CN112011594A - 一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents
一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种游离核酸提取试剂盒，游离核酸提取试剂盒作为血浆中游离核酸提取的应用；本发明提供一种具有高回收效率的，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于血浆中游离核酸的提取。
Description
技术领域
本发明游离核酸提取技术领域，具体涉及一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法。
背景技术
循环游离核酸cfDNA，是指存在于人体血液循环中的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括游离DNA、游离RNA和线粒体DNA等。cfDNA最早是有Mandel和Matails于1947年发现。cfDNA片段主要是来自于坏死的肿瘤细胞核凋亡的正常细胞、胎盘、组织等。cfDNA水平异常与恶性肿瘤和妊娠相关性疾病和自身免疫病等多种疾病相关。越来越多的疾病诊断、治疗检测和预后评估等以游离核酸的检测项目为根据。
传统的游离核酸提取试剂盒是采用沉淀和离心等操作，需要的样本量大，样本的处理过程繁琐和复杂，游离核酸的回收效率低。且难以实现高通量、自动化操作。
随着分子生物学以及功能性纳米材料的发展，传统的游离核酸提取试剂盒将逐渐被磁珠法及自动化替代。
试剂沉淀法：主要涉及的试剂包括，酚，氯仿，乙醇等。这类试剂存在一定的毒性，尤其是酚、氯仿具有致癌的潜在风险。实验过程中需要配置的试剂量多，降低核酸提取效率。
柱式离心法：采用离心柱方法，该方法的缺陷在于处理的样本体积收到离心柱的体积限制。此外，该方法的离心操作费时。没办法进行高通量提取。
因此，亟待一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的游离核酸提取试剂盒及其提取方法的出现，用于血浆中游离核酸的提取。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于血浆中游离核酸的提取。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种游离核酸提取试剂盒，游离核酸提取试剂盒作为血浆中游离核酸提取的应用。
本发明提供一种具有高回收效率，操作方法简单，耗时短，并能够高通量自动化操作的游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于血浆中游离核酸的提取。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
作为优选的方案，一种游离核酸提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性；
2)改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
3)第一混合液与血浆混合得到样本；
4)在样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
5)通过磁力对第二混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；
6)洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的游离核酸。
作为优选的方案，步骤2)中改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中的悬浮时间≥60min。
作为优选的方案，步骤4)中的裂解结合液包括以下组分：
1-10M硫氰酸胍；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基磺酸钠溶液；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
5％聚乙二醇辛基苯基醚；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
10mM乙二胺四乙酸；
10-15％异丙醇IPA和
无菌水。
作为优选的方案，步骤5)中第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
10-15％异丙醇。
作为优选的方案，步骤5)中第二清洗液为75％乙醇。
作为优选的方案，步骤6)的洗脱液为H2O。
作为优选的方案，步骤4)样本的量为0.1mL-10mL。
作为优选的方案，步骤2)中超顺磁性二氧化硅磁珠的含量为10-100mg/mL。
附图说明
图1为本发明实施例提供的超顺磁性二氧化硅磁珠表面高分子材料改性的电镜图片。
图2为本发明实施例提供的一种游离核酸提取试剂盒操作及结果计算图片。
1.本发明游离核酸提取试剂盒，2.传统柱提法游离核酸提取试剂盒。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
为了达到本发明的目的，本发明提供一种游离核酸提取试剂盒，游离核酸提取试剂盒作为血浆中游离核酸提取的应用。
本发明提供一种具有高回收效率的，操作方法简单的，耗时短的，并能够高通量自动化操作的游离核酸提取试剂盒及其提取方法，用于血浆中游离核酸的提取。
在上述技术方案的基础上，还可做如下改进：
在一些实施例中，一种游离核酸提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性；
2)改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
3)第一混合液与血浆混合得到样本；
4)在样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
5)通过磁力对第二混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；
6)洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的游离核酸。
采用超顺磁性二氧化硅磁珠，磁珠能够悬浮至少60min以上；超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性，增加了游离核酸的提取效率。该试剂盒可手动提取，可自动化提取，40min完成24个样本操作。
在一些实施例中，步骤2)中改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中的悬浮时间≥60min。
在一些实施例中，步骤4)中的裂解结合液包括以下组分：
1-10M硫氰酸胍；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG2000；
0.05％十二烷基磺酸钠溶液；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
5％聚乙二醇辛基苯基醚；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
10mM乙二胺四乙酸；
10-15％异丙醇IPA和
无菌水。
在一些实施例中，步骤5)中第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
10-15％异丙醇。
在一些实施例中，步骤5)中第二清洗液为75％乙醇。
在一些实施例中，步骤6)的洗脱液为H2O。
在一些实施例中，步骤4)样本的量为0.1mL-10mL。
在一些实施例中，步骤2)中超顺磁性二氧化硅磁珠的含量为10-100mg/mL。
一种游离核酸提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)合成得到超顺磁性二氧化硅磁珠；
2)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性；
3)改性后10mg/mL超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
4)第一混合液与人血浆混合得到0.1mL样本；
5)在0.1mL样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
6)通过磁力对第二混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；
7)洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的游离核酸。
裂解结合液包括以下组分：
1M硫氰酸胍(GuSCN)；
0.1M氯化钠；
1％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液；
0.1％月桂基硫酸钠缓冲液；
5％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)；
1mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，pH值为8.0；
10mM乙二胺四乙酸(EDTA)；
10％异丙醇IPA和
无菌水。
第一清洗液包括以下组分：
0.1M盐酸胍；
0.1M氯化钠(NaCl)；
0.01％吐温-20；
10％异丙醇。
第二清洗液为75％乙醇。
洗脱液为H2O。
一种游离核酸提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)合成得到超顺磁性二氧化硅磁珠；
2)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性；
3)改性后100mg/mL超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
4)第一混合液与血浆混合得到10mL样本；
5)在10mL样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
6)通过磁力对第二混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；
7)洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的游离核酸。
裂解结合液包括以下组分：
10M硫氰酸胍(GuSCN)；
10M氯化钠；
20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液；
10％月桂基硫酸钠缓冲液SLS；
5％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)；
50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，pH值为8.0；
10mM乙二胺四乙酸(EDTA)；
15％异丙醇IPA和
无菌水。
第一清洗液包括以下组分：
10M盐酸胍；
10M氯化钠(NaCl)；
0.5％吐温-20；
15％异丙醇。
第二清洗液为75％乙醇。
洗脱液为H2O。
一种游离核酸提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：
1)合成得到超顺磁性二氧化硅磁珠；
2)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性；
3)改性后50mg/mL超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
4)第一混合液与血浆混合得到5mL样本；
5)在5mL样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
6)通过磁力对第二混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；
7)洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的游离核酸。
裂解结合液包括以下组分：
5M硫氰酸胍(GuSCN)；
5M氯化钠；
10％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液；
5％月桂基硫酸钠缓冲液SLS；
5％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)；
25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，pH值为8.0；
10mM乙二胺四乙酸(EDTA)；
12.5％异丙醇IPA和
无菌水。
第一清洗液包括以下组分：
5M盐酸胍；
5M氯化钠(NaCl)；
0.25％吐温-20；
12.5％异丙醇。
第二清洗液为75％乙醇。
洗脱液为H2O。
本发明提供的一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法，产生如下的有益效果：
1)超顺磁性微球的悬浮时间≥60min，使反应过程属于均相反应。
2)利用该试剂盒手动从1mL人血浆中提取游离核酸的量达到10ng以上。
3)游离核酸提取的效率达到80％以上，具体见下表1。
表1量子位(Qubit)检测数据
4)得到的游离核酸纯度>80％，无蛋白质和基因组污染。
5)投入的样本量可以调节，调节从0.1mL-10mL。
6)利用设备提取，24个样本操作时间可控制在40min以内，提高了提取效率。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种游离核酸提取试剂盒，其特征在于，游离核酸提取试剂盒作为血浆中游离核酸提取的应用。
2.一种游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过高分子材料改性；
2)改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
3)第一混合液与血浆混合得到样本；
4)在样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
5)通过磁力对第二混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后通过第二清洗液洗涤；
6)洗涤后的磁珠与洗脱液混合，对磁珠进行洗脱处理，得到纯化的游离核酸。
3.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤2)中改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中的悬浮时间≥60min。
4.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤4)中的裂解结合液包括以下组分：
1-10M硫氰酸胍；
0.1-10M氯化钠；
1-20％聚乙烯醇PEG 2000；
0.05％十二烷基磺酸钠溶液；
0.1-10％月桂基硫酸钠缓冲液；
5％聚乙二醇辛基苯基醚；
1-50mM三羟甲基氨基甲烷；
10mM乙二胺四乙酸；
10-15％异丙醇IPA和
无菌水。
5.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤5)中第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5％吐温-20；
10-15％异丙醇。
6.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤5)中第二清洗液为75％乙醇。
7.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤6)的洗脱液为H2O。
8.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤4)样本的量为0.1mL-10mL。
9.根据权利要求2所述的游离核酸提取试剂盒的提取方法，其特征在于，步骤2)中超顺磁性二氧化硅磁珠的含量为10-100mg/mL。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201201 |