CN114317526A - 一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法 - Google Patents

一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114317526A
CN114317526A CN202210017237.5A CN202210017237A CN114317526A CN 114317526 A CN114317526 A CN 114317526A CN 202210017237 A CN202210017237 A CN 202210017237A CN 114317526 A CN114317526 A CN 114317526A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
solution
extraction
magnetic beads
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210017237.5A
Other languages
English (en)
Inventor
庞经昊
黄明贤
任辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Original Assignee
Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd filed Critical Suzhou Beaver Biomedical Engineering Co ltd
Priority to CN202210017237.5A priority Critical patent/CN114317526A/zh
Publication of CN114317526A publication Critical patent/CN114317526A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。利用该裂解结合液可在室温环境下不加热提取病毒样本中的RNA，不容易产生气溶胶污染；提取过程方便快捷，无需使用蛋白酶K；提取时间缩短至9分钟，大大节省了病毒RNA提取时间，同时提取效果大于等于市面上大部分同类试剂盒，提取出的RNA可直接用于后续RT‑qPCR检测或保存于‑70℃冰箱中。

Description

一种裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。
背景技术
近年来，越来越多的科研结果表明，RNA在生命进程中的作用远不止于此，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。在所有RNA实验中，最关键的步骤是分离得到纯度高且完整的RNA。RNA病毒作为感染性疾病重要的病原之一，其检测对于临床治疗有重要的意义。在临床上病毒核酸检测可作为病毒感染重要的参考依据，而病毒的核酸提取是首要工作。
实验室提取RNA的方法有异硫氰酸胍-苯酚法(Trizol)、酚-SDS法、盐酸胍法等，目前通常采用传统的Trizol法，最大的特点是Trizol试剂含有多组分分离作用，可同时分离一个样品的RNA、DNA、蛋白质，但是存在分离效率不高，RNA纯度不稳定等缺点。
现在市面上的病毒RNA提取试剂盒包括硅基质膜柱提法试剂盒与磁珠法试剂盒两种，其中硅基质膜柱提法试剂盒须使用离心机多次离心，操作相对繁琐并且较难实现自动化操作，提取速度慢；对于检测机构检测大量样本而言提取时间比较久。磁珠法试剂盒配合自动化核酸提取仪提取时间大部分都在20分钟到40分钟之间，且提取过程中需要加热到60℃以上，过高的温度加上手工提取过程中高速涡旋或自动化提取中的磁棒套高速震荡，提取过程会产生气溶胶，气溶胶内可能携带病毒核酸导致(1)造成提取过程中各个样本之间交叉污染风险，影响实验结果的准确性(2)气溶胶外泄造成实验人员感染病毒的风险。而且，这两种试剂盒中使用蛋白酶K，蛋白酶K需要低温冷藏或冷冻，保存不方便并且有保存或运输不当蛋白酶K变性失活的风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法，该裂解结合液可以在室温状态下配合自动化核酸提取仪在9分钟内快速提取病毒RNA并且无需蛋白酶K的病毒RNA提取试剂盒，方便快捷高效，减少气溶胶污染风险。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种裂解结合液，包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure BDA0003460261690000021
作为优选，所述裂解结合液包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure BDA0003460261690000022
一些具体实施例中，所述裂解结合液包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure BDA0003460261690000031
一些实施方案中，所述裂解结合液还包括0.1-1wt％十二烷基磺酸钠和/或0.1-10wt％月桂基硫酸钠。
一些具体实施例中，所述裂解结合液包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure BDA0003460261690000032
本发明还提供了以上所述的裂解结合液在提取血液RNA中的应用。
本发明还提供了RNA提取试剂盒，包括本发明所述的裂解结合液。
一些实施方案中，所述RNA提取试剂盒还包括清洗液、洗脱液和磁珠中的至少一种。
一些实施方案中，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；
所述第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5vol％吐温-20；
10-60vol％异丙醇；
第二清洗液为80％乙醇；
所述洗脱液为DEPC水。
本发明还提供一种病毒RNA的提取方法，利用本发明所述的裂解结合液处理样本后提取待测样本中的RNA，或利用本发明所述的试剂盒提取待测样本中的RNA。
一些实施方案中，所述提取方法具体包括如下步骤：
1)将磁珠进行羧基改性后悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
3)将待测样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
4)第一混合液与第二混合，得到含有核酸-磁珠的第三混合液；
5)利用磁力吸附第三混合液的中核酸-磁珠，去除上清液；收集磁珠，依次用第一清洗液和第二清洗液洗涤，干燥，再加入第二清洗液洗涤；
6)将洗涤后的磁珠干燥，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，获得病毒RNA。
一些具体实施方案中，所述磁珠为超顺磁性二氧化硅磁珠；所述第一混合液中，超顺磁性二氧化硅磁珠的浓度为10-100mg/mL，具体浓度可为10、30mg/mL、50mg/mL、80mg/mL或100mg/mL。
本发明提供了一种裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。利用该裂解结合液在室温环境下不加热提取病毒样本中的RNA，不容易产生气溶胶污染；提取过程方便快捷，无需使用蛋白酶K；提取时间缩短至9分钟，大大节省了病毒RNA提取时间，同时提取效果大于等于市面上大部分同类试剂盒，提取出的RNA可直接用于后续RT-qPCR检测或保存于-70℃冰箱中。
附图说明
图1示本发明RNA提取试剂盒自动化提取时各试剂的放置示意图；
图2示本发明RNA提取试剂盒自动化提取过程示意图；
图3示实施例3中利用qPCR检测加热和不加热对RNA提取的影响；
图4示实施例4中利用qPCR检测试剂预冷和室温对RNA提取的影响；
图5示实施例5中利用qPCR比较本发明试剂盒与对照试剂盒不加热对提取的RNA的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种裂解结合液、RNA提取试剂盒及RNA提取方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1裂解结合液及试剂盒
(一)试剂盒组成：
第一清洗液(0.1-10M盐酸胍；0.1-10M氯化钠；0.01-0.5vol％吐温-20；
10-60vol％异丙醇；
第二清洗液为80％乙醇；
洗脱液为DEPC水；
裂解结合液由DEPC水和如下组分组成：
Figure BDA0003460261690000051
Figure BDA0003460261690000061
(二)提取方法：
1、待测样本：2019-nCOV假病毒样本
2、RNA提取
使用以上试剂盒在天隆仪器上对样本中的RNA进行自动化提取，按照图1放置各试剂盒组分，室温运行9min，运行参数如表1所示，自动化提取过程参见图1，具体包括如下步骤：
1)超顺磁性二氧化硅磁珠表面通过羧基改性；
2)改性后超顺磁性二氧化硅磁珠悬浮于缓冲液中，得到第一混合液(超顺磁性二氧化硅磁珠的含量为50mg/mL)；
3)取待测样本0.2mL加入0.4mL裂解结合液，得到第二混合液；
4)将20μL第一混合液与步骤3)获得的第二混合液混合得到第三混合液；
5)通过磁力对第三混合液的有核酸磁珠吸附，去除上清液，磁性吸附的有核酸磁珠通过第一清洗液洗涤，再去除上清液，然后再用第二清洗液洗涤；
6)将洗涤后的磁珠干燥，然后用洗脱液洗脱，收集获得100μL洗脱液，得到病毒RNA。
表1
Figure BDA0003460261690000062
Figure BDA0003460261690000071
3、RT-qPCR检测
按照Takara一步法RT-qPCR专用试剂盒实验流程，反应总体积为25μL，假病毒RNA纯化产物加入2.5μL，使用ABI-7500Fast荧光定量PCR仪，程序设置参考试剂盒说明书。
(三)实验结果：
整个提取过程中，磁吸时间满足磁珠磁性要求，RT-qPCR检测结果得到CT值在30-31之间，说明提取出病毒RNA，但与比较理想的结果CT值约28.0还有差距，裂解结合液配方还需优化。
实施例2裂解结合液及试剂盒
试剂盒组成：
第一清洗液(0.1-10M盐酸胍；0.1-10M氯化钠；0.01-0.5vol％吐温-20；
10-60vol％异丙醇；
第二清洗液为80％乙醇；
洗脱液为DEPC水；
裂解结合液由DEPC水和如下组分组成：
Figure BDA0003460261690000072
Figure BDA0003460261690000081
提取方法同实施例1。
待测样本：邦德盛新冠质控品(全长RNA)。
检测体系：诺唯赞qPCR试剂盒+新冠N基因引物探针。
提取流程加样量200μL，浓度500copies/mL，即加入共100copies/孔。洗脱液体积100μL，qPCR体系点样量为5μL，即5copies。提取的RNA进行qPCR检测。
实验结果见表2。
表2
Figure BDA0003460261690000082
Figure BDA0003460261690000091
结果分析：该配方提取效果理想，新冠检测国标为500copies/mL检出，该配方提取该浓度样本的RNA可以检出，符合国标要求。
实施例3
使用不同保存液分别稀释RNA病毒至105个/mL后，放入金属浴56℃、30min加热灭活。处理好的各样本分别加入装有实施例2裂解结合液的预装板内进行9min快速提取，提取方法同实施例1，测试提取过程不加热的提取效果。不加热提取做两次平行实验。
实验结果见图3和表3。
表3
Figure BDA0003460261690000092
结果显示，9min快速提取过程，不同RNA病毒保存液、室温裂解结合与设置65℃加热的提取效果没有明显区别，提取过程可以不加热，不同保存液样本对本发明裂解结合液的提取效果没有影响，该配方提取效果理想。
实施例4
使用不同保存液分别稀释病毒至105个/mL后，放入金属浴56℃、30min加热灭活。然后放入金属浴4℃，10min。
将实施例2试剂盒从4℃冰箱取出后立即将试剂加入96深孔板对应孔内。立即将处理好的各样本分别加入96深孔板内进行9min快速提取，提取过程不加热，测试的提取效果，结果见图4和表4。
表4
Figure BDA0003460261690000101
结果显示，预冷后的试剂与室温保存的试剂对RNA的提取效果没有明显区别，说明裂解结合步骤对正常室温范围内的温度要求不敏感。
实施例5
1、实验目的
验证病毒RNA提取试剂盒在自动化核酸提取仪上的提取效果，与市面上常用产品进行比较。
2、实验材料与设备
2.1实验材料
病毒保存液：一次性使用病毒采样管(友康生物)
假病毒样本：2019-nCOV假病毒(1010个假病毒/mL)(厦门致善生物)
病毒RNA提取试剂盒：本发明实施例2试剂盒；B品牌RNA提取试剂盒
荧光定量检测试剂盒：PrimeDirectTM Probe RT-qPCRMix(一步法专用，Takara)
引物、探针：(苏州金唯智)
2019-nCOVN基因引物N-F：5′-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3′
2019-nCOVN基因引物N-R：5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3′
2019-nCOVN基因探针N-P：5′-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT
-TAMRA-3′
2.2实验设备
32通道自动化核酸提取仪(天隆NP968-C)
荧光定量PCR仪：ABI-7500Fast(AppliedBiosystems)
3、实验过程
3.1样本准备
取2019-nCOV假病毒(107个假病毒/mL)用病毒采样管保存液稀释浓度至105个/mL假病毒为实验样本。
3.2病毒RNA自动化提取
(1)在96深孔板中分别加入病毒RNA提取试剂盒对应体积的试剂。在4个加样孔内分别加入样本200μL后，放入仪器内，按照9分钟快速自动化提取参数，运行程序，得到假病毒RNA纯化产物洗脱体积为100μL。整个自动化提取过程的时间为8分55秒。操作参数如下表：
表5
Figure BDA0003460261690000111
Figure BDA0003460261690000121
(2)在B品牌试剂盒预装板4个加样孔内分别加入对应体积的蛋白酶K与200μL样本后，放入仪器内，运行按照说明书设定好的程序，得到假病毒RNA纯化产物洗脱体积为100μL。提取裂解加热温度为65℃，整个自动化提取过程的时间约为30分钟。
3.4 RT-QPCR荧光定量检测
按照Takara一步法RT-qPCR专用试剂盒实验流程，反应总体积为25μL，假病毒RNA纯化产物加入2.5μL，使用ABI-7500Fast荧光定量PCR仪，程序设置参考试剂盒说明书。
4、实验结果
4.1荧光定量检测数据
表6
Figure BDA0003460261690000122
Figure BDA0003460261690000131
4.2荧光定量检测图谱(图5)
结果分析：从RT-qPCR数据可看出，本发明试剂盒比B品牌试剂盒CT值更小，说明提取RNA的得率更高；提取过程无需使用蛋白酶K；提取时间缩短至9分钟，大大节省了病毒RNA提取时间。并且，由对照组1的结果可以看出，利用本发明试剂盒提取病毒RNA的过程无需加热，不容易产生气溶胶污染。
对比例1裂解结合液及RNA提取试剂盒
裂解结合液组成如下，试剂盒其他组分与实施例1相同：
0.5M硫氰酸胍；
1M盐酸胍；
0.5vol％吐温-20；
1vol％TritonX-100；
0.1wt％十二烷基磺酸钠；
2wt％聚乙烯醇PEG 2000；
1wt％月桂基硫酸钠；
20mM三羟甲基氨基甲烷；
30vol％异丙醇；
DEPC水。
待测样本为邦德盛新冠质控品(全长RNA)，RNA提取方法、qPCR检测过程同实施例2。
实验结果：整个提取过程中，磁吸时间满足磁珠磁性要求，但RT-qPCR检测结果未得到CT值，说明待测样本的RNA提取效果不理想。

Claims (10)

1.一种裂解结合液，包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure FDA0003460261680000011
2.根据权利要求1所述的裂解结合液，其特征在于，包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure FDA0003460261680000012
3.根据权利要求1所述的裂解结合液，其特征在于，包括DEPC水和如下浓度的组分：
Figure FDA0003460261680000013
Figure FDA0003460261680000021
4.根据权利要求1～3任一项所述的裂解结合液，其特征在于，还包括0.1-1wt％十二烷基磺酸钠和/或0.1-10wt％月桂基硫酸钠。
5.权利要求1～4任一项所述的裂解结合液在提取血液RNA中的应用。
6.RNA提取试剂盒，包括：
权利要求1～4任一项所述的裂解结合液；和
清洗液、洗脱液和磁珠中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的RNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液包括第一清洗液和第二清洗液；
所述第一清洗液包括以下组分：
0.1-10M盐酸胍；
0.1-10M氯化钠；
0.01-0.5vol％吐温-20；
10-60vol％异丙醇；
第二清洗液为80％乙醇；
所述洗脱液为DEPC水。
8.一种病毒RNA的提取方法，其特征在于，利用权利要求6或7所述的试剂盒提取待测样本中的RNA。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将磁珠进行羧基改性后悬浮于缓冲液中，得到第一混合液；
3)将待测样本中加入裂解结合液得到第二混合液；
4)第一混合液与第二混合，得到含有核酸-磁珠的第三混合液；
5)利用磁力吸附第三混合液的中核酸-磁珠，去除上清液；收集磁珠，依次用第一清洗液和第二清洗液洗涤，干燥，再加入第二清洗液洗涤；
6)将洗涤后的磁珠干燥，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱液，获得病毒RNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磁珠为超顺磁性二氧化硅磁珠；所述第一混合液中，超顺磁性二氧化硅磁珠的浓度为10-100mg/mL。
CN202210017237.5A 2022-01-07 2022-01-07 一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法 Pending CN114317526A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210017237.5A CN114317526A (zh) 2022-01-07 2022-01-07 一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210017237.5A CN114317526A (zh) 2022-01-07 2022-01-07 一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114317526A true CN114317526A (zh) 2022-04-12

Family

ID=81023970

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210017237.5A Pending CN114317526A (zh) 2022-01-07 2022-01-07 一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114317526A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112011594A (zh) * 2019-05-30 2020-12-01 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法
CN112458081A (zh) * 2020-12-02 2021-03-09 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒
CN112626067A (zh) * 2021-02-23 2021-04-09 苏州易迈吉生物医药科技有限公司 一种病毒rna快速提取的方法和试剂盒
CN112899268A (zh) * 2021-03-13 2021-06-04 山东博弘基因科技有限公司 一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒
CN112980832A (zh) * 2021-04-23 2021-06-18 南方科技大学 一种核酸的提取方法以及用于核酸提取的试剂盒
CN113699145A (zh) * 2021-09-06 2021-11-26 上海伯杰医疗科技有限公司 基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112011594A (zh) * 2019-05-30 2020-12-01 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种游离核酸提取试剂盒及其提取方法
CN112458081A (zh) * 2020-12-02 2021-03-09 苏州海狸生物医学工程有限公司 一种基于纳米磁珠的病毒核酸提取试剂盒
CN112626067A (zh) * 2021-02-23 2021-04-09 苏州易迈吉生物医药科技有限公司 一种病毒rna快速提取的方法和试剂盒
CN112899268A (zh) * 2021-03-13 2021-06-04 山东博弘基因科技有限公司 一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒
CN112980832A (zh) * 2021-04-23 2021-06-18 南方科技大学 一种核酸的提取方法以及用于核酸提取的试剂盒
CN113699145A (zh) * 2021-09-06 2021-11-26 上海伯杰医疗科技有限公司 基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109722431B (zh) 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒
EP3636769B1 (en) Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof
US9012614B2 (en) Rapid nucleic acid purification using paper chromatography
CN113151397B (zh) 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒
CN112391445B (zh) 用于病毒核酸检测的样本释放剂、试剂盒及预处理方法
EP3904532A1 (en) Nucleic acid extraction composition, reagent and kit containing the same and use thereof
CN105861493A (zh) 游离dna提取试剂盒及其应用
CN110951725A (zh) 一种基于磁珠法的一步法核酸提取工艺
CN116121237A (zh) 一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法
CN112899268B (zh) 一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒
CN107893070B (zh) 磁笔式单人份核酸提取试剂盒及其使用方法
CN106754884B (zh) 试剂盒及其应用
CN112941067A (zh) 一种全血核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
CN114317526A (zh) 一种裂解结合液、rna提取试剂盒及rna提取方法
JP5232858B2 (ja) 生物学的試料の成分を抽出および精製するための方法
US20220090166A1 (en) Preparation methods and apparatus adapted to filter small nucleic acids from biological samples
CN113913494A (zh) 快速便捷提取体液中病毒dna的试剂盒及提取方法
TWI671407B (zh) 微生物核酸萃取方法
CN113621607A (zh) 裂解液及其应用
CN111139287A (zh) 一种应用于动物组织中核酸现场提取方法
WO2022160479A1 (zh) 用于大体积混合拭子样本检测的高通量提取微量核酸的方法
KR102654881B1 (ko) 핵산 분리 장치 및 방법
CN109880824B (zh) 一种通用型核酸提取试剂盒及其使用方法
CN118222565A (zh) 一种家蚕微孢子虫基因组dna提取试剂盒及其应用
CN115404233A (zh) 一种核酸提取试剂及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220412