CN112391381A - 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 - Google Patents
一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112391381A CN112391381A CN202011413177.6A CN202011413177A CN112391381A CN 112391381 A CN112391381 A CN 112391381A CN 202011413177 A CN202011413177 A CN 202011413177A CN 112391381 A CN112391381 A CN 112391381A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic beads
- free dna
- solution
- urine
- nano magnetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 34
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 19
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 73
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 24
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 claims description 21
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 6
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 claims description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- GHCVXTFBVDVFGE-UHFFFAOYSA-N 4-amino-6-chloro-1,3,5-triazin-2-ol Chemical compound NC1=NC(O)=NC(Cl)=N1 GHCVXTFBVDVFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种尿液游离DNA提取试剂盒及其提取方法，用于尿液中游离DNA的提取；尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；本发明中的裂解结合液添加十二烷基磺酸钠作为裂解增强剂以提高游离DNA的提取量；二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10‑100mg/mL；本发明涉及的尿液游离核酸提取试剂盒包括具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作，提取方法简便易行。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法。
背景技术
循环游离核酸cfDNA，是指存在于人体的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括游离DNA、游离RNA和线粒体DNA等。cfDNA片段主要是来自于坏死的肿瘤细胞核凋亡的正常细胞、胎盘、组织等，cfDNA水平异常可以作为恶性肿瘤和妊娠相关性疾病和自身免疫病等越来越多的疾病诊断、治疗检测和预后评估的根据。
最近液态活检技术受到越来越多的关注，液态活检是以血液、尿液、唾液等体液为检测载体的一类非侵入性的检测方法。其原理为通过检测肿瘤细胞坏死释放到体液的物质，从而达到检测肿瘤的目的。而二代测序技术(next generation sequencing，NGS)以及数字PCR(Droplet digital PCR，dd PCR)技术的出现，使得在大量非肿瘤DNA中找到微量的肿瘤DNA(Tumour DNA，tDNA)成为可能。因此也为液态活检从尿液检测DNA提供了相应的可能性。
游离DNA的提取成为检测的关键步骤，传统使用的试剂沉淀法需要用到酚，氯仿，乙醇等存在一定的毒性的试剂，尤其是酚、氯仿具有致癌的潜在风险，且实验过程中需要配置的试剂量多，降低核酸提取效率。而采用离心柱方法的缺陷在于处理的样本体积收到离心柱的体积限制，离心操作费时，没办法进行高通量提取。
因此，亟待一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的尿液游离核酸提取试剂盒及其提取方法的出现，用于尿液中游离核酸的提取。
试剂盒提取游离DNA的步骤主要为样本裂解、磁珠结合、磁珠洗涤、磁珠干燥、洗脱。其中，样本裂解效率对最终的游离DNA提取量影响很大，裂解不充分会导致后面所有步骤提取的游离DNA回收率明显降低，所以裂解效果的增强是至关重要的。本发明研究了一种优化后的裂解液配方并添加一种阴离子表面活性剂作为裂解增强剂以提高游离DNA的提取量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的尿液游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于尿液中游离核酸的提取。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，所述尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；裂解结合液添加裂解增强剂提高裂解效果；
所述二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；
所述裂解结合液包括以下组分：
1-20mg/mL蛋白酶K；
1.1～15M离液盐；
0.1-0.5M苯甲酸钠；
5％Triton X-100；
0.1-1％十二烷基磺酸钠；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.1-5％柠檬酸钠；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
1-10mM乙二胺四乙酸二钠；
10-50％异丙醇；
无菌纯化水。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述离液盐包括1-10M异硫氰酸胍和0.1-5M盐酸胍的混合液。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸钾中一种或多种。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述裂解增强剂为一种商标为CATO的十二烷基磺酸钠阴离子表面活性剂，易溶于水，与阴离子、非离子复配伍性好，具有良好的乳化、渗透、和分散性能。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述裂解增强剂含量在裂解结合液中占0.1-1％。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；
所述第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
0.01-0.5％十二烷基硫酸钠溶液
10-30％异丙醇；
所述第二清洗液为75％乙醇。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述洗脱液为无菌纯化水。
另一方面，公开了上述基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
S2、在尿液样本中加入裂解结合液，得到具有游离DNA的第二混合液；
S3、将第一混合液与第二混合，得到具有纳米磁珠-核酸复合物的第三混合液；
S4、通过磁力对第三混合液中的纳米磁珠-核酸复合物进行吸附，去除上清液后，通过清洗液洗涤；
S5、洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的尿液游离DNA。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3具体包括：
通过磁力对第三混合液的纳米磁珠-核酸复合物吸附，去除上清液后对磁性吸附的纳米磁珠-核酸复合物吸附通过第一清洗液洗涤，再次去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤。
作为本发明实施方式的进一步改进，在所述步骤S4的洗涤和S5洗脱之间还包括：对纳米磁珠-核酸复合物进行干燥；具体包括将纳米磁珠-核酸复合物放置于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
本发明和已有技术相比，突出的创新点就是添加了裂解增强剂和通过优化试剂配比，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；本发明试剂盒可配合自动化使用；本发明可实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明和已有技术相比，突出的创新点就是添加了裂解增强剂和通过优化试剂配比，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；
(2)本发明试剂盒可配合自动化使用，提取24个尿液样本只需40min左右；操作便捷、省心省力；
(3)本发明以实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化；
(4)游离DNA片段大小在安捷伦2100生物分析仪上检测，可发现使用本发明试剂盒提取的DNA片段主要集中在200bp附近。
附图说明
图1为本发明实施例提供的试剂盒提取的DNA片段的电泳图；
图2为本发明实施例提供的试剂盒提取产物光谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
本发明实施例公开了一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，包括裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；
其中，二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；
裂解结合液包括以下组分：
1-20mg/mL蛋白酶K；
1.1～15M离液盐；
0.1-0.5M苯甲酸钠；
5％Triton X-100；
0.1-1％表面活性剂；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.1-5％柠檬酸钠；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
1-10mM乙二胺四乙酸二钠；
10-50％异丙醇；
无菌纯化水。
在本发明实施例中，离液盐包括1-10M异硫氰酸胍和0.1-5M盐酸胍的混合液。
在其他可选的实施方式中，离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸钾中一种或多种。
作为本发明实施方式的进一步改进，所述裂解增强剂为十二烷基磺酸钠。
清洗液包括第一清洗液和第二清洗液两种，第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
0.01-0.5％十二烷基硫酸钠溶液
10-30％异丙醇；
而第二清洗液为75％乙醇。
在本发明实施例中，洗脱液为无菌纯化水。
上述基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，包括以下步骤：
S1、将经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
S2、在尿液样本中加入裂解结合液，得到具有游离DNA的第二混合液；
S3、将第一混合液与第二混合，得到具有纳米磁珠-核酸复合物的第三混合液；
S4、通过磁力对第三混合液中的纳米磁珠-核酸复合物进行吸附，去除上清液后，通过清洗液洗涤；
S5、洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的尿液游离DNA。
其中，步骤S3具体包括：
通过磁力对第三混合液的纳米磁珠-核酸复合物吸附，去除上清液后对磁性吸附的纳米磁珠-核酸复合物吸附通过第一清洗液洗涤，再次去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤。
在其他可选的实施方式中，在所述步骤S4的洗涤和S5洗脱之间还包括：对纳米磁珠-核酸复合物进行干燥；具体包括将纳米磁珠-核酸复合物放置于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
具体例
具体1
裂解结合液成份与比例优化如下：
1M硫氰酸胍；
2M氯化钠；
1％聚乙烯醇PEG 2000；
8％月桂基硫酸钠缓冲液；
1％聚乙二醇辛基苯基醚；
20mM三羟甲基氨基甲烷；
40mM乙二胺四乙酸；
10％异丙醇IPA；
无菌纯化水。
然后进行尿液模拟样本的提取，具体方法如下：
1.裂解：
取两支15mL离心管，加入100μL Proteinase K，再依次加入2mL尿液样本、4mL裂解结合液，最大转速漩涡振荡混匀30s，室温裂解10min。
2.结合：向上述离心管中分别加入40μL磁珠，最大转速漩涡震荡混匀30s后，将离心管置于恒温金属浴50℃加热6min，然后将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。
3.洗涤：
(1)加入3mL第一清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(2)加入3mL第二清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(3)加入0.8mL第二清洗液，吹打混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置60s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并移去管盖及管底溶液。
4.干燥：保持离心管于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
5.洗脱：加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于恒温金属浴(或水浴锅)50℃加热5min，将离心管置于磁性分离器放置90s直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的游离DNA，可保存于-20℃以及用于后续检测。
具体例1的实验结果：
提取值为22ng；回收率为22/40＝55％注：模拟样本的DNA浓度为20ng/mL，2mL样本共40ng。
具体例2
在实例1的基础上进行裂解结合液成份与比例第二次调整，增加部分试剂种类，调整试剂比例：
2M硫氰酸胍；
1M氯化钠；
2％聚乙烯醇PEG 2000；
1％十二烷基硫酸钠溶液；
0.5％十二烷基磺酸钠溶液；
10％月桂基硫酸钠缓冲液；
1％聚乙二醇辛基苯基醚；
20mM三羟甲基氨基甲烷；
10mg/mL蛋白酶K
20mM乙二胺四乙酸；
15％异丙醇IPA；
无菌纯化水。
然后进行尿液模拟样本的提取，具体方法如下：
1.裂解：
取两支15mL离心管，加入100μL Proteinase K，再依次加入2mL尿液样本、4mL裂解结合液，最大转速漩涡振荡混匀30s，室温裂解10min。
2.结合：向上述离心管中分别加入40μL磁珠，最大转速漩涡震荡混匀30s后，将离心管置于恒温金属浴50℃加热6min，然后将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。
3.洗涤：
(1)加入3mL第一清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(2)加入3mL第二清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(3)加入0.8mL第二清洗液，吹打混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置60s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并移去管盖及管底溶液。
4.干燥：保持离心管于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
5.洗脱：加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于恒温金属浴(或水浴锅)50℃加热5min，将离心管置于磁性分离器放置90s直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的游离DNA，可保存于-20℃以及用于后续检测。
实验结果：
提取值：30ng
回收率：30/40＝75％注：模拟样本的DNA浓度为20ng/mL，2mL样本共40ng。
具体例3
在具体例2的基础上进行裂解结合液成份与比例第二次调整，增加部分试剂种类，调整试剂比例
10mg/mL蛋白酶K
4M异硫氰酸胍；
0.5M盐酸胍；
0.1M苯甲酸钠；
1％十二烷基磺酸钠溶液；
0.4M氯化钠；
5％Triton X-100；
5％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基硫酸钠溶液；
0.5％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.5％柠檬酸钠；
50mM三羟甲基氨基甲烷；
10mM乙二胺四乙酸二钠；
50％异丙醇IPA；
无菌纯化水。
然后进行尿液模拟样本的提取，具体方法如下：
1.裂解：
取两支15mL离心管，加入100μL Proteinase K，再依次加入2mL尿液样本、4mL裂解结合液，最大转速漩涡振荡混匀30s，室温裂解10min。
2.结合：向上述离心管中分别加入40μL磁珠，最大转速漩涡震荡混匀30s后，将离心管置于恒温金属浴50℃加热6min，然后将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器吸去上清液，并取下离心管。
3.洗涤：
(1)加入3mL第一清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(2)加入3mL第二清洗液，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置90s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并取下离心管。
(3)加入0.8mL第二清洗液，吹打混匀后转移磁珠悬液至新的1.5mL离心管中，漩涡震荡30s，使磁珠充分重悬，并于室温下静置1min，将离心管置于磁性分离器放置60s，上下颠倒混合一次，继续放置30s直至溶液澄清，用移液器移去上清液并移去管盖及管底溶液。
4.干燥：保持离心管于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
5.洗脱：加入100μL洗脱液，漩涡震荡1min，使磁珠充分重悬，将离心管置于恒温金属浴(或水浴锅)50℃加热5min，将离心管置于磁性分离器放置90s直至溶液澄清，转移上清液至新的1.5mL离心管中，此即为纯化得到的游离DNA，可保存于-20℃以及用于后续检测。
实验结果：
提取值：38ng
回收率：36/40＝90％注：模拟样本的DNA浓度为20ng/mL，2mL样本共40ng。
本发明和已有技术相比，突出的创新点就是添加了裂解增强剂和通过优化试剂配比，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；本发明试剂盒可配合自动化使用；本发明可实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过优化试剂和试剂配比，采用高浓度异硫氰酸胍裂解液和裂解增强剂，能够从尿液样本中提取大部分的游离DNA，提取回收率最高可达90％以上，并且提取到的游离DNA可进行后续PCR等实验；
(2)本发明试剂盒可配合自动化使用，提取24个尿液样本只需40min左右；操作便捷、省心省力；
(3)本发明以实现快速、高通量、自动化的提取纯化尿液游离DNA。采用纳米磁珠提取法无需使用离心机等大型仪器、操作简单、快捷、无毒环保，易于实现自动化；
(4)游离DNA片段大小在安捷伦2100生物分析仪上检测，可发现使用本发明试剂盒提取的DNA片段主要集中在200bp附近，如图1和图2所示。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述尿液游离DNA提取试剂盒包括优化的裂解结合液、二氧化硅磁珠和清洗液、洗脱液；其中，裂解结合液添加裂解增强剂以提高游离DNA的提取量。
2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解增强剂为十二烷基磺酸钠。
3.所述二氧化硅磁珠为经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠，浓度为10-100mg/mL；
所述裂解结合液包括以下组分：
1-20mg/mL蛋白酶K；
1.1～15M离液盐；
0.1-0.5M苯甲酸钠；
5％Triton X-100；
0.1-1％十二烷基磺酸钠；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
0.1-5％柠檬酸钠；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
1-10mM乙二胺四乙酸二钠；
10-50％异丙醇；
无菌纯化水。
4.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述离液盐包括1-10M异硫氰酸胍和0.1-5M盐酸胍的混合液。
5.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍和硫氰酸钾中一种或多种。
6.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；
所述第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
0.01-0.5％十二烷基硫酸钠溶液
10-30％异丙醇；
所述第二清洗液为75％乙醇。
7.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无菌纯化水。
8.一种基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过羧基改性的超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
S2、在尿液样本中加入裂解结合液，得到具有游离DNA的第二混合液；
S3、将第一混合液与第二混合，得到具有纳米磁珠-核酸复合物的第三混合液；
S4、通过磁力对第三混合液中的纳米磁珠-核酸复合物进行吸附，去除上清液后，通过清洗液洗涤；
S5、洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的尿液游离DNA。
9.根据权利要求8所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
通过磁力对第三混合液的纳米磁珠-核酸复合物吸附，去除上清液后对磁性吸附的纳米磁珠-核酸复合物吸附通过第一清洗液洗涤，再次去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤。
10.根据权利要求8所述的基于纳米磁珠的尿液游离DNA提取方法，其特征在于，在所述步骤S4的洗涤和S5洗脱之间还包括：对纳米磁珠-核酸复合物进行干燥；具体包括将纳米磁珠-核酸复合物放置于磁性分离器上，于超净台风干5min后，取下离心管。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011413177.6A CN112391381A (zh) | 2020-12-02 | 2020-12-02 | 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011413177.6A CN112391381A (zh) | 2020-12-02 | 2020-12-02 | 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112391381A true CN112391381A (zh) | 2021-02-23 |
Family
ID=74605077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011413177.6A Pending CN112391381A (zh) | 2020-12-02 | 2020-12-02 | 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112391381A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113913421A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-01-11 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 全血dna提取试剂及提取方法 |
| WO2022252212A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 京东方科技集团股份有限公司 | 磁珠悬浮液试剂、核酸纯化方法以及核酸分选方法 |
| CN115873664A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-03-31 | 上海领骏生物科技有限公司 | 一种用于核酸提取磁珠的清洗液及其使用方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112400A (zh) * | 2015-08-31 | 2015-12-02 | 臻和（北京）科技有限公司 | 一种提取游离dna的试剂盒 |
| CN105158455A (zh) * | 2015-09-17 | 2015-12-16 | 深圳市钠科生物有限公司 | 一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用 |
| CN105349532A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-24 | 杭州千基生物科技有限公司 | 一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒 |
| CN106350509A (zh) * | 2016-10-18 | 2017-01-25 | 哈尔滨博泰生物科技有限公司 | 一种快速高效的唾液dna提取试剂盒及提取方法 |
| CN107663521A (zh) * | 2016-07-28 | 2018-02-06 | 深圳华大基因股份有限公司 | 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 |
| CN109207476A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-01-15 | 王煜 | 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
| CN112011594A (zh) * | 2019-05-30 | 2020-12-01 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法 |
-
2020
- 2020-12-02 CN CN202011413177.6A patent/CN112391381A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112400A (zh) * | 2015-08-31 | 2015-12-02 | 臻和（北京）科技有限公司 | 一种提取游离dna的试剂盒 |
| CN105158455A (zh) * | 2015-09-17 | 2015-12-16 | 深圳市钠科生物有限公司 | 一种提高样品检测精度和准确性的生物样品采集方法、装置、系统、生物样品稳定试剂及应用 |
| CN105349532A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-24 | 杭州千基生物科技有限公司 | 一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒 |
| CN107663521A (zh) * | 2016-07-28 | 2018-02-06 | 深圳华大基因股份有限公司 | 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 |
| CN106350509A (zh) * | 2016-10-18 | 2017-01-25 | 哈尔滨博泰生物科技有限公司 | 一种快速高效的唾液dna提取试剂盒及提取方法 |
| CN109207476A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-01-15 | 王煜 | 一种尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 |
| CN112011594A (zh) * | 2019-05-30 | 2020-12-01 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022252212A1 (zh) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | 京东方科技集团股份有限公司 | 磁珠悬浮液试剂、核酸纯化方法以及核酸分选方法 |
| CN113913421A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-01-11 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 全血dna提取试剂及提取方法 |
| CN115873664A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-03-31 | 上海领骏生物科技有限公司 | 一种用于核酸提取磁珠的清洗液及其使用方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112391381A (zh) | 一种基于纳米磁珠的尿液游离dna提取试剂盒及提取方法 | |
| ES2937410T3 (es) | Método rápido para aislar ácidos nucleicos extracelulares | |
| JP5726529B2 (ja) | 単一試料からのゲノムｄｎａ、ｒｎａおよびタンパク質の単離方法 | |
| CN103820431B (zh) | 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒 | |
| CN105349532A (zh) | 一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒 | |
| US20200308630A1 (en) | Nucleic Acid Preparation Method | |
| JP2011522529A (ja) | 短鎖核酸を単離する方法 | |
| BRPI0500474B1 (pt) | Métodos para isolar e para adsorção de um ácido nucléico a partir de uma amostra biológica | |
| EP2588609A1 (en) | Method and kit for sequential isolation of nucleotide species from a sample | |
| CN105695450A (zh) | 基于磁珠法提取游离dna的试剂盒及其使用方法 | |
| CN112011594A (zh) | 一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法 | |
| WO2009018034A1 (en) | An improved nucleic acid purification method | |
| CN107299097A (zh) | 一种微量核酸释放剂、制备方法及其应用 | |
| CN109762874B (zh) | 核酸助沉剂、孕妇血浆游离dna提取试剂盒及方法 | |
| US20190225958A1 (en) | Method for enrichment and purification of cell-free dna from body fluid for high-throughput processing | |
| WO1999039000A1 (en) | Improved method for the isolation of nucleic acid | |
| CN107254465A (zh) | 一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法 | |
| WO2015159979A1 (ja) | 短鎖核酸の回収方法 | |
| JP3082908B2 (ja) | リボ核酸の単離方法 | |
| CN107475243B (zh) | 一种改良酚抽提总rna的方法 | |
| CN115960885B (zh) | 一种提取肝素钠样品中核酸的方法及组合物 | |
| CN102115739A (zh) | 分离核酸的方法、试剂及套组 | |
| CN114350649A (zh) | 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 | |
| CN114317519A (zh) | 一种血液基因组dna提取试剂盒及其使用方法 | |
| JP6024266B2 (ja) | Ｄｎａの抽出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210223 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |