CN112899354A - 直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法 - Google Patents

直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法。具体而言，本发明涉及可用于扩增核酸的具有减少用户的时间和可能的污染的优点的组合物、方法和试剂盒。本发明的干燥的试剂组合物可用来容易地处理和扩增核酸样品。

Description

直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2013年10月23日，申请号为201380055445.3(PCT/EP2013/072206)，发明名称为“直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法”。
发明领域
本发明涉及核酸扩增的领域，特别是涉及使用聚合酶链反应扩增核酸的用途。为容易地扩增核酸样品，本发明提供可用于通过冻干或冷冻-干燥核酸扩增试剂扩增核酸的方法和试剂盒。本发明具有在容易地处理核酸中的应用和在基因分型、诊断和法医方面是特别有用的。
发明背景
聚合酶链反应(PCR)是用于分子生物学供扩增核酸的常见工具。US4683202(Mullis, Cetus Corporation)描述了用于扩增在核酸或其混合物中所含的任何所需特定核酸序列的方法。
US5705345 (Lundin等人)描述了核酸制备的方法，其中含有细胞的样品被溶胞以释放核酸和样品用环糊精处理以中和萃取剂。这种系统的优点是传统的去垢剂去除需要一个分离步骤；然而加入环糊精以中和去垢剂排除了对分离步骤的需要，因此减少了污染的危险。
WO9938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述了一种具有结合的溶胞试剂的固体支持体。溶胞试剂可包含去垢剂、螯合剂、水和任选的RNA消化酶。用于PCR扩增的方法需要纯化核酸用于扩增分析的其它步骤。
WO9102040 (Kosak)描述了在扩增反应混合物中使用环糊精标记的引物用于定性和定量核酸序列分析的发明。该发明的益处是更高的信号效率和标记颜色的通用性。
WO9532739 (Agrawal)描述了与环糊精非共价复合的寡核苷酸。然而环糊精与寡核苷酸的结合是用于寡核苷酸的细胞摄取而不用于PCR反应中的核苷酸的扩增。
WO2010066908 (Beckers等人,)描述了环糊精改进PCR的特异性、灵敏度和/或产率的用途。该方法公开在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行的扩增反应且该扩增反应在反应混合物上进行。该PCT申请公开了用于在样品中扩增目标核酸的试剂盒，所述试剂盒在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自PCR试剂列表的成分。该申请还公开试剂盒可作为包含几种成分的预混合物提供，其也可以脱水的冻干的形式提供。然而，该申请中没有这样冻干的预混合试剂盒或者甚至此类试剂盒可如何制备的实例。
用于DNA扩增的当前方法涉及通常包含几个步骤的DNA纯化程序，其增加污染的机会。这是一个繁琐的过程，而现有技术的方法在成本、复杂性和特别是用户的时间方面具有许多明显的缺点。例如，基于柱的核酸纯化是典型的纯化核酸的固相提取方法。这种方法依赖于通过吸附结合于二氧化硅或其它支持体(取决于缓冲液的pH和盐含量)的核酸。合适的缓冲液的实例包括Tris-EDTA (TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液(由于反应性胺而用于DNA微阵列实验)。在这样的离心柱(spin column)上的核酸纯化包括许多复杂和繁琐的步骤。在离心柱上的核酸纯化通常包括3个耗时和复杂的步骤/阶段：
将含有核酸的样品加入到柱中和由于结合溶液的较低的pH (相对于在柱上的硅烷醇基)和盐浓度所致核酸结合，所述结合溶液可含有缓冲液、变性剂(如盐酸胍)、TritonX-100、异丙醇和pH指示剂；
用5 mM KPO4 pH 8.0或类似的，80% EtOH)洗涤柱；和
用缓冲液或水洗脱柱。
备选方法包括在离液剂的存在下核酸的结合，以致DNA结合于二氧化硅或玻璃颗粒或玻璃珠。这个属性被用于在碱性条件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠纯化核酸。典型的离液剂包括硫氰酸胍
Figure DEST_PATH_IMAGE001
或盐酸胍
Figure 280529DEST_PATH_IMAGE001
，最近玻璃珠已被含有玻璃的微柱取代。
定量实时逆转录聚合酶链反应的某些缺陷，包括抑制剂的作用，由Bustin &Nolan (J. Biomolecular Techniques, 2004, 15, 155-166)描述。
在法医应用中针对PCR扩增失败的最好防御是将合理的样品处理和加工技术与被证明有效纯化DNA的提取系统结合。
典型地，PCR试剂贮存在必须维持在低于室温的温度下的甘油溶液中。冻干法或冷冻干燥是一种广泛用于制备供核酸分析和其它生物过程的试剂的方法，因为它允许否则不稳定的生物分子的长期稳定性，并提供一种储存、运输和重构的便利方法。然而在涉及制备用于PCR分析的冻干或冷冻-干燥的试剂方面存在许多技术挑战。制备干燥生物试剂组合物的当前技术包括诸如干式混合、喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥和/或低温冷冻的步骤。所有这些步骤都有限制和缺点，包括一致性和可靠性。
在干式混合技术(Muzzio等人 2002, Powder Technology 124, 1-7)的情况下，由于化学物的不同的密度，往往很难获得均匀的化学物的共混物。此外，当极小量的成分与大量的其它成分混合时，均匀性是尤其难以获得的。即使获得均匀性，也难以可重复地分散小量的共混的生物化学物。
由于试剂首先溶于溶液中，喷雾-干燥技术(US4712310)提供更均匀的化学物的共混物。然而，在喷雾-干燥的情况下，分发精确量的共混化学物是困难的。为克服这个缺点，产生的颗粒通常通过团聚再加工以获得均匀的颗粒大小如片剂。然而，团聚的颗粒通常比原始喷雾-干燥的颗粒或粉末更不溶。同样，这些程序有时使用可对环境有害的碳氟化合物低温溶液。
流化床技术(Rubina, 1999, Pharmaceutical Technology, 23, 104-113)依赖于将液体试剂共混物喷雾到颗粒上并干燥液体以获得用共混的试剂包被的颗粒。使用该程序，难以获得均匀大小的颗粒并产生均匀的包衣。
用于稳定生物制剂的另一种方法是冷冻-干燥。冷冻-干燥的一个缺点是使用难以处理的碳氟化合物制冷剂和冷冻-干燥过程可能是不精确的并且还难以调节。确实，试剂的常规冷冻干燥不能提供对用于分子生物学过程的特别不稳定试剂的完整解决方案。此外，产品在冷冻干燥过程期间的降解是常见的和冷冻干燥的产品在存储期间并不总是完美稳定的。过程控制是至关重要的并且可能难以调节(Tang & Pakil, 2004, 药物冷冻-干燥方法的设计：实用建议(Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals:Practical Advice)；Pharmaceutical Research, 21, 191-200)。
稳定生物制剂的另一种方法是通过空气-干燥生物试剂组合物(Ratti, 2001, 高价值食品的热空气和冷冻-干燥：评述(Hot Air and Freeze-Drying of High ValueFoods: A Review): A Review. J. Food Engineering 49, 311-319)。使用空气干燥方法的一些问题是，干燥的产品并不以可容易分散的形式存在。而且，生物试剂在或高于干燥过程的温度下必须是稳定的并且精确控制是一个困难的过程。
使用冷冻-干燥技术的一个特化方法是形成液滴或球，其与低温液体接触，然后冷冻干燥。该技术的一个缺点是试剂球是脆弱的且易于崩解。
用于稳定生物试剂的载体或填充剂的一个类型是形成玻璃的填充材料(US5565318)。将生物试剂溶液掺入形成玻璃的填充材料(其为水溶性的或水溶胀性物质)中。然后将它们干燥以产生一种固定和稳定生物试剂的玻璃状组合物(US5593824)。
碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽三糖是一组重要的玻璃形成物质。可使用其它多羟基化合物如碳水化合物衍生物像山梨醇和化学改性的碳水化合物。另一种重要类别的玻璃形成物质是合成的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺。
玻璃形成物质的其它实例包括糖共聚物如FicollTM (US3300474)。Ficoll是一种易溶于水性溶液的中性的、高度支化的、高质量、亲水性多糖。Ficoll的半径范围为2-7 nm。其通过多糖与表氯醇的反应来制备。Ficoll具有在5,000-1,000,000之间的分子量并包含通过醚键连接至双官能团的蔗糖残基。这样的基团可以是2、3或更多个碳原子，但通常不超过10个碳原子的亚烷基。双官能团起着将糖残基连接在一起的作用。这些聚合物可，例如，通过糖与卤代醇或双环氧化合物的反应而制得。玻璃通常被定义为具有非常高的粘度的过冷液体。
前述参考文献的一个缺点是，通常地，稳定的和玻璃化生物材料被磨成粉，配制成片剂，或保持在容器如微量滴定板中的玻璃状薄膜中。已尝试了许多制备和使用玻璃状固定的生物材料的组合物的方法。一个系统利用玻璃状薄膜，其经干燥并分配到适用于最终用户的容器，如微量离心管中。然而，这个方法仅导致有限的成功。
因此，存在对在通过PCR扩增核酸之前从样品进行聚合酶链反应的改进的和简化的方法的需求。此外，存在对可在室温下储存、运输和重构而不需要在甘油中和较低温度下储存的PCR试剂混合物的需求。本发明致力于这些问题并提供可用以单一步骤扩增核酸的方法和试剂盒。
发明概述
本发明提供可用于通过将所有需要的PCR试剂掺入到冻干形式中以容易扩增核酸样品而扩增核酸的方法和试剂盒。
根据本发明的第一方面，提供用于核酸扩增的干燥的试剂组合物，其包含掩蔽试剂、聚合酶和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。将掩蔽剂与聚合酶和dNTP掺入干燥的试剂组合物中的优点是减少核酸扩增所需步骤的数目，因此节省操作者时间并易于操作者使用。
在一个方面，核酸选自DNA、RNA和寡核苷酸。
术语“核酸”在本文使用时与术语“核苷酸”同义并包括DNA，如质粒DNA和基因组DNA；RNA，如mRNA、tRNA、sRNA和RNAi；和蛋白核酸、PNA。
在另一方面，掩蔽剂是环糊精。环糊精可选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及其衍生物。环糊精可由下列组成：6-O-α-D-麦芽糖基-β环糊精、羟基乙基-β-环糊精、羟基丙基-β-环糊精和2-羟基丙基-β-环糊精。掩蔽剂优选地为α-环糊精。掩蔽试剂(sequesteringreagent)不是螯合剂(chelating agent)。螯合剂是与金属结合以形成螯合物的化学化合物，常常用来捕集重金属离子(Collins English Dictionary, © HarperCollinsPublishers 2003)。溶胞试剂的一个实例是十二烷基硫酸钠；钠是金属离子，然而根据Ramamurthy Palepu和Vincent C. Reinsborough (Can J. Chem Vol 66, 325-328,1988)，它是与环糊精相互作用的疏水尾部，而不是亲水头部。
在还一个方面，干燥的试剂组合物包含至少一种引物。
在还一个方面，干燥的试剂组合物另外包含赋形剂混合物。
术语“赋形剂混合物”用于本文表示用于组成制剂或混合物的添加剂或成分且例如 可包含PCR缓冲液、Ficoll 70、Ficoll 400、松三糖、海藻糖、稳定蛋白和无核酸酶水。
术语“PCR缓冲液”用于本文表示针对DNA聚合酶活性建立最适条件所必需的缓冲液且例如可包含Tris-HCl、KCl、MgCl2、明胶和无核酸酶水。
在还一个方面，干燥的试剂组合物另外包含交换缓冲液。
术语“交换缓冲液”用于本文表示用来去除小离子溶质，从而除去一种缓冲液并用另一种备选缓冲液替代的缓冲液，且例如可包含Tris/HCl、CaCl2、去垢剂、RE960、MgCl2、KCl和无核酸酶水。
在还一个方面，干燥的试剂组合物还包含牛血清白蛋白(BSA)。
在一个方面，聚合酶是OmniKlen Taq (OKT)聚合酶。作为备选，聚合酶可选自T4DNA聚合酶、Pol I和Klenow片段、T4 DNA聚合酶、修饰的噬菌体T7 DNA聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pow聚合酶、Vent聚合酶、Pab Pol I DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)、生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)、SP6和SP7 RNA聚合酶。
在还一个方面，优选的实施方案是干燥的试剂组合物，其包含α-环糊精、至少一种引物、聚合酶、dNTP、BSA、赋形剂混合物和交换缓冲液。
根据本发明的第二方面，提供一种制备用于核酸扩增的干燥试剂组合物的方法，其包括以下步骤：
i) 使聚合酶与掩蔽试剂和dNTP混合，以提供其混合物，和
ii) 干燥所述混合物以形成干燥的试剂组合物。
在一个方面，该混合物另外包含至少一种引物。
在另一方面，该混合物另外包含赋形剂混合物。
在还一个方面，该混合物另外包含交换缓冲液。
在一个方面，干燥步骤通过冻干混合物实现。
在另一方面，在干燥步骤之前，另外包括冷冻组合物的步骤。
根据本发明的第三个方面，提供一种扩增核酸的方法，其包括以下步骤：
i) 用上述干燥的试剂组合物孵育含有核酸的溶液，和
ii) 扩增核酸。
在一个方面，扩增方法是聚合酶链反应。
在另一方面，扩增方法包括逆转录聚合酶链反应或等温扩增。
在又一方面，在步骤i)之前，通过加入水至核酸中形成溶液。
在一个方面，核酸被固定在固体支持体上。
在另一方面，固体支持体是基于纤维素的基质。
在还一个方面，固体基质选自玻璃、玻璃纤维、玻璃微纤维、二氧化硅、硅胶、二氧化硅氧化物(silica oxide)、纤维素、硝基纤维素、羧基甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯(polyvinylidinefluoride)、羊毛和多孔陶瓷。固体基质可包括玻璃或二氧化硅基固相介质、塑料基固相介质或纤维素基固相介质。固体支持体优选地为纤维素基基质。纤维素基基质的实例包括可从GE Healthcare获得的FTATM (数据文件51668), 903新生儿卡片和31-ETF卡片。
在一个方面，固体支持体呈现预冲孔盘(pre punched disc)的形式。
在另一方面，固体支持体呈现FTA预冲孔盘的形式。
在还一个方面，溶胞试剂被包埋在所述固体基质上。
在一个方面，溶胞试剂包含阴离子表面活性剂或去垢剂。十二烷基硫酸钠(SDS)是频繁用来裂解生物细胞的阴离子表面活性剂的实例。
在另一方面，扩增在单一反应容器如试管或多孔板的孔中进行。
本发明的方法可在单一反应孔或者高通量96-孔形式中与如由Baron等人(2011,国际法医学：遗传学补充系列(Forensics Science International: GeneticsSupplement Series), 93, e560-e561)所述的自动样品处理组合使用。这种方法将涉及最少数目的步骤并增加样品通量。操作者引起的错误的危险如交叉污染也减少，因为与目前使用的劳动强度更大的试剂盒(如QIAmp DNA血液微型试剂盒, Qiagen)的相关方案比较，这种程序需要更少的操作。样品的混合风险也降低了，因为程序需要很少的操作。重要的是，该方法可容易地转移到用于高通量筛选的多孔形式。因此，本发明可改进用于进行PCR反应的样品处理以帮助遗传探询(genetic interrogations)。本发明可在96孔/高通量形式中进行，以促进样品处理，因此排除了样品的批处理。
聚合酶链反应试剂的干燥或冻干制剂的优点是，它们可通过加入水而容易地溶解，因此节省了操作者的时间并易于操作者使用。为了将操作者的错误降到最小，干燥的试剂混合物可被预先分配到反应容器，如多孔板的孔中。预先配制的预分发的环境温度下稳定的珠或块允许扩增反应在单一孔或反应容器中进行并确保反应之间的更大的可重复性，使移液步骤减至最少，并减少移液错误和污染的可能性。
根据本发明的第四个方面，提供使用检测系统检测和/或定量扩增的核酸的方法，其包括以下步骤：
i) 使用如前所述的方法扩增核酸，以产生扩增的核酸，
ii) 检测扩增的核酸，和
iii) 任选地定量所扩增的核酸。
在一个方面，检测系统是PCR成像系统。
在另一方面，检测系统是基于荧光或发光的系统。
应该理解，核酸在来源上可以是病毒、原核或真核的。
在一个方面，核酸样品存在于细胞样品中。细胞样品可以源自哺乳动物、鸟、鱼或植物或其细胞培养物。优选细胞样品是哺乳动物来源的，最优选源自人类。含有核酸的样品可源自任何来源。这包括，例如，人和动物的生理/病理性体液(如分泌物、排泄物、流出物)或细胞悬浮液；植物的生理/病理性液体或细胞悬浮液；细菌、真菌、质粒、病毒、朊病毒等的液体产物、提取物或悬浮液；人或动物身体组织(如，骨、肝、肾等)的液体提取物或匀浆；来自DNA或RNA合成的介质，化学或生物化学合成的DNA或RNA的混合物；和任何其它来源，其中DNA或RNA在或可在液体介质中。
在又一方面，该方法用作选自分子诊断学工具、人鉴定工具、法医工具、STR概况分析工具和DNA概况分析的工具。
根据本发明的第五方面，提供一种用于扩增核酸的试剂盒，其包含前述的干燥的试剂组合物和其使用说明书。
附图简述
图1：表示来自用含或不含α-环糊精的核酸扩增试剂块PCR扩增未洗涤的血点样的FTA纸的结果。
图2：表示来自用含α-环糊精的核酸扩增试剂块PCR扩增未洗涤的血点样的FTA纸的结果。
图3：表示得自在核酸扩增试剂块中滴定的OmniKlen Taq (OKT)聚合酶的PCR扩增的结果，显示冷冻干燥核酸扩增制剂的最佳浓度。
发明详述
所用化学物和材料
化学物及其来源的列表在下文给出：
用于储存核酸的FTA纸得自GE Healthcare UK Limited；
正常人血(Tissue Solutions Ltd)；
基因组DNA (Promega产品代码G152A)；
1kb DNA序列梯(Promega产品代码G571A)；
哈里斯单芯冲孔物(Harris Uni-core punch), 1.2mm (Sigma, 分类号Z708860-25ea, 批号3110)；
OmniKlentaq聚合酶(Mo Bio Inc, 分类代码1225-250)；
脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP) (Life Tech)；
PCR级牛血清白蛋白(Life Tech)；
正向和反向β-球蛋白引物(Sigma Genosys) (β-球蛋白1.3正向5’-TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC-3’ (Seq ID No. 1)和β-球蛋白1.3反向5’-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-3’ (Seq ID No. 2))；
α-环糊精(Fluka代码28705)和
无菌水(Sigma产品代码W4502)。
赋形剂混合物：
Ficoll 70 (GE Healthcare)；
Ficoll 400 (GE Healthcare)和
松三糖(Sigma)
循环序列混合物10X：
Trizma (Sigma)；
KCl (Sigma)；
MgCl (Sigma)和
无核酸酶水(Sigma)
交换缓冲液：
Tris/HCl pH8.5 (Sigma)；
1M CaCl2 (Sigma)；
1.0M MgCl2 (Sigma)；
2.0M KCl (Sigma)和
RHODAFAC RE-960 (7% RE960) (Kao Chemicals)
实验结果
使用qPCR，自纤维素基质测量干燥血斑点的DNA。
PCR试剂与环糊精混合并在以下表1的条件下冻干。
温度(℃) 真空(毫托) 时间(min.) 注释
-46 100 600 保持
-36 100 250 上升(ramp)
-36 100 300 保持
0 100 300 保持
28 100 233 上升
28 100 360 保持
加热后：
28 100 2000 保持
表1: 冻干条件
将样品与冻干的核酸扩增组合物在96孔板中合并。
PCR反应设置如下：
将血点样的FTA加入到含有含环糊精或不含环糊精的核酸扩增试剂块的孔中。将标准品和样品加入到适当的孔中。板以1000rpm离心1分钟并密封。按照生产商的用户说明书，在MJ Research PTC-200 Thermo Cycler上进行PCR。
热循环条件是：95℃ 5min，95℃ 30秒，55/65℃ 1min，72℃ 2min，接着35个下列循环：95℃ 30秒，55/65℃ 1min，72℃ 2min，接着72℃10min。
在扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳(1 X TEA缓冲液、1%琼脂糖凝胶)实现PCR产物的可视化。
96孔PCR板的标准孔装填有含1µl 6X上样缓冲液的5µl 1Kb DNA序列梯。
结果示于图1、2和3中。
图1显示用含或不含α-环糊精的冻干核酸扩增组合物对未洗涤的血点样的FTA的PCR扩增：泳道M: 1 kb梯；泳道1-4: 含有不含环糊精的冻干核酸扩增组合物时全血点样的FTA冲孔物(1.2mm)；泳道5-8: 含有含环糊精的冻干核酸扩增组合物全血点样的FTA冲孔物(1.2mm)。
图2显示用含或不含α-环糊精的冻干核酸扩增组合物对未洗涤的血点样的FTA的PCR扩增：泳道M: 1 kb梯；泳道1-2: 含有含环糊精的冻干核酸扩增组合物的全血点样的FTA冲孔物(1.2mm)；泳道3-4: 含有含环糊精的冻干核酸扩增组合物的FTA冲孔物(1.2mm)；泳道5-6: 含有不含环糊精的冻干核酸扩增组合物的全血点样的FTA冲孔物(1.2mm)。
图3显示用不含α-环糊精和含不同浓度的OKT Taq聚合酶的冻干核酸扩增组合物对未洗涤的血点样的FTA的PCR扩增：泳道1-8含有6U OKT，泳道1-3 用全血点样的FTA冲孔物，泳道4-6 基因组DNA，泳道7-8 无DNA模板；泳道9-16含8U OKT，泳道9-11 用全血点样的FTA冲孔物，泳道12-14 基因组DNA，泳道15-16 无DNA模板；泳道17-24含有10U OKT，泳道17-19 用全血点样的FTA冲孔物，泳道20-22 基因组DNA，泳道23-24 无DNA模板；泳道25-32含有12U OKT，泳道25-27 用全血点样的FTA冲孔物，泳道28-30 基因组DNA，泳道31-32 无DNA模板。
在1000个块中的试剂浓度
Ficoll 70 0.6933g
Ficoll 400 0.6933g
松三糖 1.083g
10x PCR循环序列混合物 2.71ml
10% α-环糊精 2.855ml
无核酸酶水 0ml
表2：在赋形剂混合物中的试剂浓度。
在1000个块中的试剂浓度
Ficoll 70 0.6933g
Ficoll 400 0.6933g
松三糖 1.083g
循环序列混合物10x 2.71ml
10% α-环糊精 0ml
无核酸酶水 2.855ml
表3：在不含环糊精的赋形剂混合物中的试剂浓度。
在1000ml中的试剂浓度
100mM Trizma 12.11g
500mm KCl 37.28g
15mM MgCl 3.05g
无核酸酶水 0.95L
表4：在1000ml 10x PCR循环序列混合物中的试剂浓度。
在1000ml中的试剂浓度
1.0M Tris/HCl pH8.5 20ml
1.0M CaCl<sub>2</sub> 100ml
7% RE960 214.3ml
1.0M MgCl<sub>2</sub> 2.5ml
2.0M KCl 16.6ml
无核酸酶水 746.5ml
表5：在交换缓冲液中的试剂浓度。
在1000个块中的试剂浓度
赋形剂混合物 6.667ml
10mg/ml BSA 0.6ml
20nM dNTP 0.25ml
OmniKlen Taq聚合酶 0.08ml
引物 0.4皮摩尔/µl
交换缓冲液 0.92ml
无核酸酶水 1.483ml
表6：在8U OmniKlen Taq聚合酶冻干核酸扩增组合物中的试剂浓度。
在1000个块中的试剂浓度
不含环糊精的赋形剂混合物 6.667ml
10mg/ml BSA 0.6ml
20nM dNTP 0.25ml
OmniKlen Taq聚合酶 0.06ml
引物 0.4皮摩尔/µl
交换缓冲液 0.94ml
无核酸酶水 1.483ml
表7：在6U OmniKlen Taq聚合酶冻干核酸扩增组合物中的试剂浓度。
在1000个块中的试剂浓度
不含环糊精的赋形剂混合物 6.667ml
10mg/ml BSA 0.6ml
20nM dNTP 0.25ml
OmniKlen Taq聚合酶 0.1ml
引物 0.4皮摩尔/µl
交换缓冲液 0.9ml
无核酸酶水 1.483ml
表8：10U OmniKlen Taq聚合酶冻干核酸扩增组合物中的试剂浓度。
在1000个块中的试剂浓度
不含环糊精的赋形剂混合物 6.667ml
10mg/ml BSA 0.6ml
20nM dNTP 0.25ml
OmniKlen Taq聚合酶 0.12ml
引物 0.4皮摩尔/µl
交换缓冲液 0.92ml
无核酸酶水 1.443ml
表9：在12U OmniKlen Taq聚合酶冻干核酸扩增组合物中的试剂浓度。
虽然描述了本发明的优选的例示性实施方案，本领域技术人员应该意识到，本发明可通过所述实施方案以外的实施方案来实施，提出所述实施方案仅仅是为了说明的目的而决不是限制。本发明仅仅由所附权利要求书限定。
<110> 通用电气医疗集团英国有限公司
<120> 直接核酸扩增试剂盒、试剂和方法
<130> PA1283
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ttaggcctta gcgggcttag ac 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 引物
<400> 2
ccaggatttt tgatgggaca cg 22

Claims (7)

1.一种扩增核酸的方法，其包括以下步骤：
i) 用冻干试剂组合物孵育含有核酸的溶液，所述组合物包含掩蔽试剂、聚合酶和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)，其中所述掩蔽试剂为环糊精，和
ii) 扩增所述核酸，
其中所述核酸被固定在固体支持体上，并且其中溶胞试剂被包埋在所述固体支持体上；
以及其中所述固体支持体是呈现预冲孔盘或FTA预冲孔盘的形式的基于纤维素的基质。
2.权利要求1的核酸扩增方法，其中a)所述扩增方法是聚合酶链反应，或b)所述扩增方法包括逆转录聚合酶链反应或等温扩增。
3.权利要求1或2的方法，其中所述扩增在单一反应容器中进行。
4.权利要求1的核酸扩增方法，其中所述扩增方法是聚合酶链反应。
5.权利要求1的核酸扩增方法，其中所述扩增方法包括逆转录聚合酶链反应或等温扩增。
6.权利要求1-5的任一项的方法，其另外包括在步骤i)之前的步骤，其中所述溶液通过加入水至核酸中形成。
7.一种使用检测系统例如PCR成像系统，检测和/或定量扩增的核酸的方法，其包括以下步骤：
i) 使用权利要求1-6的任一项的方法扩增核酸，以产生扩增的核酸，
ii) 检测所述扩增的核酸，和
iii) 任选地定量所扩增的核酸。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201219137D0 (en) 2012-10-24 2012-12-05 Ge Healthcare Uk Ltd Direct nucleic acid amplification kit, reagent and method
JP5904153B2 (ja) * 2013-03-29 2016-04-13 ソニー株式会社 核酸増幅反応用試料の調製方法、核酸増幅方法、固相状核酸増幅反応用試薬及びマイクロチップ
WO2016053638A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Method for nucleic acid analysis directly from an unpurified biological sample
JP2018506020A (ja) * 2014-12-18 2018-03-01 ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド 核酸増幅と組合せたイムノアッセイによる固体支持体上の被検体検出
US10822645B1 (en) 2014-12-23 2020-11-03 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
US10968478B2 (en) 2014-12-23 2021-04-06 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
US10858694B2 (en) 2014-12-23 2020-12-08 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods and reagents for reverse-transcription polymerase chain reaction
GB201515355D0 (en) * 2015-08-28 2015-10-14 Ge Healthcare Ltd A method and kit for analyte detection
US20180320227A1 (en) * 2015-11-18 2018-11-08 Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology Method for quantifying target nucleic acid and kit therefor
GB201602880D0 (en) 2016-02-18 2016-04-06 Ge Healthcare Uk Ltd Method and composition for biomolecule stabilization
CN106755414B (zh) * 2016-12-23 2020-09-01 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测dna遗传标记的方法
WO2018213811A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-22 Gen-Probe Incorporated Dried compositions containing flap endonuclease
CA3156539A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
EP4119664A4 (en) * 2020-03-11 2024-04-24 Kao Corp METHOD FOR THE PRODUCTION OF RNA FROM SKIN SURFACE LIPIDS
CN111593112A (zh) * 2020-05-12 2020-08-28 深圳市星蝶科技有限公司 一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂及试剂盒
EP4308724A1 (en) * 2021-03-19 2024-01-24 Becton, Dickinson and Company Isothermal amplification of pathogens
CN114317700B (zh) * 2021-12-28 2024-01-30 无锡科智达科技有限公司 荧光pcr试剂冻干保护剂、冻干方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705345A (en) * 1991-01-10 1998-01-06 Amersham International Plc Methods and kits for preparing nucleic acids using cyclodextrin
CN101516337A (zh) * 2006-09-18 2009-08-26 通用电气医疗集团生物科学公司 用玻璃覆盖的生物学试剂的制备
WO2010002938A2 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Life Technologies Corporation Method for direct amplification from crude nucleic acid samples
CN102018672A (zh) * 2010-11-29 2011-04-20 广州朗圣药业有限公司 一种水溶性药物的脂质体冻干组合物及其制备方法
CN102317472A (zh) * 2008-12-12 2012-01-11 欧洲基因技术股份有限公司 使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972386A (en) * 1995-12-19 1999-10-26 Flinders Technologies Pty, Ltd. Dry solid medium for storage and analysis of genetic material
US5593824A (en) * 1994-09-02 1997-01-14 Pharmacia Biotech, Inc. Biological reagent spheres
US5565318A (en) * 1994-09-02 1996-10-15 Pharmacia Biotech, Inc. Room temperature stable reagent semi-spheres
US7122304B2 (en) * 1997-05-12 2006-10-17 Whatman, Inc. Methods for the storage and synthesis of nucleic acids using a solid support
JP5300112B2 (ja) * 1998-02-02 2013-09-25 キアジエン・ノース・アメリカン・ホールデイングス・インコーポレーテツド Ｄｎａを単離するための溶解マトリックスを使用するための組成物および方法
US20060160078A1 (en) * 2002-07-12 2006-07-20 Cardy Donald L N Lateral flow assay device and method
US7462475B2 (en) * 2004-05-20 2008-12-09 Dna Poleymerase Technology, Inc. Use of whole blood in PCR reactions
US8900525B2 (en) * 2006-09-18 2014-12-02 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Preparation of glassified biological reagents
US8153401B2 (en) * 2007-05-17 2012-04-10 Applied Biosystems, Llc Method for direct amplification from crude nucleic acid samples
GB201219137D0 (en) 2012-10-24 2012-12-05 Ge Healthcare Uk Ltd Direct nucleic acid amplification kit, reagent and method
FR2998845B1 (fr) * 2012-12-04 2016-04-01 Autoliv Dev Generateur de gaz

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705345A (en) * 1991-01-10 1998-01-06 Amersham International Plc Methods and kits for preparing nucleic acids using cyclodextrin
CN101516337A (zh) * 2006-09-18 2009-08-26 通用电气医疗集团生物科学公司 用玻璃覆盖的生物学试剂的制备
WO2010002938A2 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Life Technologies Corporation Method for direct amplification from crude nucleic acid samples
JP2011526788A (ja) * 2008-06-30 2011-10-20 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 粗製核酸サンプルからの直接増幅のための方法
CN102317472A (zh) * 2008-12-12 2012-01-11 欧洲基因技术股份有限公司 使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率
CN102018672A (zh) * 2010-11-29 2011-04-20 广州朗圣药业有限公司 一种水溶性药物的脂质体冻干组合物及其制备方法

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