JP2016501011A

JP2016501011A - 非溶出試料の一段階核酸増幅法

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Publication number: JP2016501011A
Application number: JP2015541121A
Authority: JP
Inventors: タトネル，ピーター・ジェームズ; ラマートン，キャサリン・ルイーズ; ピアース，アラン・スチュアート; アッシュマン，エリザベス
Original assignee: ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2016-01-18
Also published as: EP2917344B1; CN104769111A; US20150299770A1; EP2917344A1; WO2014072354A1; CN104769111B

Abstract

本発明は、ユーザー時間及び汚染の可能性を減少させるという利点を有する、核酸を増幅するために使用することができる方法及びキットに関する。核酸試料の容易な処理及び増幅のために、試料を固体支持体に結合させ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅反応に、精製することなく、直接使用する。【選択図】図１

Description

本発明は、核酸増幅の分野、特に核酸の増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の使用に関する。本発明は、核酸試料の一段階増幅のためにＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅ固体支持体をＰＣＲ試薬と組合せることによって核酸の増幅に使用することができる方法及びキットを提供する。本発明は、核酸の長期保存及び処理容易性における用途を有し、ジェノタイピング、診断及び法医学に特に有用である。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学で核酸の増幅に使用される一般的なツールである。米国特許第４６８３２０２号明細書（Ｍｕｌｌｉｓ、ＣｅｔｕｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、核酸又はその混合物に含まれる任意の所望の特異的核酸配列の増幅方法を記載している。

濾紙又は化学修飾マトリックス上での核酸の長期保存、輸送及び所定期間保存は、ＤＮＡ又はＲＮＡをＰＣＲなどの遺伝子解析に使用するための形態で抽出及び単離する前に遺伝子材料を保存するための周知の技術である。例えば、欧州特許第１５６３０９１号明細書（Ｓｍｉｔｈら、Ｗｈａｔｍａｎ）は、細胞又は細胞溶解物などの試料からの核酸の保存方法に関する。核酸は単離され、多種多様なフィルター及び他の型の固体支持体又は固相媒体上で、室温及び室内湿度で長期間保存される。さらに、この文献は、管、カラム又はマルチウェルプレート中の広範囲の固体支持体マトリックス上で核酸含有試料を保存する方法を記載している。

国際公開第９００３９５９号パンフレット（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）は、マトリックスに組み込まれた又は吸収されたＤＮＡを分解から保護する化合物又は組成物を有する固体マトリックスを含む、血液ＤＮＡを含むＤＮＡを保存するためのセルロース系固体支持体を記載している。この文献は、固体媒体を用いてＤＮＡを保存する方法、及びＤＮＡを回収する又はインサイツで使用する方法も開示している。

米国特許第５４９６５６２号明細書（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）は、セルロース系固体媒体及びＤＮＡを保存する方法を記載している。固体媒体上でＤＮＡを保存及び輸送する方法、並びに（ａ）固体媒体からのＤＮＡの回収又は（ｂ）固体媒体上でのインサイツでのＤＮＡの使用（例えば、ＰＣＲによるＤＮＡ配列増幅）のいずれかを伴う方法が開示されている。残念ながら、記載されている方法は、界面活性剤又は洗浄剤を固体媒体の表面に組み込んでいるに過ぎないので、ＰＣＲを行う前に洗浄剤を除去するための別の段階を要するという欠点に悩まされる。

国際公開第９９３９００号パンフレット（Ｇｅｎｔｒａ）は、ＤＮＡを処理及び増幅する方法をさらに記載している。この方法は、ＤＮＡを含む試料を、溶解試薬が固体支持体に結合している固体支持体と接触させる段階を含む。その後、ＤＮＡがＤＮＡ精製試薬で処理され、精製される。増幅は、固体支持体上に捕捉剤を含まず、増幅前に溶解試薬の除去及びＤＮＡの精製のための別の段階を要する。

国際公開第９６３９８１３号パンフレット（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）は、遺伝子材料の試料を保存するための固体媒体及びその後の分析を記載しており；この固体媒体はタンパク質変性剤及びキレート剤を含む。記載されている方法は、ＩＩ族及びＩＩＩ族多価金属イオン及び遷移金属イオンを含む多価値イオンを錯化することができる任意の化合物であるキレート剤に関するものである。この発明は、キレート剤としてのシクロデキストリンに具体的に言及もしておらず、ＰＣＲ解析を単一段階で行うことができたことを示唆もしていない。

米国特許第５７０５３４５号明細書（Ｌｕｎｄｉｎら）は、細胞を含む試料を溶解して核酸を放出させ、試料をシクロデキストリンで処理して抽出剤を中和する核酸調製法を記載している。このシステムの利点は、従来の洗浄剤除去がシクロデキストリンを添加して洗浄剤を中和する分離段階を要するが、このシステムは必要とされる分離段階を除去し、汚染の機会を減らすということである。

英国特許第２３４６３７０号明細書（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ）は、核酸を含む細胞を含む試料をフィルターに適用することを記載しており、細胞がフィルターに保持され、汚染物質は保持されない。細胞はフィルター上で溶解され、核酸と並んで保持される。その後の段階が、核酸を保持しながら、細胞溶解物を濾過して取り除く。

国際公開第９６１８７３１号パンフレット（Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ）は、試料を固体支持体に結合し、試料を洗浄剤と接触させ、その後の段階を行って核酸を単離する、核酸を単離する方法を記載している。

国際公開第００５３８０７号パンフレット（Ｓｍｉｔｈ、Ｗｈａｔｍａｎ）は、溶出及び分析することができる遺伝子材料を含む試料を保存及び溶解するための媒体を記載している。媒体は溶解試薬でコーティングされている。さらに、媒体は弱塩基、キレート剤、界面活性剤及び任意には尿酸でコーティングされ得る。

国際公開第９９３８９６２号パンフレット（Ｈｅａｌｔｈ、ＧｅｎｔｒａＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）は、結合溶解試薬を含む固体支持体を記載している。溶解試薬は、洗浄剤、キレート剤、水及び任意にはＲＮＡ消化酵素を含むことができる。固体支持体はシクロデキストリンを含まず、増幅分析のために核酸を精製するためのさらなる段階を要する。

ＤＮＡ増幅のための現在の方法は、汚染の機会を増加させるいくつかの段階を通常伴うＤＮＡ精製手順を伴う。これは面倒なプロセスであり、先行技術の方法は、費用、複雑性及び特に、ユーザー時間の点でいくつかの明らかな欠点を有する。例えば、カラムに基づく核酸精製は、核酸を精製するための典型的な固相抽出法である。この方法は、緩衝液のｐＨ及び塩含量に応じたシリカ又は他の支持体への吸着を通した核酸結合に頼るものである。適当な緩衝液の例としては、トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液又はリン酸緩衝液（反応性アミンによるＤＮＡマイクロアレイ実験に使用される）が挙げられる。このようなスピンカラムでの核酸の精製は、いくつかの複雑かつ面倒な段階を含む。スピンカラムでの核酸精製は、典型的には３つの時間のかかる複雑な段階／段階を伴う：核酸を含む試料をカラムに添加し、核酸が、緩衝液、変性剤（塩酸グアニジンなど）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、イソプロパノール及びｐＨ指示薬を含み得る結合溶液の低ｐＨ（カラム上のシラノール基に対して）及び塩濃度により結合する；カラムを５ｍＭＫＰＯ４ｐＨ８．０又は類似の８０％ＥｔＯＨで洗浄する；及びカラムを緩衝液又は水で溶出する。

代替法は、ＤＮＡがシリカ又はガラス粒子又はガラスビーズに結合するようなカオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃｓａｌｔ）の存在下での核酸の結合を伴う。この特性を使用して、アルカリ性条件下でガラス粉末又はシリカビーズを用いて核酸を精製した。典型的なカオトロピック塩には、チオシアン酸グアニジン又は塩酸グアニジンが含まれ、近年ガラスビーズはガラス含有ミニカラムに置き換わっている。

法医学用途のＰＣＲ増幅失敗に対する最良の防御策は、完全な試料処理及び処理技術を、ＤＮＡを効率的に精製することが証明されている抽出システムと組合せることである。

ＳａｎｔｏｓＣ．Ｒ．ら（ＢｒａｚｉｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２、４３、３８９〜３９２）は、核酸のＰＣＲ増幅の前の溶出段階をとばし、パンチャー（ｐｕｎｃｈｅｒ）をＰＣＲミックスに直接添加する方法を記載している。ＰＣＲ増幅がＨＰＶ−ＤＮＡを検出するために行われ、増幅前に核酸を溶出する標準的ＦＴＡＥｌｕｔｅカードプロトコルよりも効率的であった。しかしながら、この方法は、ＨＰＶの存在を測定するために定性的ＰＣＲを使用したに過ぎない。

ＮｏｚａｗａＮ．ら（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、４５、１３０５〜１３０７）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出するためにリアルタイムＰＣＲを使用する方法を記載している。記載される方法は、精製ＣＭＶを含む濾紙の使用を伴い、ＰＣＲミックスに直接添加された。この論文は、光電子倍増管走査システムを備える機器のみをフィルターディスクを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイに使用することができることを特筆した。この論文は、濾紙が電荷結合素子カメラを用いる機器に悪影響を及ぼすことを示唆しており、それゆえ、ＡＢＩ７７００マシンなどのリアルタイムＰＣＲマシンに濾紙を使用することから遠ざかることを教示している。

ＱｉａｇｅｎＳａｍｐｌｅ＆ＡｓｓａｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＮｅｗｓｌｅｔｔｅｒ（２０１０年３月１５日）は、下流ＰＣＲ処理に対するＲＮＡ調製物の低Ａ₂₆₀／Ａ₂₃₀比の効果を記載している。このニュースレターは、チオシアン酸グアニジン（ＦＴＡＥｌｕｔｅカードの成分であり、ＲＮＡ精製手順に使用される）による汚染により、ＲＮＡ試料において２３０ｎｍでの吸光度増加が頻繁であることを特筆している。実験は、チオシアン酸グアニジンが存在する場合、ＲＮＡ試料のＡ₂₆₀／Ａ₂₃₀比が低いが、ＲＮＡ試料中最大で１００ｍＭのチオシアン酸グアニジン濃度はリアルタイムＰＣＲの信頼性に影響を及ぼさなかったことを証明している。

典型的には、標準的ＦＴＡＥｌｕｔｅカードプロトコルに含まれる精製段階は厄介であり、精製がＤＮＡの損失をもたらし得る。そのため、精製段階の必要性を除く、核酸を増幅、定量化及び／又はプロファイリングするための改善されかつ単純化された方法が必要とされている。本発明はこの課題に対処し、固体支持体、特に、セルロース由来支持体からの核酸の単一段階増幅に使用することができる方法及びキットを提供する。

米国特許出願公開第２００４／１０１８９５号明細書

本発明は、ＤＮＡ試料を容易に増幅するための、固体支持体を核酸と接触させ、固体支持体の存在下で核酸を増幅させることによって核酸を増幅するために使用することができる方法及びキットを提供する。

本発明の第１の態様では、核酸の増幅方法であって、
ｉ）カオトロピック塩を含む固体支持体を、核酸を含む細胞試料と接触させる段階と、
ｉｉ）固体支持体を反応容器に移す段階と、
ｉｉｉ）固体支持体上の核酸を核酸増幅試薬溶液と共にインキュベートする段階と、
ｉｖ）核酸を増幅して増幅核酸を生じさせる段階と、
ｖ）増幅核酸を定量化する段階と、任意には
ｖｉ）短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ；ショートタンデムリピート）プロファイリングを用いてＳＴＲプロファイルを作製する段階と
を含んでいて、段階ｉ）〜ｖｉ）が固体支持体の存在下で実施される方法が提供される。

固体支持体の存在下で核酸を増幅することの利点は、核酸増幅に要する段階の数を減らし、したがって、オペレータ時間を節約し、オペレータ使用を促進することである。

本発明の一態様では、細胞試料を添加する前に、固体支持体が既に反応容器内にある。

別の態様では、増幅法がポリメラーゼ連鎖反応である。

別の態様では、増幅法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含む。

別の態様では、核酸増幅試薬溶液がポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液及び１種以上のプライマーを含み、プライマーが任意には色素で標識されている。このような染料には、蛍光色素ＦＡＭ（商標）又はＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＣｙＤｙｅＤＩＧＥＦｌｕｏｒ（商標）（製品コードＲＰＫ０２７２）が含まれ得る。核酸増幅試薬溶液は、「Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（商標）」（ＲＴＧ）フォーマットなどの乾燥形態で存在し得る。ポリメラーゼ連鎖反応試薬の乾燥又は凍結乾燥配合物の利点は、これらが水の添加によって容易に溶解され得るので、オペレータ時間を節約し、オペレータ使用を促進するということである。オペレータエラーを最小化するために、乾燥試薬混合物を、マルチウェルプレートのウェルなどの反応容器に予め分配する（ｐｒｅ−ｄｉｓｐｅｎｓｅｄ）ことができる。このようなＲＴＧ混合物の例としては、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能な「ＩｌｌｕｓｔｒａＲｅａｄｙ−ｔｏ−ＧｏＲＴ−ＰＣＲビーズ」（製品コード：２７−９２６６−０１ＩｌｌｕｓｔｒａＲｅａｄｙ−ｔｏ−ＧｏＲＴ−ＰＣＲビーズ）が挙げられる。

別の態様では、ＳＴＲプロファイル試薬がＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１８Ｄ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ２１、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘＦｕｓｉｏｎ、ＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒＤｉｒｅｃｔ、ＧｌｏｂａｌｆｉｌｅｒＥｘｐｒｅｓｓ及びＹ−ＦｉｌｅｒＤｉｒｅｃｔからなる群から選択される。

別の態様では、核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。「核酸」という用語は、本明細書において「ヌクレオチド」という用語と同義的に使用され、プラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ；ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ及びＲＮＡｉなどのＲＮＡ；並びにタンパク質核酸、ＰＮＡを含む。

一態様では、カオトロピック塩がグアニジン塩である。

別の態様では、グアニジン塩がチオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン及び塩酸グアニジンからなる群から選択される。

一態様では、カオトロピック塩がヨウ化ナトリウムのようなナトリウム塩である。

別の態様では、固体支持体が段階ｉ）の後で、水溶液で洗浄される。

一態様では、固体支持体がガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体、セルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、シリカ酸化物（ｓｉｌｉｃａｏｘｉｄｅ）、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、羊毛及び多孔質セラミックからなる群から選択される。

別の態様では、固体支持体がセルロース系マトリックスである。

別の態様では、セルロース系マトリックスが予備穿孔ディスク（ｐｒｅｐｕｎｃｈｅｄｄｉｓｃ）の形態である。

別の態様では、セルロース系マトリックスがＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅカードの形態である。

別の態様では、セルロース系マトリックスが指示ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅ（ｉＦＴＡｅ）カードの形態であり、色素が生体試料の存在を示す。

一態様では、増幅核酸がＰＣＲイメージングシステムを用いて定量化される。

一態様では、細胞試料が真核又は原核細胞、ウイルス、細菌、植物及び組織培養細胞からなる群から選択される。

別の態様では、細胞試料が血液、血清、精液、脳脊髄液、滑液、リンパ液、唾液、頬側、子宮頸部細胞、膣細胞、尿、糞便、毛髪、皮膚及び筋肉からなる群から選択される。細胞試料は哺乳動物、鳥類、魚類もしくは植物又はこれらの細胞培養物に由来し得る。好ましくは、細胞試料は哺乳動物起源、最も好ましくはヒト起源のものである。核酸を含む試料は任意の供給源に由来し得る。これには、例えば、ヒト及び動物の生理学的／病理学的体液（例えば、分泌物、排泄物、滲出物）又は細胞懸濁液；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁液；細菌、真菌、プラスミド、ウイルス、プリオン等の液体産物、抽出物又は懸濁液；ヒト又は動物体組織（例えば、骨、肝臓、腎臓等）の液体抽出物又はホモジネート；ＤＮＡ又はＲＮＡ合成からの媒体、化学的又は生化学的に合成したＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；及びＤＮＡ又はＲＮＡが液体媒体中にある又はあり得る任意の他の供給源が含まれる。

別の態様では、本方法が分子診断ツール、人物識別ツール、法医学的ツール、ＳＴＲプロファイリングツール及びＤＮＡプロファイリングからなる群から選択されるツールとして使用するためのものである。

別の態様では、核酸が段階ｉｉ）の前に固体支持体上に保存される。

一態様では、核酸が３０分間以上固体支持体上に保存される。核酸はさらに長期間、例えば、２４時間以上、７日間以上、３０日間以上、９０日間以上、１８０日間以上、１年間以上及び１０年間以上、固体支持体上に固定化され得る。こうして、核酸は、その後の分析に適した乾燥形態で保存され得る。典型的には、試料は−２００℃〜４０℃の温度で保存される。さらに、保存される試料は任意には、乾燥もしくは脱水条件下又は不活性雰囲気下で保存され得る。

本発明の方法は、Ｂａｒｏｎら（２０１１、ＦｏｒｅｎｓｉｃｓＳｃｉｅｎｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ＧｅｎｅｔｉｃｓＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＳｅｒｉｅｓ、９３、ｅ５６０〜ｅ５６１）によって記載されている自動化試料処理と組合せて単一管又は高スループット９６ウェルフォーマットで使用することができる。この手法は、最小数の段階を伴い、試料スループットを増加させるだろう。この手順は、現在使用されている労働集約型のキット（例えば、ＱＩＡｍｐＤＮＡ血液ミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）に関連するプロトコルと比べて要する操作が少ないので、交差汚染などのオペレータ誘発エラーのリスクも低下する。この手順は要する操作が少ないので、試料混同のリスクも低下する。重要なことに、本方法は高スループットスクリーニングのためのマルチウェルフォーマットに容易に移転可能である。したがって、本発明は、遺伝子照合を助けるためにＰＣＲ反応を行うための試料処理を改善することができる。本発明を９６ウェル／高スループットフォーマットで行って、試料処理を促進し、したがって試料のバッチ処理を排除することができる。

別の態様では、反応容器がマルチウェルプレートのウェルである。マルチウェルプレートは、６、１２、２４、９６、３８４ウェル（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ３８４ウェルマルチウェルプレート、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含む種々のフォーマットで入手可能である。

一態様では、固体支持体からディスクを穿孔又は切断することによって、試料が反応容器に移される。固体支持体から一部又はディスクを穿孔することは、ＨａｒｒｉｓＭｉｃｒｏＰｕｎｃｈ（ＷｈａｔｍａｎＩｎｃ．；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）などの穿孔器を使用することによって行うことができる。

本発明の第２の態様では、
ｉ）溶解試薬を含む固体支持体を、核酸を含む細胞試料と接触させる段階と、
ｉｉ）固体支持体を反応容器に移す段階と、
ｉｉｉ）固体支持体上の核酸を核酸増幅試薬溶液と共にインキュベートする段階と、
ｉｖ）核酸を増幅して増幅核酸を生じさせる段階と、
ｖ）増幅核酸を定量化する段階と、
を含む、核酸を増幅方法であって、
段階ｉ）〜ｖ）が固体支持体の存在下で実施される方法が提供される。

一態様では、細胞試料を添加する前に、固体支持体が既に反応容器内にある。

別の態様では、増幅法がポリメラーゼ連鎖反応である。

別の態様では、溶解試薬が界面活性剤、洗浄剤及びカオトロピック塩からなる群から選択される。

別の態様では、溶解試薬がドデシル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、塩酸グアニジン及びヨウ化ナトリウムからなる群から選択される。

別の態様では、固体支持体にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び尿酸が含浸している。

一態様では、固体支持体がＦＴＡ（商標）予備穿孔ディスクの形態である。

別の態様では、セルロース系マトリックスが指示ＦＴＡ（商標）（ｉＦＴＡ）カードの形態であり、色素が生体試料の存在を示す。

別の態様では、固体支持体がガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体又はセルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、シリカ酸化物、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、羊毛又は多孔質セラミックからなる群から選択される。

別の態様では、細胞試料が血液、血清、精液、脳脊髄液、滑液、リンパ液、唾液、頬側、子宮頸部及び膣細胞、尿、糞便、毛髪、皮膚及び筋肉からなる群から選択される。細胞試料は哺乳動物、鳥類、魚類もしくは植物又はこれらの細胞培養物に由来し得る。好ましくは、細胞試料は哺乳動物起源、最も好ましくはヒト起源のものである。核酸を含む試料は任意の供給源に由来し得る。これには、例えば、ヒト及び動物の生理学的／病理学的体液（例えば、分泌物、排泄物、滲出物）又は細胞懸濁液；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁液；細菌、真菌、プラスミド、ウイルス、プリオン等の液体産物、抽出物又は懸濁液；ヒト又は動物体組織（例えば、骨、肝臓、腎臓等）の液体抽出物又はホモジネート；ＤＮＡ又はＲＮＡ合成からの媒体、化学的又は生化学的に合成したＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；及びＤＮＡ又はＲＮＡが液体媒体中にある又はあり得る任意の他の供給源が含まれる。

本発明の第３の態様では、本明細書においてのように核酸を増幅するためのキット及びそれを使用するための説明書が提供される。

未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅのＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイル（複製番号１）を提示する図である。未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅのＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイル（複製番号２）を提示する図である。未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅのＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイル（複製番号３）を提示する図である。対照ＤＮＡ試料のＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイルを提示する図である。直接増幅した洗浄血液をスポットしたｉＦＴＡｅのｑＰＣＲ増幅からのＤＮＡ収率を提示する図である。直接又は溶出後に増幅した未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅのｑＰＣＲ増幅からのＤＮＡ収率を提示する図である。

使用する化学物質及び材料
化学物質及びその供給源の一覧を以下に示す：
指示ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅマイクロ（ＷＢ１２０２１８及びＷＢ１２０４１１）；
指示ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅカセット（ＷＢ１２０２３０）；
正常ヒト血液（ＴｉｓｓｕｅＳｏｌｕｔｉｏｎｓＬｔｄ）；
ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ製品コードＧ１５２Ａ）；
ＨａｒｒｉｓＵｎｉ−ｃｏｒｅ穿孔器、１．２ｍｍ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ７０８８６０−２５ｅａ、ロット３１１０）；
ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲマスターミックス、ｎｏＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部品番号４３２４０１８）；
ＴａｑＭａｎＲＮａｓｅＰＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部品番号４３１６８３１）−ＲＮアーゼＰプライマーを含む；
ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１８Ｄ（ＰｒｏｍｅｇａコードＤＣ１８０２）−プライマーを含む；
滅菌水（Ｓｉｇｍａ製品コードＷ４５０２）；
ヒト子宮頸部上皮細胞（ＨｅＬａ）（ＡＴＣＣコードＣＣＬ−２）及び
Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（ＡＢＩコード４３１１３２０）
実験結果
Ｈｅｌａ細胞をスポットしたＥｌｕｔｅＦＴＡカードからのＳＴＲプロファイル
２．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度の培養ＨｅＬａ細胞を、指示ＦＴＡＥｌｕｔｅ（ｉＦＴＡｅ）カードにスポットした。細胞をスポットしたＦＴＡＥｌｕｔｅカードから１．２ｍｍパンチを取り、最終体積２５μｌ用の直接ＳＴＲキットＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１８Ｄ反応ミックスと合わせた。増幅前に、２５μｌ試料ミックスを９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに添加した。１０秒試料注入を用いて３１３０ｘｌキャピラリー電気泳動で試料を分析した。

ＰＣＲ反応を以下の通り設定した：
標準及び試料を適当なウェルに添加した。プレートを密閉し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ＰＣＲをＧｅｎｅａｍｐ／ＡＢＩ９７００ＴｈｅｒｍｏＣｙｃｌｅｒにより以下の熱サイクル条件下で行った：９６℃２分間、引き続いて２８サイクルの９４℃１０秒間、６０℃１分間、引き続いて６０℃２０分間、引き続いて４℃。増幅後、キャピラリー電気泳動を用いて、ＰＣＲ産物の視覚化を行った。結果を図１〜図４に示す。

図１は、ＳＴＲＰＣＲ試薬と組合せた、未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットした指示ＦＴＡＥｌｕｔｅカードのＳＴＲプロファイル（複製１）を示している。平均ピーク高さは２３１３ＲＦＵであった。

図２は、ＳＴＲＰＣＲ試薬と組合せた、未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットした指示ＦＴＡＥｌｕｔｅカードのＳＴＲプロファイル（複製２）を示している。平均ピーク高さは２２６０ＲＦＵであった。

図３は、ＳＴＲＰＣＲ試薬と組合せた、未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットした指示ＦＴＡＥｌｕｔｅカードのＳＴＲプロファイル（複製３）を示している。平均ピーク高さは５３８６ＲＦＵであった。

図４は、ＳＴＲＰＣＲ試薬を用いた精製ゲノムＤＮＡのＳＴＲプロファイルを示している。平均ピーク高さは１９０４ＲＦＵであった。

ｑＰＣＲを用いた、ＨｅＬａ細胞をスポットした及び血液をスポットしたＦＴＡＥｌｕｔｅカードからのＤＮＡの定量化（表５）。

１×１０⁷細胞／ｍｌの濃度の培養ＨｅＬａ細胞又は全血を、指示ＦＴＡＥｌｕｔｅカードにスポットした。細胞をスポットしたＦＴＡＥｌｕｔｅカードから３ｍｍ又は１．２ｍｍパンチを取り、ｉＦＴＡｅ高スループット溶出プロトコルを用いて溶出又は溶出緩衝液１ｍｌで洗浄又は未洗浄のままとした。試料及びＦＴＡカード又は５μｌの溶出液を、ＴａｑＭａｎＲＮアーゼＰ検出試薬及びＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲマスターミックスを含むｑＰＣＲ反応に添加した。増幅前に、ＰＣＲ試料ミックスを９６ウェルＰＣＲプレートの個々のウェルに添加した。

指示ＦＴＡＥｌｕｔｅ高スループット溶出プロトコルは以下の通りであった：
３ｍｍパンチを９６ウェルＰＣＲプレートに添加し、滅菌水２００μｌを各ウェルに添加し、プレートを密閉し、３回（各々５秒）パルスボルテックス（ｐｕｌｓｅｖｏｒｔｅｘｅｄ）した。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離した。水を吸引及び廃棄し、滅菌水６０μｌを各ウェルに添加し、プレートを再度密閉した。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、９８℃で３０分間サーマルサイクラーに入れた。次いで、最高速度に設定したボルテックスミキサーを用いて６０回（１パルス／秒）パルスボルテックスした。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ピペットを用いて溶出液をウェルから取り出し、定量化のために別のプレート／ウェルに移した。

ＰＣＲ反応を以下の通り設定した：
標準及び試料を適当なウェルに添加した。プレートを密閉し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ＰＣＲを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて以下の熱サイクル条件下で行った：５０℃２分間、引き続いて９５℃１０分間、引き続いて４０サイクルの９５℃１５秒間、６０℃１分間。使用する検出器はＦＡＭ（商標）プローブとした。結果を表５に提示する。

表５は、洗浄及び未洗浄血液をスポットした又は細胞をスポットしたｉＦＴＡｅカードのｑＰＣＲ結果を示している。表は、３つのｑＰＣＲ反応からの平均ＤＮＡ収率（ｎｇ／μｌ）を示している。最初の３つの試料はｉＦＴＡｅカードの２つの３ｍｍパンチから溶出したＤＮＡの複製であり、第４の試料は、溶出緩衝液１ｍｌで洗浄し、次いで、リアルタイムＰＣＲを用いて増幅した血液をスポットしたｉＦＴＡｅカードの１．２ｍｍパンチのものである（データは３つの別々の試料の平均値である）。試料５〜７は、ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅカードの２つの３ｍｍパンチから溶出したＤＮＡの複製であり、第８の試料は、溶出緩衝液１ｍｌで洗浄し、次いで、リアルタイムＰＣＲ装置に使用したＨｅＬａをスポットしたｉＦＴＡｅカードの３ｍｍパンチのものである。最後の試料は、洗浄せず、リアルタイムＰＣＲ装置に直接使用したＨｅＬａをスポットしたｉＦＴＡｅカードの１．２ｍｍパンチのものであった（データは３つの別々の試料の平均値である）。スポットしていない陰性パンチはいかなる検出可能なＤＮＡももたらさなかった。

ｑＰＣＲを用いた、ＨｅＬａ細胞をスポットした及び血液をスポットしたＦＴＡＥｌｕｔｅカードからのＤＮＡの定量化（図５及び図６）。

７．５４×１０⁶細胞／ｍｌの濃度の培養ＨｅＬａ細胞又は全血を、ｉＦＴＡｅカードにスポットした。１．２ｍｍ（ＨｅＬａ及び血液試料）パンチをｉＦＴＡｅカードから取り、滅菌水１ｍｌで洗浄し、ボルテックスし、水を除去した、又は試料を未洗浄のままとした。３ｍｍ（ＨｅＬａ及び血液試料）パンチをｉＦＴＡｅカードから取り、ｉＦＴＡｅ高スループット溶出プロトコルを用いて溶出した。試料をスポットしたｉＦＴＡｅカード又は２もしくは５μｌの溶出液を、ＴａｑＭａｎＲＮアーゼＰ検出試薬及びＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲマスターミックスを含むｑＰＣＲ反応に添加した。増幅前に、ＰＣＲ試料ミックスを９６ウェルＰＣＲプレートの個々のウェルに添加した。

指示ＦＴＡＥｌｕｔｅ高スループット溶出プロトコルは以下の通りであった：
処理する各試料について、１×３ｍｍパンチ（ＨｅＬａ試料）を１．５ｍｌ管に入れた。滅菌水１ｍｌを管に添加し、３回（各々５秒）パルスボルテックスした。水を吸引及び廃棄し、パンチを９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに移した。滅菌水６０μｌを各ウェルに添加し、プレートを密閉した。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、９８℃で３０分間サーマルサイクラーに入れた。次いで、最高速度に設定したボルテックスミキサーを用いて６０回（１パルス／秒）パルスボルテックスした。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ピペットを用いて溶出液をウェルから取り出し、定量化のために別のプレート／ウェルに移した。定量化までプレートを４℃で保存した。

ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて、ＰＣＲ反応を上記のように設定した。

図５は、ｑＰＣＲ反応に直接使用した洗浄血液をスポットしたｉＦＴＡｅカードのＤＮＡ収率を示している。ｉＦＴＡｅカードの３つの異なるバッチを実験に使用した（Ａ、Ｂ及びＣ）。

図６は、ｑＰＣＲ反応に直接使用した、又は最初に溶出し、次いで、ｑＰＣＲ反応に使用した未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅカードのＤＮＡ収率を示している。ｉＦＴＡｅカードの３つの異なるバッチを実験に使用した（Ａ、Ｂ及びＣ）。

Claims

核酸の増幅方法であって、
ｉ）カオトロピック塩を含む固体支持体を、核酸を含む細胞試料と接触させる段階と、
ｉｉ）固体支持体を反応容器に移す段階と、
ｉｉｉ）固体支持体上の核酸を核酸増幅試薬溶液と共にインキュベートする段階と、
ｉｖ）核酸を増幅して増幅核酸を生じさせる段階と、
ｖ）増幅核酸を定量化する段階と、任意には
ｖｉ）短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）プロファイリングを用いてＳＴＲプロファイルを作製する段階と
を含んでいて、段階ｉ）〜ｖｉ）が固体支持体の存在下で実施される、方法。
細胞試料を添加する前の固体支持体が反応容器内にある、請求項１記載の方法。
増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１又は請求項２記載の方法。
増幅方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
核酸増幅試薬溶液がポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液及び１種以上のプライマーを含み、プライマーが任意には色素で標識されている、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
カオトロピック塩がグアニジン塩である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
グアニジン塩がチオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン及び塩酸グアニジンからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
カオトロピック塩がヨウ化ナトリウムのようなナトリウム塩である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
固体支持体が段階ｉ）の後で、水溶液で洗浄される、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
固体支持体がガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体、セルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、シリカ酸化物、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、羊毛及び多孔質セラミックからなる群から選択される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
固体支持体がセルロース系マトリックスである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
セルロース系マトリックスが予備穿孔ディスクの形態である、請求項１１記載の方法。
セルロース系マトリックスがＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅカードの形態である、請求項１１又は請求項１２記載の方法。
核酸の増幅方法であって、
ｉ）溶解試薬を含む固体支持体を、核酸を含む細胞試料と接触させる段階と、
ｉｉ）固体支持体を反応容器に移す段階と、
ｉｉｉ）固体支持体上の核酸を核酸増幅試薬溶液と共にインキュベートする段階と、
ｉｖ）核酸を増幅して増幅核酸を生じさせる段階と、
ｖ）増幅核酸を定量化する段階と
を含んでいて、段階ｉ）〜ｖ）が固体支持体の存在下で実施される、方法。
細胞試料を添加する前の固体支持体が反応容器内にある、請求項１４記載の方法。
増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１４又は請求項１５記載の方法。
溶解試薬が界面活性剤、洗浄剤及びカオトロピック塩からなる群から選択される、請求項１４乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
溶解試薬がドデシル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、塩化グアニジン及びヨウ化ナトリウムからなる群から選択される、請求項１４乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
固体支持体にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び尿酸が含浸されている、請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
固体支持体がＦＴＡ（商標）予備穿孔ディスクの形態である、請求項１４乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
固体支持体がガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体、セルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、シリカ酸化物、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、羊毛及び多孔質セラミックからなる群から選択される、請求項１４乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
固体支持体が段階ｉ）の後で、水溶液で洗浄される、請求項１４乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
増幅核酸がＰＣＲイメージングシステムを用いて定量化される、請求項１乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
細胞試料が真核細胞、原核細胞、ウイルス、細菌、植物及び組織培養細胞からなる群から選択される、請求項１乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
細胞試料が血液、血清、精液、脳脊髄液、滑液、リンパ液、唾液、頬側、子宮頸部細胞、膣細胞、尿、糞便、毛髪、皮膚及び筋肉からなる群から選択される、請求項１乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
分子診断ツール、人物識別ツール及び法医学的ツールからなる群から選択されるツールとして使用するための、請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
核酸が段階ｉｉ）の前に固体支持体上に保存される、請求項１乃至請求項２６のいずれか１項記載の方法。
核酸が３０分間以上固体支持体上に保存される、請求項１乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法。
請求項１乃至請求項２８のいずれか１項記載の方法により核酸を増幅するためのキット及びそれを使用するための説明書。