酶抑制剂为乙二胺四乙酸二钾盐、乙二胺四乙酸三钾盐、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、四钠盐和三甲基胺三乙酸二钠盐中的至少一种。所述DNA酶抑制剂与样品混合前其浓度优选为0.5g/L~2.0g/L。
在本发明一实施例中,所述RNA酶抑制剂为金精三羧酸(ATA)、人体胎盘蛋白、焦碳酸二乙酯、乙醇、甘油醛、氟化钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲酰胺、氧钒根-核糖核苷复合物、膨润土、肝素、羟胺-氧-铜离子、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓糖醇、三羧甲基磷酸(TECP)。所述RNA酶抑制剂与样品混合前其浓度为避免RNA降解所需添加的最低浓度,该浓度由琼脂糖凝胶电泳来测定。
在本发明一实施例中,所述固定剂/防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、羟苯酸盐、乳酸、亚硝酸盐、硝酸盐、丙酸、丙酸钠、二氧化硫、亚硫酸盐、山梨酸、山梨酸钠、尿素醛、咪唑烷基脲、二羟甲基尿素、溴硝丙二醇、恶唑烷、羟甲基甘酸钠、5-羟甲基-1-氮杂-3,7-二氧杂二环[3.3.0]辛烷、季金刚以及任意几种的组合。所述固定剂/防腐剂与样品混合前其的浓度优选为小于等于5g/L血液样品。
在本发明一实施例中,所述抗氧化剂为抗坏血酸(维生素C)、抗坏血酸盐、苯酚衍生物丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)和丙酯。所述抗氧化剂与样品混合前,抗氧化剂浓度优选为0.2g/L~3.0g/L。
在本发明一实施例中,所述代谢抑制剂为碘乙酸钠、氟化钠、氟代乙酸钠、丙二酸钠、2,4-二硝基苯、叠氮化钠、乌本苷和环己酰亚胺。所述代谢抑制剂与样品混合前,代谢抑制剂的浓度优选为0.05g/L~1.0g/L。
在本发明一实施例中,所述亲水性聚合物为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、海藻糖、甘露醇、二甲苯、牛血清蛋白。所述亲水性聚合物与样品混合前所述清水聚合物浓度优选为0.5g/L~1.0g/L。
在本发明一优选实施例中,本发明提供了的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂包括如下组分:质量分数0.1%~1.5%的DNA酶抑制剂(优选为乙二胺四乙酸二钾盐);质量分数0.2%~2%的RNA酶抑制剂(优选为金精三羧酸(ATA));质量分数10%~20%的固定剂/防腐剂(优选为尿素醛);质量分数0.01%~1%的代谢抑制剂(优选为氟化钠);质量分数0.5%~5%的抗氧化剂(优选为抗坏血酸钠);质量分数5%~15%的三线态淬灭剂(优选为水溶性维生素E(Trolox));质量分数5%~15%的再水化强化剂(优选为水溶性聚合物聚乙二醇或海藻糖);余量为水。
本发明提供的生物样品稳定试剂能保护、稳定生物样品的活性,使之与样品采集之前相比,活性基本没有改变,并且长时间保存后活性基本不受影响。特别地,本发明提供的生物样品稳定试剂能维持生物样本的细胞不破裂,使样本中不产生新的DNA而干扰游离循环DNA。
在本发明一实施例中,本发明提供了的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂还包括其他本领域可接受的基质、载体、稀释剂等。
第二方面,本发明提供了一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法,包括将生物样品与如第一方面所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触。
在本发明一实施例中,所述的将生物样品与如第一方面所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触的步骤包括:采集的新鲜生物样品,如血液样品,放入采集容器中并与保护试剂充分混合(可选地,可按如下体积或重量比加样:每1份生物样品稳定试剂加入50份样品)。
在本发明一实施例中,所述的将生物样品与如第一方面所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触的步骤包括:以雾化干燥的方式将所述生物样品稳定试剂加入样品采集容器,然后加入生物样品(可选地,可按如下体积或重量比加样:每1份生物样品稳定试剂加入50份样品)。
在本发明一实施例中,采集的新鲜生物样品,如新鲜血液与生物样品稳定试剂充分混合14天后,血液中游离DNA和游离RNA的含量不低于刚采集时的80%以上、85%以上、90%以上或95%以上。
在本发明一实施例中,采集的新鲜生物样品,如新鲜血液与生物样品稳定试剂充分混合14天后,血液中游离DNA和游离RNA的含量是不加生物样品稳定试剂的样品的30~60倍。
在本发明一实施例中,采集的新鲜生物样品,如新鲜血液与生物样品稳定试剂充分混合14天后,直接采用聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对DNA和RNA(包括但不限于基因组DNA、游离DNA、总RNA、mRNA或游离RNA)进行扩增。
在本发明一实施例中,采集的新鲜生物样品,如新鲜血液与生物样品稳定试剂充分混合14天后,直接采用聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对游离DNA和游离RNA进行扩增,从而避免使用QIAAMPDNA血液试剂盒可能造成的游离DNA和RNA的损失。
本发明提供的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法,可在室温下保存DNA、RNA、蛋白质(包括抗原、抗体)和细胞。
第三方面,本发明提供了一种供的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置,包括采集容器,所述采集容器中设置有本发明提供的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂。
常见地,所述装置可设计为采集管,采集袋等采集容器,其中,采集容器内设置有本发明提供的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂,可选地,根据不同的生物样品,还可包括其他本领域可接受的基质、载体、稀释剂等。在本发明一实施例中,所述采集管为采用玻璃或塑料制作;所述采集袋为采用塑料制作;可选地,玻璃为硅硼玻璃或石英玻璃,塑料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)或聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)。为方便运输,采集管还包括配套使用的胶塞或管盖,可选地,胶塞采用橡胶制作,如丁基橡胶,可选地,胶塞可用与采集管配套的铝塑膜替代。
在本发明一实施例中,本发明中的生物样品保存装置由试管和试管盖组成。其大小可能与市场销售的标准装置相同或不同。每一个保存装置都配有一个可以旋紧密封盖。该保存装置可以由喷射造型法生产完成,可以整体成型或由多个部分拼装完成。
在本发明一实施例中,每一个试管装有5ml~100ml液体样品,优选5ml~30ml。样品量为0.01μg~1000μgDNA、RNA、蛋白质、血液、尿液、病毒、细菌、细胞、组织、细胞提取物、组织提取物、代谢物、化合物和其他材料等。
本发明的试管可以盛装液态、固态或固液态混合的生物样品和材料。在本发明一实施例中,本发明的试管还包括固态基质材料,比如像海绵一样的材料、二氧化硅、二氧化硅粉末、二氧化硅滤纸、粉末状吸收剂等可以被添加到试管中,然后通过物理或化学作用与生物样品结合。这些作用包括吸附、特异性和非特异性结合、共价或非共价化学键、亲水或疏水作用、氢键、静电作用等。
在本发明一实施例中,本发明将一种高分子材质的可溶解基质材料涂于试管内壁,形成三维空间结构,从而使生物样品能够与基质更充分的结合。该可溶解基质材料可以用来引入生物样品稳定剂,如脱水的(干燥的或不含溶剂的)盐或缓冲试剂。该基质可以调节pH和其他参数,优化干燥和样品保存条件。常用的基质材料为水溶性聚合物,如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)。其他可以与生物样品兼容的水溶性材料也可以做为基质,例如琼脂糖、聚-N-乙烯基乙酰胺(PNVA)、聚-4-乙烯基吡啶、聚苯醚、可逆交联聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚交酯、丙交酯/乙交脂共聚物、羟基甲基共聚物、果胶酸钙、羟丙甲纤维素。
在本发明一实施例中,试管的材质为玻璃或者塑料,比如聚丙烯、聚丙乙烯等。可选地,将可溶解的基质材料通过以下方式进行干燥,进而将基质材料牢固地固定在试管内壁:室温下空气干燥,和/或适当高温下空气干燥,和/或减压干燥(部分或全部真空),和/或在适当的气流中(过滤空气、二氧化碳、氮气或其他惰性气体),和/或其他干燥方法。干燥过程后也许达到完全干燥(比如依照统计学方法,全部或者所有可检测到的溶剂都已被除去)或部分干燥,这样才能满足容纳生物样品的标准。
在本发明一实施例中,可溶解基质中可以加入一种或几种常规的生物抑制剂或生化抑制剂。
第四方面,本发明提供了一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集系统,包括本发明提供的一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置,还包括聚合酶链式反应(PCR)和/或逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂或试剂盒。
第五方面,本发明提供了一种如第一方面所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂或如第四方面所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置在采集、运输、存储或检测生物样品中的应用。尤其是针对DNA和/或RNA样品的检测。
本发明所描述的实施例和装置仅起到说明作用,实际生产过程中会有很多修饰和改变,这些修饰和改变也包括在本发明的精神和权限当中。若无特殊说明,本发明采用试剂均为行业内常规试剂。
实施例1配置提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂
本发明提供的生物样品稳定试剂可按照行业常规方法配置。在本实施例中,配置生物样品稳定试剂时,首先将生物样品稳定试剂的各组分(如表1所示,表中个组分均为化学分析纯)按重量份称重或量取后加入烧杯,再加入溶剂水(无菌去离子水),搅拌均匀,装入试剂瓶,常温备用。也可将配置好的生物样品稳定试剂放入采集容器(比如采集管或采集袋)中,制备获得本发明的生物样品采集装置。
表1.生物样品稳定试剂的各组分及含量(重量百分比%)
后续使用本发明提供的生物样品稳定试剂或生物样品采集装置时,将含有大量血细胞的生物样品(比如血液样品)与生物样品稳定试剂混合均匀即可,每5mL血液样品与0.1mL生物样品稳定试剂混合。以雾化干燥的方式将所述生物样品稳定试剂加入样品采集容器,然后加入生物样品。
实施例2不同配方的生物样品稳定剂采集的DNA样品的稳定性随时间的变化
本实施例在采用实施例1不同配方的生物样品稳定试剂和不同保存时间下对掺有DNA酶I的目标DNA进行琼脂糖凝胶分析。具体来说,针对同一合成的目标DNA样品(320bp),分别设置如下实验组:
阳性对照组:目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解I;
处理对照组:
目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解,加入DNA酶I至终量为0.1U,4℃冷藏24小时;
目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解,加入DNA酶I至终量为0.1U,4℃冷藏48小时;
目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解,加入DNA酶I至终量为0.1U,25℃放置24小时;
加生物稳定剂的实验组:
目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解,与水按体积比5:0.1加入配方A,再加入DNA酶I至终量为0.1U,25℃放置24小时;
目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解,与水按体积比5:0.1加入配方B,再加入DNA酶I至终量为0.1U,25℃放置7天;
目标DNA(30纳克),无菌去离子水溶解,与水按体积比5:0.1加入配方C,再加入DNA酶I至终量为0.1U,25℃放置14天;
将上述不同实验组处理后的目标DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖含量为2%,采用SafeDNA着色剂染色。凝胶电泳结果如图1所示。
在图1中,M:100个碱基对的DNA梯状图谱;1:阴性对照-水;2:阳性对照-目标DNA(320碱基对,30纳克);3:目标DNA(30纳克,4℃24小时);4:目标DNA(30纳克,4℃48小时);5:目标DNA(30纳克,25℃24小时);6:目标DNA+配方A(30纳克,25℃24小时);7:目标DNA+配方B(30纳克,25℃7天);8:目标DNA+配方C(30纳克,25℃14天)。
由图1可知,结果表明采用本发明的技术方案可在室温下将目标DNA的保护时间可以延长到14天。
实施例3不同配方的生物样品稳定剂用于对临床样品中目标DNA的检测-模拟游离DNA的检测
本实施例模拟了临床样品中目标DNA的检测标准步骤。将血液样品存放于本发明提供的生物样品稳定装置中,具体为:将5.0ml本发明提供的不同配方的生物样品稳定试剂分别分散于1.0ml血清中。混合均匀,存放于室温下或4℃环境中。合成DNA序列折算成血液样品总DNA含量,加入灭菌去离子水,按照比例与不同配方的生物样品稳定试剂混匀,保存不同时间后进行PCR。
阳性对照组DNA被冷冻在-20℃(合成的DNA序列,序列为SEQUENCENO.1所示)。
PCR扩增目标DNA时,针对目标DNA的特异引物(正、反向引物序列分别为SEQUENCENO.2和3所示)浓度均为0.2μM,核苷酸浓度为100μM。反应混合物被转移到PCR管,并加入Taq酶和SYPRDNA着色剂。反应在TheStepOnePlusTMReal-TimePCR仪器上进行40个循环。PCR分析分别在样品存放一周和两周后进行。
具体地,各序列如下所示:
SEQUENCENO.1:
3’-AATTGGAAGCAAATGACATCACAGCAGGTCAGAGAAAAAGGGTTGAGCGGCAGGCACCCAGAGTAGTAGGTCTTTGGCATTAGGAGCTTGAGCCCAGACGGCCCTAGCAGGGACCCCAGCGCCCGAGAGACCATGCAGAGGTCGCCTCTGGAAAAGGCCA-5’
SEQUENCENO.2:5’-TTAACCTTCGTTTACTGTAGTGTCG-3’
SEQUENCENO.3:3’-CAGAGGTCGCCTCTGGAAAAGGCCA-5’。
结果如图2(Comparisonw/andw/ostabilizers)所示,图2为不同配方的稳定剂下临床样品中模拟游离DNA的检测。在图2中,曲线1:目标DNA(4℃,24小时);曲线2:目标DNA(4℃,48小时);曲线3:目标DNA(25℃,24小时);曲线4:阴性对照-水;曲线5:阳性对照-目标DNA;曲线6:目标DNA+配方A(25℃,24小时);曲线7:目标DNA+配方B(25℃,7天);曲线8:目标DNA+配方C(25℃,14天)。其中,曲线5为阳性对照,曲线6-8为含有稳定剂的。图2表明与冷冻DNA对照组相比,在一周和两周时间点目标DNA的扩增速率没有降低。
实施例4不同温度下核酸酶抑制剂效果检测,使得核酸酶活性可受温度调节
本实施例描述了本发明中所使用的核酸水解酶抑制剂(包括本发明生物样品稳定试剂中的DNA酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂)如何通过温度来控制DNA聚合酶活性。图3为不同温度下核酸酶抑制剂效果检测。图3说明了能有效控制目标DNA扩增的核酸酶抑制剂的最佳浓度。实验发现在65℃时,1-2.5mM,优选为2mM浓度的核酸酶抑制剂条件下,本发明生物样品稳定试剂中的DNA酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂对DNA的扩增抑制影响最小。
因此,可以在不需要任何修饰过的聚合酶前提下直接进行热启动PCR。结果说明生物样品稳定试剂中含有的核酸水解酶抑制剂在一定温度条件下不会干扰平常的PCR反应。
实施例5
为了进一步说明本发明的有益效果,本发明采用不同的配方的生物样品稳定试剂(参见表2),重复实施例1-2的步骤,并对14天后每个血液样品中游离DNA和游离RNA的含量进行如下检测:
1、以刚采集时的血液中的游离DNA和游离RNA的含量为对照1,检测每个样品14天后,相对于刚采集时的血液中游离DNA和游离RNA的含量百分比。
2、以不加本发明的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂的血液样品为对照2,检测每个样品14天后,相对于对照组,血液中游离DNA和游离RNA的含量。
结果如表2所示:
表2.不同的配方的生物样品稳定试剂对血液样品的保存效果
对比实施例
为了更进一步说明本发明的有益效果,本发明还提供了对比实施例,实验步骤如下:
参照申请号为CN201410036576.3的专利申请说明书[0018]段-[0021]段的实施例1和实施例2,配置如下组分1和组分2(表3所示,根据该专利说明书的描述,以抗凝剂EDTA盐为1个重量份,其他组分的含量均为以抗凝剂为参照的倍数关系,其中,抗凝剂EDTA盐按照行业标准YY0314-2007配置,即1.5-2.2mg/mL血液):
表3.对比配方的组分及含量
1、以刚采集时的血液中的游离DNA和游离RNA的含量为对照1,检测每个样品14天后,相对于刚采集时的血液中游离DNA和游离RNA的含量百分比。
2、以不加本发明的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂的血液样品为对照2,检测每个样品14天后,相对于对照组,血液中游离DNA和游离RNA的含量。结果如表4所示。
表4.对比配方与本发明提供的生物样品稳定试剂配方效果比对
综上,本发明提供了的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂,可在室温或高温条件下收集、并长时间储存生物样品,有利于生物样品的稳定性,从而提高测试的精度和准确率。
效果实施例直接对生物样品稳定试剂保存的生物样品进行RT-PCR检测
本发明实施例采用引物:
Primer1(SEQUENCENO.4):
CNIC-H7F5'-AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA-3'
Primer2(SEQUENCENO.5):
CNIC-H7R5'-GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG-3'
Primer3(探针引物,SEQUENCENO.6)
CNIC-H7P5'FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3'
本实施例的待检测样品:流感病人的喉咙分泌物(throatswap)放入200uL本发明实施例1提供的生物样品稳定试剂(配方C),室温孵育10分钟后,所获得的经过处理的Swap样品直接进行RT-PCR。设置空白对照组:水(RNasefree)。实验全程在安全厨(biohazardsafetyhood)中进行。
本实施例的检测步骤:
(1)室温溶解RT-PCRMasterMix试剂和引物
(2)取经过处理的Swap样品,在PCR管中配制如下RT-PCR反应体系(每个体系25uL):
(3)按照如下程序进行实时RT-PCR(Real-timeRT-PCRdetection),逆转录和PCR程序如下:
(1)45℃10min(2)95℃10min(3)95℃15s(4)60℃45s;
步骤(3)-(4)循环40cycles。
检测结果如图4所示。图4为本发明实施例提供的流感取样的扩增流程示意图及检测结果。结果显示,本发明提供的生物样品稳定试剂处理后的样品,可以直接用于常规的逆转录反应或PCR反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂,其特征在于,包括:质量分数0.1%~1.5%的DNA酶抑制剂;质量分数0.2%~2%的RNA酶抑制剂;质量分数10%~20%的固定剂/防腐剂;质量分数0.01%~1%的代谢抑制剂;质量分数0.5%~5%的抗氧化剂;质量分数5%~15%的三线态淬灭剂;质量分数5%~15%的再水化强化剂;余量为水。
2.如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂,其特征在于,还包括基质、载体和稀释剂中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂,其特征在于,所述DNA酶抑制剂、所述RNA酶抑制剂、所述固定剂/防腐剂、所述抗氧化剂、所述代谢抑制剂、所述亲水性聚合物分别独立地选自如下1)-6)所示化合物:
1)所述DNA酶抑制剂为乙二胺四乙酸二钾盐、乙二胺四乙酸三钾盐、二亚乙基三胺五乙酸、四钠盐和三甲基胺三乙酸二钠盐中的一种或多种;
2)所述RNA酶抑制剂为金精三羧酸、人体胎盘蛋白、焦碳酸二乙酯、乙醇、甘油醛、氟化钠、乙二胺四乙酸、甲酰胺、氧钒根-核糖核苷复合物、膨润土、肝素、羟胺-氧-铜离子、硫酸铵、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓糖醇、三羧甲基磷酸中的一种或多种;
3)所述固定剂/防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、羟苯酸盐、乳酸、亚硝酸盐、硝酸盐、丙酸、丙酸钠、二氧化硫、亚硫酸盐、山梨酸、山梨酸钠、尿素醛、咪唑烷基脲、二羟甲基尿素、溴硝丙二醇、恶唑烷、羟甲基甘酸钠、5-羟甲基-1-氮杂-3,7-二氧杂二环[3.3.0]辛烷、季金刚以及任意几种的组合中的一种或多种;
4)所述抗氧化剂为抗坏血酸、抗坏血酸盐、苯酚衍生物丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚和丙酯中的一种或多种;
5)所述代谢抑制剂为碘乙酸钠、氟化钠、氟代乙酸钠、丙二酸钠、2,4-二硝基苯、叠氮化钠、乌本苷和环己酰亚胺中的一种或多种;
6)所述亲水性聚合物为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、甘露醇、二甲苯、牛血清蛋白中的一种或多种。
4.一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法,其特征在于,包括将采集的生物样品与如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触。
5.如权利要求4所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法,其特征在于,将采集的生物样品与如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触14天后,生物样品中游离DNA和游离RNA的含量是刚采集时的80%以上、85%以上、90%以上或95%以上。
6.如权利要求4所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法,其特征在于,将采集的生物样品与如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触14天后,采集的生物样品中游离DNA和游离RNA的含量是不加生物样品稳定试剂的样品的30~60倍。
7.如权利要求4所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法,其特征在于,将采集的生物样品与如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂接触后;采用聚合酶链式反应对基因组DNA或游离DNA进行扩增,或采用逆转录-聚合酶链反应对总RNA、mRNA或游离RNA进行扩增。
8.一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置,其特征在于,包括采集容器,所述采集容器中设置有如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂。
9.一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集系统,其特征在于,包括如权利要求8所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置,还包括聚合酶链式反应和/或逆转录-聚合酶链反应试剂或试剂盒。
10.一种如权利要求1所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品稳定试剂或如权利要求8所述的提高样品检测精度和准确性的生物样品采集装置在采集、运输、存储或检测生物样品中的应用。
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