JP5232858B2 - 生物学的試料の成分を抽出および精製するための方法 - Google Patents
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Description
試料を150mM KOHで処理した場合、熱単独よりも良好にDNAを酸化鉄から溶離するか否かを決定するために、本実施例を行った。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
300mMビシン2×バッファー
試料バッファー
クラミジア(Chlamydia)プライマーウェル
クラミジア増幅ウェル
増幅対照(AC)プライマーウェル
AC増幅ウェル
KOH 150mM
血漿試料
酸化鉄
血漿前処理チューブ(PPT)
血漿前処理チューブ(PPT)中、全血を1100×gで10分間回転することによって、全血から血漿を調製した。体積6mlのプール血漿を調製した。血漿プール1ミリリットルあたりトラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)(CT)基本小体(EB)10000個を加え、これを等体積で2ml遠心管6本中に分配した。別の10mlの細菌懸濁液を、CT EB10000個/mlを有する脱イオン水中に調製し、10×1ml中に分配した。ビシン含有2×試料バッファー300mM中、CT EB10000個/mlを含む、さらなる懸濁液を調製した。
本実施例は、2段階溶離プロセスを用いたRNAの回収を実証するものである。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
酸化鉄
血漿前処理チューブ(PPT)
30mM KP04
500mM KP04
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(AMV−RT)
BsoBI制限酵素
GP32タンパク質
ウシ血清アルブミン(BSA)
Bstポリメラーゼ
55%グリセロール
200mMマグネシウム
ジメチルスルホキシド(DMSO)
蛍光検出プローブ
鎖置換増幅(SDA)プライマー
バンパープライマー
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
プロテイナーゼK
ホルムアミド
結合性酸
KOH
ビシン
HIV gag遺伝子転写物
血漿を、65Cで20分間、および70Cで10分間、44%ホルムアミドおよび5UプロテイナーゼKで前処理した。酸化鉄および結合性酸180μlを血漿に加えた。次いで、混合物を、HIVgag遺伝子転写物10000コピー/mlでスパイクした。酸化鉄に結合させ、洗浄した後、RNAを、65Cで20分間、80mMまたは100mMいずれかのKOH溶離バッファー120μlで溶離した。残りの溶離物を、192mMまたは230mMいずれかのビシン60μlで中和し、2分間混合した。RNAをAMV−RTで逆転写し、gag特異的プライマーを用いてSDAによって増幅した(非特許文献2)。蛍光検出プローブを用いてリアルタイムで検出を行った(非特許文献3)。
この実施例は、様々なKOH濃度で溶離する間に加熱すると、RNAの安定性および/または回収および/増幅/検出に影響を及ぼすか否かを決定するために行った。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
酸化鉄
血漿調製チューブ(PPT)
30mM KP04
500mM KP04
AMV RT
BsoBI制限酵素
GP32タンパク質
ウシ血清アルブミン(BSA)
Bstポリメラーゼ
55%グリセロール
200mMマグネシウム
ジメチルスルホキシド(DMSO)
蛍光検出プローブ
鎖置換増幅(SDA)プライマー
バンパープライマー
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
プロテイナーゼK
ホルムアミド
結合性酸
KOH
ビシン
HIV gag遺伝子転写物
血漿を、65Cで20分間、および70Cで10分間、44%ホルムアミドおよび5UプロテイナーゼKで前処理した。酸化鉄および結合性酸180μlを血漿に加えた。次いで、混合物を、HIVgag遺伝子転写物5000コピー/mlでスパイクした。酸化鉄に結合させ、洗浄した後、RNAを、加熱なしで2分間、または65Cで20分間のいずれか、60mM、70mM、または80mMいずれかのKOH溶離バッファー120μlで溶離した。試料を、230mMのビシン60μlと2分間混合することによってすぐに中和した。RNAをAMV−RTで逆転写し、gag特異的プライマーを用いてSDAによって増幅した(非特許文献2)。蛍光検出プローブを用いてリアルタイムで検出を行った(非特許文献3)。
この実験は溶離条件を最適化するために行った。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
酸化鉄
血漿調製チューブ(PPT)
30mM KP04
500mM KP04
AMV RT
BsoBI制限酵素
GP32タンパク質
ウシ血清アルブミン(BSA)
Bstポリメラーゼ
55%グリセロール
200mMマグネシウム
ジメチルスルホキシド(DMSO)
蛍光検出プローブ
鎖置換増幅(SDA)プライマー
バンパープライマー
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
プロテイナーゼK
ホルムアミド
結合性酸
KOH
ビシン
HIV gag遺伝子転写物
血漿を、65Cで20分間、および70Cで10分間、44%ホルムアミドおよび5UプロテイナーゼKで前処理した。酸化鉄および結合性酸180μlを血漿に加えた。次いで、混合物を、HIVgag遺伝子転写物10000コピー/mlでスパイクした。酸化鉄に結合させ、洗浄した後、RNAを、65Cで20分間、46mM、55mM、63mM、または80mMいずれかのKOH溶離バッファー120μlで溶離した。次いで、試料を、109mMのビシン60μlで中和し、2分間混合した。RNAをAMV−RTで逆転写し、gag特異的プライマーを用いてSDAによって増幅した(非特許文献2)。検出は、蛍光検出プローブを用いてリアルタイムで生じた(非特許文献3)。
本実施例は、2段階溶離プロセスでのより少ない溶離体積を評価した。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
酸化鉄
血漿調製チューブ(PPT)
30mM KP04
500mM KP04
AMV RT
BsoBI制限酵素
GP32タンパク質
ウシ血清アルブミン(BSA)
Bstポリメラーゼ
55%グリセロール
200mMマグネシウム
ジメチルスルホキシド(DMSO)
蛍光検出プローブ
鎖置換増幅(SDA)プライマー
バンパープライマー
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
プロテイナーゼK
ホルムアミド
結合性酸
KOH
ビシン
HIV gag遺伝子転写物
血漿を、65Cで20分間、および70Cで10分間、44%ホルムアミドおよび5UプロテイナーゼKで前処理した。酸化鉄および結合性酸180μlを血漿に加えた。次いで、混合物を、HIVgag遺伝子転写物10000コピー/mlでスパイクした。酸化鉄に結合させ、洗浄した後、RNAを、65Cで20分間、50mM、65mM、および80mMいずれかのKOH 120μlで溶離した。次いで、試料を、154mM、192mMまたは230mMいずれかのビシン60μlで中和し、2分間混合した。RNAをAMV−RTで逆転写し、gag特異的プライマーを用いてSDAによって増幅した(非特許文献2)。蛍光検出プローブを用いてリアルタイムで検出を行った(非特許文献3)。
本実施例は、1段階方法およびMOTAに対する効果に比べた溶離の分離および中和を詳述するものである。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
酸化鉄
血漿調製チューブ(PPT)
30mM KP04
500mM KP04
AMV RT
BsoBI制限酵素
GP32タンパク質
ウシ血清アルブミン(BSA)
Bstポリメラーゼ
55%グリセロール
200mMマグネシウム
ジメチルスルホキシド(DMSO)
蛍光検出プローブ
鎖置換増幅(SDA)プライマー
バンパープライマー
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)
プロテイナーゼK
ホルムアミド
結合性酸
KOH
ビシン
HIV gag遺伝子転写物
血漿を、65Cで20分間、および70Cで10分間、44%ホルムアミドおよび5UプロテイナーゼKで前処理した。酸化鉄および結合性酸180μlを血漿に加えた。次いで、混合物を、HIVgag遺伝子転写物10000コピー/mlでスパイクした。酸化鉄に結合させ、洗浄した後、RNAを、65Cで20分間、50mM、65mM、または80mMいずれかのKOH溶離バッファー400μlで溶離した。溶離物を、100μlおよび300μlの体積に分割し、この各々を異なるビシン含有中和バッファーで中和した(表6)。RNAをAMV−RTで逆転写し、gag特異的プライマーを用いてSDAによって増幅した(非特許文献2)。蛍光検出プローブを用いてリアルタイムで検出を行った(非特許文献3)。
本実施例の目的は、抽出モードにおいてBD Viper(商標)Systemを用いて酸化鉄からのDNAの溶離効率を決定することであった。この試験は、SDA適合性バッファー(pH約8.4)を用いて行った場合、酸化鉄抽出プロセスにおける最終溶離段階の後、増幅可能な標的のDNAが酸化鉄に依然として結合しているか否かを評価するように設計された。先の実験において、酸化鉄をこのpHの溶離バッファーに再曝露した場合、SDA反応ポジティブの蛍光シグナルにおいて試験する第2の溶離物が生じるか否かを決定した。これに対する可能な理由の一つは、オリジナルの抽出の後、微量の溶離バッファーが存在するということであった。この可能性を軽減するために、この実験における抽出チューブには全て、さらなるSDA適合バッファーで再溶離する前に最初の抽出の事象からの残渣の溶離バッファーが除去された。これは、結合しているあらゆるDNAのさらなる溶離を防ぐために脱イオン水(pH4〜5)で酸化鉄を洗浄することによって遂行した。この実験において臨床的なマトリックスは使用しなかった。
本実施例において用いた物質は以下の通りであった。
リン酸カリウム−DMSO−グリセロール(KPDG)試料希釈液(SDA適合バッファー)
抽出チューブ
溶解バッファー
バインディングバッファー
洗浄バッファー
溶離バッファー
BD ProbeTec(商標)CT/GC QX Amplified DNA Assay用プライミングおよび増幅マイクロウェル
トラコーマクラミジア(CT)/淋菌(Neisseria gonnorhea)(GC)生物体(1×105/mLストック)
手順は以下の通りであった。
この実験の目的は、運転とViper機器との間の結果の再現性を決定するために、抽出モードにおいてBD Viper(商標)Systemを用いて2段階溶離プロセスに対するMeasurement System Analysisを完成することである。
この実験において用いた物質は以下の通りであった。
CT/GC試料希釈液5.9L
抽出チューブ 15トレイ
2×中和バッファー250ml
2×KOH(高pH溶離バッファー)250ml
洗浄バッファー(水およびTween)
結合性酸
KOH溶解バッファー
BD ProbeTec(商標)CT/GC QX Amplified DNA Assay用プライミングおよび増幅マイクロウェル
トラコーマクラミジア(CT)105スパイカー2アリコート
淋菌(GC)105スパイカー4アリコート
CT/GCポジティブおよびネガティブの試料を、試料希釈液において調製した。低い標的のプールを15EB/mlのCTおよび50細胞/mlのGCでスパイクした。高い標的のプールを30EB/mlのCTおよび100細胞/mlのGCでスパイクした。スパイクの計算は以下の通りであった。
GC50細胞/ml:105/ml(xml)=50細胞/ml(2450ml)==>1225μlGCスパイク。
GC100細胞/ml:105/ml(xml)=100細胞/ml(2450ml)==>2450μlGCスパイク。
Claims (23)
- (i)生物学的試料の少なくとも1つの成分を少なくとも1つの常磁性粒子に可逆的に結合させるステップと、
(ii)少なくとも1つの常磁性粒子結合成分を、生物学的試料の非結合成分から分離するステップと、
(iii)少なくとも1つの常磁性粒子結合成分を洗浄するステップと、
(iv)少なくとも1つの常磁性粒子結合成分を洗浄物から分離するステップと、
(v)少なくとも1つの常磁性粒子結合成分をpH溶離バッファーで溶離することによって、少なくとも1つの常磁性粒子から少なくとも1つの成分を切り離して、溶離した試料を得るステップであって、
前記溶離バッファーは前記切り離すステップの間に中和バッファーとさらに混合されることはないステップと、
(vi)次いで前記溶離した試料に中和バッファー加えることにより溶離した試料を中和して、最適化されたバッファーを得るステップと
を含むことを特徴とする、生物学的試料の成分を抽出するための方法。 - 生物学的試料は、臨床試料、法医学試料、または環境試料であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 生物学的試料は、土壌、水、空気、懸濁流出液、または粉末を含む環境試料であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 生物学的試料の成分は、ウイルス物質または細胞物質を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 細胞物質は、原核細胞、真核細胞、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、またはオルガネラを含むことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 細胞物質は、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、植物細胞、藻類、真菌、細菌、酵母、または原虫を含むことを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 生物学的試料の成分は、核酸、タンパク質、炭水化物、オルガネラ、または細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 生物学的試料の成分は核酸であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 生物学的試料の成分はタンパク質であることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 生物学的試料は、細胞を溶解するために前処理されていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記溶離は、pH溶離バッファーでpHを上昇させることを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 溶離バッファーのpHは約8から14であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- pH溶離バッファーは塩基性溶液であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 塩基性溶液は、少なくとも1つの常磁性粒子に結合した、生物学的試料の少なくとも1つの成分が、少なくとも1つの常磁性粒子から切り離されるのに十分な程度に環境のpHを上昇させる任意の化合物を含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 塩基性溶液は、水酸化カリウム(KOH)または水酸化ナトリウム(NaOH)であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 塩基性溶液は水酸化カリウム(KOH)であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記中和は中和バッファーの添加を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 中和バッファーは、ビシン、トリス、CHES[2−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸]、BES[N−N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸]、MOPS(4−モルホリンプロパンスルホン酸)、またはリン酸塩であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 中和バッファーはビシンであることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記中和バッファーはpHを低下させることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- pHは約6から9であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- pHは約8から8.5であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- pHは約8.4であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
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