CN112391381A - 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿液游离DNA提取试剂盒及其提取方法，用于尿液中游离DNA的提取；尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；本发明中的裂解结合液添加十二烷基磺酸钠作为裂解增强剂以提高游离DNA的提取量；二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10‑100mg/mL；本发明涉及的尿液游离核酸提取试剂盒包括具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作，提取方法简便易行。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法。
背景技术
循环游离核酸cfDNA，是指存在于人体的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括游离DNA、游离RNA和线粒体DNA等。cfDNA片段主要是来自于坏死的肿瘤细胞核凋亡的正常细胞、胎盘、组织等，cfDNA水平异常可以作为恶性肿瘤和妊娠相关性疾病和自身免疫病等越来越多的疾病诊断、治疗检测和预后评估的根据。
最近液态活检技术受到越来越多的关注，液态活检是以血液、尿液、唾液等体液为检测载体的一类非侵入性的检测方法。其原理为通过检测肿瘤细胞坏死释放到体液的物质，从而达到检测肿瘤的目的。而二代测序技术(next generation sequencing，NGS)以及数字PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)技术的出现，使得在大量非肿瘤DNA中找到微量的肿瘤DNA(Tumour DNA，tDNA)成为可能。因此也为液态活检从尿液检测DNA提供了相应的可能性。
游离DNA的提取成为检测的关键步骤，传统使用的试剂沉淀法需要用到酚，氯仿，乙醇等存在一定的毒性的试剂，尤其是酚、氯仿具有致癌的潜在风险，且实验过程中需要配置的试剂量多，降低核酸提取效率。而采用离心柱方法的缺陷在于处理的样本体积收到离心柱的体积限制，离心操作费时，没办法进行高通量提取。
因此，亟待一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的尿液游离核酸提取试剂盒及其提取方法的出现，用于尿液中游离核酸的提取。
试剂盒提取游离DNA的步骤主要为样本裂解、磁珠结合、磁珠洗涤、磁珠干燥、洗脱。其中，样本裂解效率对最终的游离DNA提取量影响很大，裂解不充分会导致后面所有步骤提取的游离DNA回收率明显降低，所以裂解效果的增强是至关重要的。本发明研究了一种优化后的裂解液配方并添加一种阴离子表面活性剂作为裂解增强剂以提高游离DNA的提取量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的尿液游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于尿液中游离核酸的提取。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，所述尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；裂解结合液添加裂解增强剂提高裂解效果；
所述二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；
所述裂解结合液包括以下组分：
1-20mg/mL蛋白酶K；
1.1～15M离液盐；
0.1-0.5M苯甲酸钠；
5％Triton X-100；
0.1-1％十二烷基磺酸钠；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.1-5％柠檬酸钠；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
1-10mM乙二胺四乙酸二钠；
10-50％异丙醇；
无菌纯化水。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述离液盐包括1-10M异硫氰酸胍和0.1-5M盐酸胍的混合液。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸钾中一种或多种。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述裂解增强剂为一种商标为CATO的十二烷基磺酸钠阴离子表面活性剂，易溶于水，与阴离子、非离子复配伍性好，具有良好的乳化、渗透、和分散性能。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述裂解增强剂含量在裂解结合液中占0.1-1％。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；
所述第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
0.01-0.5％十二烷基硫酸钠溶液
10-30％异丙醇；
所述第二清洗液为75％乙醇。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述洗脱液为无菌纯化水。
另一方面，公开了上述基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
S2、在尿液样本中加入裂解结合液，得到具有游离DNA的第二混合液；
S3、将第一混合液与第二混合，得到具有纳米磁珠-核酸复合物的第三混合液；
S4、通过磁力对第三混合液中的纳米磁珠-核酸复合物进行吸附，去除上清液后，通过清洗液洗涤；
S5、洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的尿液游离DNA。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3具体包括：
通过磁力对第三混合液的纳米磁珠-核酸复合物吸附，去除上清液后对磁性吸附的纳米磁珠-核酸复合物吸附通过第一清洗液洗涤，再次去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤。
作为本发明实施方式的进一步改进，在所述步骤S4的洗涤和S5洗脱之间还包括：对纳米磁珠-核酸复合物进行干燥；具体包括将纳米磁珠-核酸复合物放置于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
本发明和已有技术相比，突出的创新点就是添加了裂解增强剂和通过优化试剂配比，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；本发明试剂盒可配合自动化使用；本发明可实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明和已有技术相比，突出的创新点就是添加了裂解增强剂和通过优化试剂配比，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；
(2)本发明试剂盒可配合自动化使用，提取24个尿液样本只需40min左右；操作便捷、省心省力；
(3)本发明以实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化；
(4)游离DNA片段大小在安捷伦2100生物分析仪上检测，可发现使用本发明试剂盒提取的DNA片段主要集中在200bp附近。
附图说明
图1为本发明实施例提供的试剂盒提取的DNA片段的电泳图；
图2为本发明实施例提供的试剂盒提取产物光谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
本发明实施例公开了一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；
其中，二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；
裂解结合液包括以下组分：
1-20mg/mL蛋白酶K；
1.1～15M离液盐；
0.1-0.5M苯甲酸钠；
5％Triton X-100；
0.1-1％表面活性剂；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.1-5％柠檬酸钠；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
1-10mM乙二胺四乙酸二钠；
10-50％异丙醇；
无菌纯化水。
在本发明实施例中，离液盐包括1-10M异硫氰酸胍和0.1-5M盐酸胍的混合液。
在其他可选的实施方式中，离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸钾中一种或多种。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述裂解增强剂为十二烷基磺酸钠。
清洗液包括第一清洗液和第二清洗液两种，第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
0.01-0.5％十二烷基硫酸钠溶液
10-30％异丙醇；
而第二清洗液为75％乙醇。
在本发明实施例中，洗脱液为无菌纯化水。
上述基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，包括以下步骤：
S1、将经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
S2、在尿液样本中加入裂解结合液，得到具有游离DNA的第二混合液；
S3、将第一混合液与第二混合，得到具有纳米磁珠-核酸复合物的第三混合液；
S4、通过磁力对第三混合液中的纳米磁珠-核酸复合物进行吸附，去除上清液后，通过清洗液洗涤；
S5、洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的尿液游离DNA。
其中，步骤S3具体包括：
通过磁力对第三混合液的纳米磁珠-核酸复合物吸附，去除上清液后对磁性吸附的纳米磁珠-核酸复合物吸附通过第一清洗液洗涤，再次去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤。
在其他可选的实施方式中，在所述步骤S4的洗涤和S5洗脱之间还包括：对纳米磁珠-核酸复合物进行干燥；具体包括将纳米磁珠-核酸复合物放置于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
具体例
具体1
裂解结合液成份与比例优化如下：
1M硫氰酸胍；
2M氯化钠；
1％聚乙烯醇PEG 2000；
8％月桂基硫酸钠缓冲液；
1％聚乙二醇辛基苯基醚；
20mM三羟甲基氨基甲烷；
40mM乙二胺四乙酸；
10％异丙醇IPA；
无菌纯化水。
然后进行尿液模拟样本的提取，具体方法如下：
1.裂解：
取两支15mL离心管，加入100μL Proteinase K，再依次加入2mL尿液样本、4mL裂解结合液，最大转速漩涡振荡混匀30s，室温裂解10min。
2.结合：向上述离心管中分别加入40μL磁珠，最大转速漩涡震荡混匀30s后，将离心管置于恒温金属浴50℃加热6min，然后将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。
3.洗涤：
(1)加入3mL第一清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(2)加入3mL第二清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(3)加入0.8mL第二清洗液，吹打混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置60s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并移去管盖及管底溶液。
4.干燥：保持离心管于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
5.洗脱：加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于恒温金属浴(或水浴锅)50℃加热5min，将离心管置于磁性分离器放置90s直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的游离DNA，可保存于-20℃以及用于后续检测。
具体例1的实验结果：
提取值为22ng；回收率为22/40＝55％注：模拟样本的DNA浓度为20ng/mL，2mL样本共40ng。
具体例2
在实例1的基础上进行裂解结合液成份与比例第二次调整，增加部分试剂种类，调整试剂比例：
2M硫氰酸胍；
1M氯化钠；
2％聚乙烯醇PEG 2000；
1％十二烷基硫酸钠溶液；
0.5％十二烷基磺酸钠溶液；
10％月桂基硫酸钠缓冲液；
1％聚乙二醇辛基苯基醚；
20mM三羟甲基氨基甲烷；
10mg/mL蛋白酶K
20mM乙二胺四乙酸；
15％异丙醇IPA；
无菌纯化水。
然后进行尿液模拟样本的提取，具体方法如下：
1.裂解：
取两支15mL离心管，加入100μL Proteinase K，再依次加入2mL尿液样本、4mL裂解结合液，最大转速漩涡振荡混匀30s，室温裂解10min。
2.结合：向上述离心管中分别加入40μL磁珠，最大转速漩涡震荡混匀30s后，将离心管置于恒温金属浴50℃加热6min，然后将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。
3.洗涤：
(1)加入3mL第一清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(2)加入3mL第二清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(3)加入0.8mL第二清洗液，吹打混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置60s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并移去管盖及管底溶液。
4.干燥：保持离心管于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
5.洗脱：加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于恒温金属浴(或水浴锅)50℃加热5min，将离心管置于磁性分离器放置90s直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的游离DNA，可保存于-20℃以及用于后续检测。
实验结果：
提取值：30ng
回收率：30/40＝75％注：模拟样本的DNA浓度为20ng/mL，2mL样本共40ng。
具体例3
在具体例2的基础上进行裂解结合液成份与比例第二次调整，增加部分试剂种类，调整试剂比例
10mg/mL蛋白酶K
4M异硫氰酸胍；
0.5M盐酸胍；
0.1M苯甲酸钠；
1％十二烷基磺酸钠溶液；
0.4M氯化钠；
5％Triton X-100；
5％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基硫酸钠溶液；
0.5％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.5％柠檬酸钠；
50mM三羟甲基氨基甲烷；
10mM乙二胺四乙酸二钠；
50％异丙醇IPA；
无菌纯化水。
然后进行尿液模拟样本的提取，具体方法如下：
1.裂解：
取两支15mL离心管，加入100μL Proteinase K，再依次加入2mL尿液样本、4mL裂解结合液，最大转速漩涡振荡混匀30s，室温裂解10min。
2.结合：向上述离心管中分别加入40μL磁珠，最大转速漩涡震荡混匀30s后，将离心管置于恒温金属浴50℃加热6min，然后将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。
3.洗涤：
(1)加入3mL第一清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(2)加入3mL第二清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(3)加入0.8mL第二清洗液，吹打混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置60s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并移去管盖及管底溶液。
4.干燥：保持离心管于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
5.洗脱：加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于恒温金属浴(或水浴锅)50℃加热5min，将离心管置于磁性分离器放置90s直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的游离DNA，可保存于-20℃以及用于后续检测。
实验结果：
提取值：38ng
回收率：36/40＝90％注：模拟样本的DNA浓度为20ng/mL，2mL样本共40ng。
本发明和已有技术相比，突出的创新点就是添加了裂解增强剂和通过优化试剂配比，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；本发明试剂盒可配合自动化使用；本发明可实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过优化试剂和试剂配比，采用高浓度异硫氰酸胍裂解液和裂解增强剂，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；
(2)本发明试剂盒可配合自动化使用，提取24个尿液样本只需40min左右；操作便捷、省心省力；
(3)本发明以实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化；
(4)游离DNA片段大小在安捷伦2100生物分析仪上检测，可发现使用本发明试剂盒提取的DNA片段主要集中在200bp附近，如图1和图2所示。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；其中，裂解结合液添加裂解增强剂以提高游离DNA的提取量。
2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解增强剂为十二烷基磺酸钠。
3.所述二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；
所述裂解结合液包括以下组分：
1-20mg/mL蛋白酶K；
1.1～15M离液盐；
0.1-0.5M苯甲酸钠；
5％Triton X-100；
0.1-1％十二烷基磺酸钠；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.1-5％柠檬酸钠；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
1-10mM乙二胺四乙酸二钠；
10-50％异丙醇；
无菌纯化水。
4.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述离液盐包括1-10M异硫氰酸胍和0.1-5M盐酸胍的混合液。
5.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸钾中一种或多种。
6.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；
所述第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
0.01-0.5％十二烷基硫酸钠溶液
10-30％异丙醇；
所述第二清洗液为75％乙醇。
7.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无菌纯化水。
8.一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
S2、在尿液样本中加入裂解结合液，得到具有游离DNA的第二混合液；
S3、将第一混合液与第二混合，得到具有纳米磁珠-核酸复合物的第三混合液；
S4、通过磁力对第三混合液中的纳米磁珠-核酸复合物进行吸附，去除上清液后，通过清洗液洗涤；
S5、洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的尿液游离DNA。
9.根据权利要求8所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
通过磁力对第三混合液的纳米磁珠-核酸复合物吸附，去除上清液后对磁性吸附的纳米磁珠-核酸复合物吸附通过第一清洗液洗涤，再次去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤。
10.根据权利要求8所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，在所述步骤S4的洗涤和S5洗脱之间还包括：对纳米磁珠-核酸复合物进行干燥；具体包括将纳米磁珠-核酸复合物放置于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
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