JP2011526788A - 粗製核酸サンプルからの直接増幅のための方法 - Google Patents

Abstract

本教示は、核酸を増幅するための改良した方法、キット、および反応混合物に関する。いくつかの実施態様において、新規直接緩衝剤処方が提供され、それは最低限のサンプル精製で、粗製サンプルにおいて核酸を直接増幅することを可能にする。本教示は、以下の工程を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法を提供する：デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；必要に応じてその粗製サンプルを５ｍＭから２５ｍＭのＮａＯＨとインキュベートする工程；その粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；およびそのデオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行う工程。

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００８年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／０７７，１１３号の優先権利益を主張し、この米国仮特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本教示は、一般的に粗製サンプルから核酸を直接増幅する方法に関する。

（緒言）
ＤＮＡプロファイルの迅速および正確な検出は、法医学的ケースワークサンプル分析の重要な局面である。血液および口腔スワブのような粗製サンプルは、ＰＣＲに基づく短いタンデム反復（ＳＴＲ）タイピングのために使用されるポリメラーゼの活性を阻害し得る物質を含む。歴史的に、ＰＣＲ増幅のような、下流の酵素的操作を行う前に、阻害剤を除去し、そしてＤＮＡを精製することが必要であった。多くの種類のＤＮＡ単離および精製法およびキットが、市販で入手可能である。しかし、それらの使用は、続く分析のためのサンプルの調製に時間および費用がかかる

（要旨）
本教示は、以下の工程を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法を提供する：デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；必要に応じてその粗製サンプルを５ｍＭから２５ｍＭのＮａＯＨとインキュベートする工程；その粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；およびそのデオキシリボ核酸に対してＰＣＲを行う工程、ここでその直接緩衝剤は、少なくとも３％〜８％のグリセロール、０．２％〜０．９％の非イオン性界面活性剤、および１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等を含むがこれに限らない。

本教示は、以下のものを含む、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法を提供する：デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；必要に応じてその粗製サンプルを５ｍＭから２５ｍＭのＮａＯＨとインキュベートする工程；その粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；およびその溶液に対してＰＣＲを行う工程、ここでその直接緩衝剤は、少なくとも５つのＰＣＲプライマーペア、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２〜０．９％のポリソルベート、１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む。

いくつかの実施態様において、本教示は、以下の工程を含む、ヒトのアイデンティティーを決定する方法を提供する：ヒト由来のデオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；必要に応じてその粗製サンプルを５ｍＭから２５ｍＭのＮａＯＨとインキュベートする工程；その粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程であって、ここでその直接緩衝剤は、複数のプライマーペアを含み、ここで各プライマーペアは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接する、工程；その溶液に対してＰＣＲを行って、複数のＰＣＲアンプリコンを形成する工程；ここで各ＰＣＲアンプリコンは、確認可能なサイズを有する、工程；およびそのＰＣＲアンプリコンのサイズを参照することによってヒトを同定する工程；ここでその直接緩衝剤はさらに、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％のポリソルベート、１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む。

いくつかの実施態様において、以下の工程を含む、下流の酵素的操作のために核酸を調製する方法を含む：デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；必要に応じてその粗製サンプルを５ｍＭから２５ｍＭのＮａＯＨとインキュベートする工程；その粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；およびその溶液に対して下流の酵素的操作を行う工程、ここでその直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％のポリソルベート、１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施態様において、その下流の酵素的操作はＰＣＲである。

本教示はまた、遺伝的分析のためのキットを提供し、そのキットは、複数のプライマーペア（ここで各プライマーペアは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接する）、および直接緩衝剤を含み、ここでその直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％のポリソルベート、１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施態様において、上記で述べたようなキットは、細胞溶解のために、ＮａＯＨまたは他の強アルカリ性化合物、または他の薬剤を必要に応じて含み得る。

他の実施態様は、直接緩衝剤および複数のプライマーペアを含む反応混合物であり、ここで各プライマーペアは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接し、そしてここでその直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％のポリソルベート、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施態様において、上記で述べたようなキットは、細胞溶解のために、ＮａＯＨまたは他の強アルカリ性化合物、または他の薬剤を必要に応じて含み得る。

当業者は、下記で説明する図面は、説明目的のためのみであることを理解する。その図面は、本教示の範囲を制限することを決して意図しない。
図１は、血液サンプル由来のゲノムＤＮＡのＳＴＲプロファイルの電気泳動図である。 図２Ａ−２Ｄは、ＦＴＡ紙にスポットした４つの血液サンプルの失敗したＳＴＲプロファイルの電気泳動図である。 図２Ａ−２Ｄは、ＦＴＡ紙にスポットした４つの血液サンプルの失敗したＳＴＲプロファイルの電気泳動図である。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。 図３Ａから１２Ｂまでは、その血液をＦＴＡ紙にスポットした１０人の個人由来のＳＴＲプロファイルの比較電気泳動図であり、そのパンチは、本明細書中の本教示の直接緩衝剤中にあり、そして「Ａ」と示す。一方、「Ｂ」と示す電気泳動図は、Ｐｒｏｍｅｇａによって販売されるＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６ＨＳ精製システムを用いて調製した、同じ１０人の個人の血液のＳＴＲプロファイルを示す。

代表的な実施態様の説明
この出願において、単数形の使用は、他に特に明記しない限り、複数形を含む。この出願において、「ａ」または「ａｎ」という語は、他に特に明記しない限り、「少なくとも１つ」を意味する。この出願において、「または」の使用は、他に述べなければ、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形式の使用は、制限しない。

本明細書中で使用される段落の見出しは、組織化の目的のみのためであり、そして記載される内容を制限すると解釈されない。特許、特許出願、論文、書籍、および専門書を含むがこれに限らない、この出願において引用される、全ての文書、または文書の部分は、本明細書によって明確にあらゆる目的のためにその全体として参考文献に組み込まれる。１つまたは複数の組み込まれた文書が用語を定義し、それがこの出願における用語の定義と矛盾する場合、この出願が統制する。

いくつかの定義
本明細書中で使用される場合、「粗製サンプル」という用語は、核酸を含むことが推測される、生物学的起源の標本を指し、それはそれらの核酸の単離または精製のための手順を経ていない。例えば、血液のサンプルは粗製サンプルである。粗製サンプル中の細胞を、必要に応じて溶解し得る。さらに、ＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎから市販で入手可能）のような、溶解試薬を含む紙にスポットした血液のサンプルは、粗製サンプルである。頬細胞の口腔スワブは、粗製サンプルの別の例である。粗製サンプルは、血液、希釈した血液、紙上の血液、口腔スワブ、およびＦＴＡ紙のような、サンプル保存のための基質上の口腔スワブを含むがこれに限らない。当業者は、非常に多数の様々な他の粗製サンプルを認識し、その分析は本教示によって促進されるであろう。

本明細書中で使用される場合、「直接緩衝剤」という用語は、粗製サンプルを入れることができる緩衝剤を指す。その直接緩衝剤は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような、下流の酵素的操作を行うためのプライマーおよび酵素を含む。その直接緩衝剤は、いかなる核酸単離または精製の必要無しに、核酸の遊離、および直接緩衝剤中で直接の増幅を可能にする。実例となるＰＣＲのサイクリング時間および温度を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、１９９３において見出し得る。本教示は、ＰＣＲのための直接緩衝剤の使用に焦点を合わせるが、当業者は、本教示の直接緩衝剤を、他の型の下流の酵素的操作、例えば逆転写酵素を用いた逆転写、またはリガーゼを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイのための着手段階の手順として、容易に採用し得ることを認識する。

本明細書中で使用される「下流」は、標的核酸に対して行われる方法および操作に関して使用される場合、核酸を細胞から遊離するための細胞の溶解を含むがこれに限らない、生物学的サンプルから核酸を遊離するための方法に続いて標的核酸サンプルに対して行われる方法および操作を指す。

本明細書中で使用される「下流の酵素的操作」は、ポリメラーゼを用いたＰＣＲ、逆転写酵素を用いた逆転写、またはリガーゼを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを含むがこれに限らない、核酸サンプルに対して行われる手順を指す。

本明細書中で使用される「強アルカリ性化合物」という用語は、ＮａＯＨを含むがこれに限らない。強アルカリ性化合物を、直接緩衝剤のいくつかの実施態様の添加の前に細胞を溶解するために使用し得る。

本明細書中で使用される「ゲノムＤＮＡ」という用語は、非翻訳領域ならびに翻訳領域のＤＮＡ配列を含む、遺伝子または遺伝子のセグメントの染色体ＤＮＡ配列を指す。ゲノムＤＮＡはまた、細胞または染色体から直接単離されたＤＮＡまたはそのようなＤＮＡの全てまたは一部のクローニングされたコピーを指す。

本明細書中で使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子またはＤＮＡのセグメントと関連する遺伝的変異、すなわち同じ遺伝子座を占める２つまたはそれを超える代替形式のＤＮＡ配列の１つを指す。

本明細書中で使用される「遺伝子座」という用語は、染色体または核酸分子における特定の位置を指す。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体の同じ部位に位置する。

本明細書中で使用される「短いタンデム反復（ＳＴＲ）遺伝子座」という用語は、長さが３から７塩基対の短い反復性の配列エレメントを含む、ヒトゲノムの任意の領域を指す。

本明細書中で使用される「短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含むゲノム遺伝子座」という用語は、ＳＴＲ遺伝子座を指し、ここでゲノムＤＮＡの特定の領域における反復配列エレメントの数（および配列の全体の長さ）は、対立遺伝子ごと、および個人ごとに異なる。

本明細書中で使用される「増幅プライマー」および「プライマー」という用語は、オリゴヌクレオチドを指し、それは標的配列に隣接するＲＮＡまたはＤＮＡ領域に、部位特異的にアニーリングし得、そしてプライマー伸長産物の合成が誘導される、適当な条件下で、例えばヌクレオチドおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのような重合誘導薬剤の存在下で、そして適当な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度において、ＤＮＡ合成の開始プライマーとして作用し得る。典型的には、ＰＣＲ反応は、「上流」または「順方向」プライマーおよび「下流」または「逆方向」プライマーを含む、「プライマーペア」としても公知である、増幅プライマーのペアを用い、それは増幅されるＲＮＡまたはＤＮＡの領域の限界を決める。

本明細書中で使用される「増幅する」という用語は、核酸の一部を、例えば広い範囲のプライマー伸長反応のいずれかを用いて複製する過程を指す。代表的なプライマー伸長反応は、ＰＣＲを含むがこれに限らない。特に明記しない限り、「増幅する」は単回の複製または算術的、対数的、または指数的増幅を指す。

本明細書中で使用される「アンプリコン」および「ＰＣＲアンプリコン」という用語は、直線的または指数的のいずれかで、ポリヌクレオチド配列を増加させるための広い範囲の技術を指し、そして増幅反応の産物であり得る。アンプリコンは、二本鎖または一本鎖であり得、そして二本鎖増幅産物を変性することによって得られた分離した成分の鎖を含み得る。ある特定の実施態様において、１回の増幅サイクルのアンプリコンが、続く増幅サイクルの鋳型として働き得る。代表的な増幅技術は、ＰＣＲまたはプライマー伸長工程を採用するあらゆる他の方法を含むがこれに限らない。増幅の他の制限しない例は、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むがこれに限らない。増幅方法は、熱サイクリングを含み得る、または等温で行い得る。様々な実施態様において、「増幅産物」という用語は、増幅反応のあらゆるサイクル数からの産物を含む。

本明細書中で使用される「核酸配列」という用語は、核酸物質そのものを指し得、そして生化学的に特定の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特徴付ける、配列情報（すなわち、５つの塩基の文字、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵから選択される文字の連続）に限定されない。

本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間結合によって連結した、デオキシリボ核酸、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、ポリアミド核酸等を含む、天然または修飾モノマーまたは結合の直鎖状ポリマーを指し、そしてワトソン−クリック型の塩基対形成のような、モノマー対モノマーの相互作用の通常のパターンによって、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する能力を有し、そして鋳型による反応において、別のオリゴヌクレオチドへライゲーションし得る。通常、モノマーはホスホジエステル結合またはそのアナログによって結合して、数個のモノマー単位、例えば３〜４個のモノマー単位から、数百のモノマー単位までの範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチドを、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表す場合はいつでも、他に示さなければ、そのヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順であり、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」はデオキシチミジンを意味することが理解される。当該分野において標準であるように、文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを、塩基自体、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを指すために使用し得る。天然に存在するポリヌクレオチドにおいて、ヌクレオシド間結合は、典型的にはホスホジエステル結合であり、そしてそのサブユニットは「ヌクレオチド」と呼ばれる。

本明細書中で使用される「配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」、「ヌクレオチド塩基配列を決定する」、「配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、同定および同様の用語は、部分的および完全な配列情報の決定を含む。すなわち、その用語は、配列の比較、フィンガープリンティング、および標的ポリヌクレオチドについての同様のレベルの情報、および目的の領域内の標的ポリヌクレオチドの各ヌクレオシドの明白な同定および順序付けを含む。ある特定の実施態様において、「配列決定」は、単一ヌクレオチドの同定を含み、一方他の実施態様において、１超のヌクレオチドを同定する。ヌクレオシド、ヌクレオチド、および／または塩基の同定は、本明細書中で等価であると考えられる。ポリヌクレオチドに対する配列決定の実施は、典型的には完全に相補的なポリヌクレオチドの配列に関する等価な情報を生じ、そして従って完全に相補的なポリヌクレオチドに対して直接行った配列決定と等価であることに留意する。

本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドプローブに関して「複数」は、２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドプローブのセットを含み、ここで通常標的ポリヌクレオチドの非可変性領域に特異的な、単一の「共通」オリゴヌクレオチドプローブ、および通常配列に対立遺伝子または突然変異の変異体を含む標的ポリヌクレオチドの領域に特異的な、１つまたは複数の「野生型」および／または「突然変異体」オリゴヌクレオチドプローブが存在し得る。

本明細書中で使用される「核酸ポリメラーゼ」または「ポリメラーゼ」は、存在するポリヌクレオチドを鋳型として使用する、ポリヌクレオチドの合成を触媒する任意のポリペプチドを指す。

本明細書中で使用される「ＤＮＡポリメラーゼ」は、存在するポリヌクレオチドを鋳型として使用する、ＤＮＡの合成を触媒する核酸ポリメラーゼを指す。

詳細な説明
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ＢＳＡ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２、および一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、グリセロール、および非イオン性界面活性剤を含む、所望の直接緩衝剤の各成分の濃度をそれぞれ変えて、多数の実験を行った。これらの実験は、例えばフミン酸を、分析するのが困難な生物学的物質のサンプルに典型的に存在する阻害剤の代表として使用し、そして従って粗製サンプルの代用物を容易に産生するのに役立った。これらの実験の結果は、以下の処方が、サンプルを分析してＳＴＲ対立遺伝子を同定する場合に、高い品質の結果を生じるために特に有効であったことを示した。

本教示は、３％〜８％のグリセロール、０．２％〜０．９％の非イオン性界面活性剤、および１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む直接緩衝剤を含む。

本教示は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％の非イオン性界面活性剤、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む直接緩衝剤を含む。

いくつかの実施態様において、その非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ、Ｔｗｅｅｎ２０）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等であり得る。

直接緩衝剤において使用される試薬は、容易に商業的供給業者から入手可能である。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販で入手可能である。適当なＤＮＡポリメラーゼは、ＰｏｌＡ、ＰｏｌＢ、ＰｏｌＣ、ＰｏｌＤ、ＰｏｌＸ、およびＰｏｌＹ ＤＮＡポリメラーゼおよびＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼを含む。一般的に、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔ^ＴＭＤｅｅｐＶｅｎｔ^ＴＭ、９°Ｎｏｒｔｈ^ＴＭのような、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲにおいて使用する。ＤＮＡポリメラーゼを、続く処理、例えば加熱の前には不活性であるように修飾し得る；例えば米国特許第５，７７３，２５８号（化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼ）、米国特許第５，３３８，６７１号（抗体結合ＤＮＡポリメラーゼ）を参照のこと。ＤＮＡポリメラーゼは、当業者に公知である。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型として使用するＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、またはＲＮＡを鋳型として使用する、逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性ポリメラーゼを含む。

配列相同性に基づいて、細菌のＤＮＡポリメラーゼを、７つの異なるファミリー：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴに細分し得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、６つのファミリー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、およびＹ）のうち１つに入り、ほとんどは３つのファミリー（Ａ、Ｂ、およびＣ）のうちの１つに入る。例えばＩｔｏら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０４５−４０５７；Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：７８７−８０２；Ｆｉｌｅｅら（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５４：７６３−７７３；およびＡｌｂａ（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２：３００２．１−３００２．４を参照のこと。ある特定のＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖ポリペプチド（例えばある特定のファミリーＡおよびＢポリメラーゼ）、またはサブユニットのうち１つがポリメラーゼ活性を有する、多サブユニットの酵素（例えばある特定のファミリーＣポリメラーゼ）であり得る。同上文献。融合タンパク質は、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、またはＹポリメラーゼから選択されたＤＮＡポリメラーゼを含み得る。

ファミリーＡポリメラーゼ（「ＰｏｌＡ」）は、複製ポリメラーゼおよび修復ポリメラーゼの両方を含む。このファミリーの複製メンバーは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよび真核生物ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼｙを含む。修復ポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＰｏｌＩ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＰｏｌＩが含まれる。除去修復およびラギング鎖合成の間に産生される岡崎フラグメントのプロセッシングは、修復ポリメラーゼによって行われる。ほとんどの熱安定性ＰｏｌＡ酵素は、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有さないので、それらは新規に合成された核酸鎖のプルーフリーディングができず、そして従って高いエラー率を有する。

ファミリーＢポリメラーゼ（「ＰｏｌＢ」）は、主な真核生物ＤＮＡポリメラーゼα、δ、ε、およびＤＮＡポリメラーゼζも含む、実質的に複製ポリメラーゼである。ＰｏｌＢポリメラーゼはまた、いくつかの細菌およびバクテリオファージによってコードされるＤＮＡポリメラーゼを含み、そのうち最もよく特徴付けられているのはＴ４、Ｐｈｉ２９およびＲＢ６９バクテリオファージ由来のものである。ＰｏｌＢ酵素は、リーディングおよびラギング鎖両方の合成に関与し、そしてプルーフリーディング活性を欠くＤＮＡポリメラーゼαおよびζを除いて、多くが強力な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するので、複製の間のその著しい正確性に留意すべきである。

ＢＳＡは、様々な供給元から、例えばＲｏｃｈｅのカタログ番号１０７１１４５４００１から市販で入手可能である。ＦＴＡ紙は、Ｗｈａｔｍａｎから市販で入手可能である。いくつかの実施態様において、ＦＴＡ紙は、本明細書中で血痕を用いて使用される。例えば、ＷｈａｔｍａｎのＢｌｏｏｄｓｔａｉｎ Ｃａｒｄ（カタログ番号ＷＢ１０００１４）。

いくつかの実施態様において、血液または口腔細胞を含むＦＴＡ紙を切って、生物学的材料を含む小さい領域、例えば直径０．５ｍｍから１．２ｍｍ、または直径１．０〜１．５ｍｍ、または直径１．５〜２．０ｍｍの円形パンチを除去する。

いくつかの実施態様において、その紙を、ＰＣＲ反応のための直接緩衝剤を含むＰＣＲ混合物へ直接入れる。いくつかの実施態様において、ＦＴＡ紙を直接緩衝剤へ入れる前に、ＦＴＡ紙の洗浄は必要でない。

いくつかの実施態様において、細胞を最初に溶解しない場合、例えば非ＦＴＡ紙を使用する場合、直接緩衝剤と混合し、そしてＰＣＲ反応を行う前に、５〜２５ｍＭのＮａＯＨ溶液を、非ＦＴＡとインキュベートする。他の実施態様において、その細胞を、ＮａＯＨ以外の試薬へ曝露させることによって溶解し得る。

いくつかの実施態様において、その直接緩衝剤はさらに、複数のＰＣＲプライマーペアを含む。例えば、いくつかの実施態様において、その直接緩衝剤は、５個のプライマーペアを含む。いくつかの実施態様において、その直接緩衝剤は、１０個のプライマーペアを含む。いくつかの実施態様において、その直接緩衝剤は、１０個超のプライマーペアを含む。いくつかの実施態様において、その直接緩衝剤は、ＰＣＲプライマーペアを含まないが、ＰＣＲプライマーペアを別々の時間に加える。

本方法のいくつかの実施態様は、ＰＣＲを実施する前のサンプル精製手順の必要性を排除する。同じプロトコールを、ＦＴＡカード上の血液サンプルおよび口腔細胞サンプルの両方に適用し得る。それに加えて、物理的なサンプル取り扱いが著しく減り、従ってこれはサンプル間の可能性のある交差汚染を予防し得、ならびにヒューマンエラーの可能性を排除し得る。いくつかの実施態様において、ＦＴＡカードからＳＴＲプロファイルまでに必要な時間を、少なくとも１１／２時間減らし得る。その方法は、法医学的市場で入手可能な現在の自動化装置と適合性である。ＤＮＡのＦＴＡからの精製に関するコストを排除し得る。従来の標準的サンプル調製方法と比較した場合、完全なＳＴＲプロファイルを得る成功率は匹敵する。

図１に示すように、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨＩＤｖ．１ Ｋｉｔともに直接使用したゲノムＤＮＡのサンプルは、完全なＳＴＲプロファイルを提供する。しかし、ディスクを洗浄して次のサンプル試験（例えば直接ＰＣＲによるＳＴＲプロファイリング）に干渉する物質を除去しなまま、ゲノムＤＮＡをＦＴＡディスクパンチ（１．２ｍｍのパンチ）にスポットされた血液から取った場合、ＳＴＲプロファイルは、部分的または検出不能のいずれかである、図２Ａ−２Ｄを参照のこと。

特許請求される発明および他からの市販で利用可能な製品の間のさらなる比較データは、全ての場合において、特許請求される発明の直接緩衝剤は、１．２ｍｍサイズのパンチを用いてＦＴＡ紙にスポットされた１０個の血液サンプルのうち１０個において、直接ＰＣＲによって完全なＳＴＲプロファイルを提供することを明らかにする（具体的には、図３〜１２、「Ａ」と示された電気泳動図）。別のＳＴＲキットによって、試験した１０個のサンプルのうち４つのみにおいて、完全なＳＴＲプロファイルが見られ（図３Ｂ、４Ｂ、７Ｂ、および８Ｂ）、部分的なＳＴＲプロファイルが試験した１０個のサンプルのうち５個において見られ（図５Ｂ〜７Ｂおよび９Ｂ〜１０Ｂ）、そして１つのサンプルにおいてはＳＴＲプロファイルが見られなかった（図６Ｂ）。

最初の実施例において、血液をＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎ）にアプライし、そして空気乾燥した。０．５ｍｍのディスクパンチをＦＴＡ紙から作成し、そして市販で入手可能なＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標） Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）由来のＰＣＲプライマーを含む直接緩衝剤中に置いた。次いでＰＣＲを行った。

２番目の実施例において、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて、血液の１００倍希釈物を作成した。希釈した血液の１μｌを使用して、直接緩衝剤中でのＰＣＲを設定した。

３番目の実施例において、口腔スワブサンプルを採取し、そして５００μｌのＴＥ緩衝液内に置いた。得られた懸濁液を９７℃で５分間加熱した。得られた懸濁液の１０μｌを使用して、直接緩衝剤中でＰＣＲを設定した。

本教示のいくつかの実施態様による代表的なキット
本教示はまた、ある特定の方法の実施を促進するためにデザインされたキットを提供する。いくつかの実施態様において、キットは、その方法の実施において使用される２つまたはそれを超える成分を集めることによって、目的の方法の実施を促進するのに役立つ。いくつかの実施態様において、キットは、末端使用者による測定の必要性を最小限にするために、前もって測定した単位量にある成分を含み得る。いくつかの実施態様において、キットは、本教示の１つまたは複数の方法を実施するための説明書を含み得る。ある特定の実施態様において、そのキットの成分は、お互いに組み合わせて操作するために最適化される。

本教示は、これらの代表的な実施態様および実験データに関して記載されたが、当業者は、これらの代表的な実施態様の多数のバリエーションおよび修飾が、過度の実験無しに可能であることを容易に理解する。全てのそのようなバリエーションおよび修飾は、本教示の範囲内である。

従って、いくつかの実施態様において、本教示は以下のものを含むキットを提供する：複数のプライマーペア、ここで各プライマーペアは短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接する；および直接緩衝剤、ここでその直接緩衝剤は１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％の非イオン性界面活性剤、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを含む

そのようなキットを、例えばキャピラリー電気泳動を用いて分析された多型性マイクロサテライトの収集によって、例えばヒトなどの生物の同定において使用し得る。そのようなヒト同定を実施するための説明的な手順を、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販で入手可能なＩｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨＩＤキット、および米国特許第６，２２１，５９８、６，４７９，２３５、５，８４３，６６０、および７，００８，７７１号において見出し得る。いくつかの実施態様において、本教示によって提供されるキット、方法および反応混合物を、例えばＤｉｍｓｏｓｋｉおよびＷｏｏに対するＷＯ０５０５４５１５において見出されるように、分解サンプルのマルチプレックスＰＣＲのための手順と共に使用し得る。

いくつかの実施態様において、キット中の直接緩衝剤は、０．２％〜０．９％のポリソルベート、３％〜８％のグリセロール、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。

いくつかの実施態様において、キット中の直接緩衝剤はさらに、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％のポリソルベート、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを含む。

いくつかの実施態様において、そのキット中の直接緩衝剤はさらに（ｆｅａｔｕｒｅ）、５ｍＭ〜２５ｍＭのＮａＯＨを含む。いくつかの実施態様において、そのＮａＯＨは、直接緩衝剤とは別のバイアルで供給される。

特許、特許出願、論文、書籍、専門書、およびインターネットのウェブページを含むがこれに限らない、本出願において引用された全ての文献および同様の資料は、そのような文献および同様の資料の形態に関わらず、あらゆる目的のためにその全体として明確に参考文献に組み込まれる。２００７年３月２３日に出願された米国特許出願番号第６０／８９６，６６８号、２００７年５月１７日に出願された米国特許出願番号第１１／７５０，３１６号、および２００８年３月２４日に出願された米国特許出願番号第１２／０５４，１７４号は、それらが含む全てに関して、その全体として本明細書中で参考文献に組み込まれる。

本教示は、様々な実施態様に関して記載されるが、本教示がそのような実施態様に制限されることを意図しない。対照的に、本教示は、当業者によって認識されるように、様々な代替物、修飾、および同等物を含む。

Claims (15)

1. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって、該方法は：
   デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；
   該粗製サンプルをＮａＯＨと必要に応じてインキュベートする工程；
   該粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；および
   該核酸を含む溶液に対してＰＣＲを行う工程を含み、該直接緩衝剤は、少なくとも０．２％〜０．９％のポリソルベート、３％〜８％のグリセロール、および１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ
   を含む、方法。
2. 前記直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリソルベートは、ポリソルベート２０である、請求項１に記載の方法。
4. ヒトのアイデンティティーを決定する方法であって、該方法は：
   ヒト由来のデオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；
   該粗製サンプルをＮａＯＨと必要に応じてインキュベートする工程；
   該粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程であって、ここで該直接緩衝剤は、複数のプライマーペアを含み、ここで各プライマーペアは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接する、工程；
   該核酸を含む溶液に対してＰＣＲを行って、複数のＰＣＲアンプリコンを形成する工程であって、ここで各ＰＣＲアンプリコンは、確認可能なサイズを有する、工程；および
   該ＰＣＲアンプリコンのサイズを参照することによって該ヒトを同定する工程を含み、ここで該直接緩衝剤は、０．２％〜０．９％のポリソルベート、３％〜８％のグリセロール、および１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡをさらに含む、方法。
5. 前記直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記ポリソルベートは、ポリソルベート２０である、請求項３に記載の方法。
7. 核酸を調製する方法であって、該方法は：
   デオキシリボ核酸を含む粗製サンプルを提供する工程；
   該粗製サンプルをＮａＯＨと必要に応じてインキュベートする工程；
   該粗製サンプルを直接緩衝剤と混合して、核酸を含む溶液を形成する工程；
   該溶液に対して下流の酵素的操作を行う工程を含み、該直接緩衝剤は、０．２％〜０．９％のポリソルベート、３％〜８％のグリセロール、および１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む、方法。
8. 前記下流の酵素的操作はＰＣＲである、請求項７に記載の方法。
9. 前記直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項７に記載の方法。
10. 前記直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項７に記載の方法。
11. 前記ポリソルベートは、ポリソルベート２０である、請求項７に記載の方法。
12. 以下：
    複数のプライマーペアであって、各プライマーペアは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接する、プライマーペア；および
    ０．２％〜０．９％のポリソルベート、３％〜８％のグリセロール、および１０００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む、直接緩衝剤、
    を含む、キット。
13. 前記直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１％〜０．０４％のアジ化ナトリウム、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１２に記載のキット。
14. 前記ポリソルベートは、ポリソルベート２０である、請求項１２に記載のキット。
15. 直接緩衝剤および複数のプライマーペアを含む反応混合物であって、
    各プライマーペアは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む遺伝子座に隣接し、そして
    該直接緩衝剤は、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３０〜８０ｍＭのＫＣｌ、１．４〜２．４ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０１%〜０．０４%のアジ化ナトリウム、３％〜８％のグリセロール、１００〜３５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２％〜０．９％のポリソルベート２０、１２００〜３０００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および０．１０〜０．３５Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼを含む、反応混合物。