CN114317700B - 荧光pcr试剂冻干保护剂、冻干方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用，按质量百分含量计，所述冻干保护剂包括：海藻糖5‑15％，羟丙基‑β‑环糊精1‑10％，葡聚糖40 0.5‑5％，余量为水。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述荧光PCR试剂冻干保护剂不仅能够对荧光PCR试剂的冻干过程起到保护的作用，而且添加的保护剂成分简单，不影响荧光PCR的扩增反应；(2)所述冻干保护剂冻干后冻干球外观成型完整，冻干前后试剂性能变化小，冻干球稳定性好；(3)所述冻干保护剂简化了冷冻干燥程序，适应性较强，本冻干保护剂可适用于无甘油或低甘油含量的酶反应体系。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种冻干保护剂，具体为荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用。
背景技术
荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE(PerkinElmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能，其原理是：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加；每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
随着临床医学及生物诊断试剂的发展，为了满足临床需要，需要开发一种不需要低温保存及运输的荧光PCR扩增试剂。由于荧光PCR反应体系中含有活性酶、荧光探针等试剂，需要低温保存以避免其化学性质发生变化，因此需要采用冷冻干燥的方法。荧光PCR试剂冷冻干燥的主要方法步骤包括：
1、配液。将荧光PCR扩增缓冲液，引物，探针，酶等及冻干保护剂，按照配方进行混合配液，其中冻干保护剂的选择非常重要。常见的冻干保护剂包括糖、多元醇类、聚合物、表面活性剂类、氨基酸类、盐类等。一种可冻干的保护试剂通常不止含有一种保护剂，而是多种保护剂联用，然而冻干保护剂配方的摸索是一个耗时很长的过程，也是冻干成败的关键所在。
2、冻干。将上述可冻干反应试剂配制好，分装到PCR八连管或定制的PCR管中，然后放入冻干机，开始进行整个冻干过程。冷冻干燥程序通常分为三个不同的阶段：预冻阶段、一次干燥阶段和二次干燥阶段。预冻阶段一般在-50～-40℃的温度下保持2-3h，预冻完成后，保持冻干机内温度不变，开始抽真空至5-10pa保持10-20h。升华结束后，真空状态下将冻干机内部温度升至-35～-25℃并保持1-2h，然后真空状态下继续将冻干机内部温度升至-5～5℃保持1-2h。最后在真空状态下继续将冻干机内部温度升至25～35℃保持10-12h。冻干完毕后可充入氮气，再通过压塞的方式完成整个冻干操作。通过冻干方法制备的荧光PCR试剂可常温避光保存，性质稳定，运输方便，使用方便，使用时只需要添加溶解液或稀释液即可。
目前针对冻干保护剂的报道较多，如中国专利申请CN113025757A公开一种用于2019-nCov多重扩增反应试剂的冻干保护剂及其应用，所述冻干保护剂配方包括海藻糖、甘露醇、普鲁兰多糖、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂、水杨酸钠、硫酸软骨素、云芝多糖、透明质酸等十多种成分。另如中国专利申请CN112048545A公开一种冻干保护剂、PCR扩增试剂及其冻干方法和应用，所述冻干保护剂配方同样包括甘油、海藻糖、蔗糖、吐温-80、右旋糖酐-40、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸钠、抑菌剂、叔丁醇等十多种成分。以上冻干保护剂成份多样，组成复杂，且含有甘露醇、甘氨酸等，这些对后续PCR反应均有一定的抑制作用，可能会影响后续的检测。基于上述因素，开发一种成份简单，且对PCR没有明显抑制的冻干保护剂具有重要的意义。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种成分简单、对荧光PCR扩增影响较小，冻干程序适应性广的冻干保护剂，本发明提供了荧光PCR试剂冻干保护剂、冻干方法及应用。
技术方案：荧光PCR试剂冻干保护剂，按质量百分含量计，所述冻干保护剂包括：海藻糖5-15％，羟丙基-β-环糊精1-10％，葡聚糖40 0.5-5％，余量为水。
优选的，按质量百分含量计，所述冻干保护剂包括：海藻糖10％，羟丙基-β-环糊精2％，葡聚糖40 0.5％，余量为水。
以PCR扩增体系25μL为例，冻干保护剂及PCR冻干试剂的组分如下所示：
(1)冻干保护剂
(2)PCR冻干试剂
优选的，所述冻干保护剂的结构为球状，其中羟丙基-β-环糊精和葡聚糖40形成骨架结构，海藻糖嵌入骨架中。
以上任一所述荧光PCR试剂冻干保护剂的冻干方法，所述方法包括以下步骤：
(1)预冻阶段：在冻干机内将层板温度在0.5h～1h内降至-50℃～-40℃，保持1～3h；
(2)一次干燥阶段：抽真空至10～30Pa，继续保持10～20h；然后将层板温度升至-35℃～-25℃，保持1～2h；然后将层板温度升至-5℃～5℃，保持1～2h；
(3)二次干燥阶段：抽真空至5～10Pa，将层板温度上升至20℃～30℃，保持6～12h。
优选的，冻干保护剂与PCR试剂混合的比例范围为1:1.5-1:2。
以上任一所述荧光PCR试剂冻干保护剂在无甘油或低甘油含量的PCR酶反应体系中的应用。
优选的，所述低甘油含量是甘油含量范围为≤0.05％。
本发明所述荧光PCR试剂冻干保护剂的工作原理在于：本发明使用羟丙基-β-环糊精和葡聚糖40作为稳定剂，其用途是使冷冻干燥后的核酸扩增试剂外型维持一定的物理结构和强度，为冻干球提供支撑骨架，防止产品萎缩变形。海藻糖作为冻干保护剂的主要组分，其用途是减少核酸扩增试剂中酶类分子在冷冻干燥工艺中的活性损失。
有益效果：(1)本发明所述荧光PCR试剂冻干保护剂不仅能够对荧光PCR试剂的冻干过程起到保护的作用，而且添加的保护剂成分简单，不影响荧光PCR的扩增反应；(2)所述冻干保护剂冻干后冻干球外观成型完整，冻干前后试剂性能变化小，冻干球稳定性好；(3)所述冻干保护剂简化了冷冻干燥程序，适应性较强，本冻干保护剂可适用于无甘油或低甘油含量的酶反应体系。
附图说明
图1是实施例1中不同配方的冻干保护剂效果验证图，其中a为配方1，b为配方2，c为配方3；
图2是本发明所述冻干保护剂的微观图；
图3是实施例2中冻干保护剂冻干前后的性能验证图，其中a为冻干前，b为冻干后；
图4是荧光PCR法试剂冻干前后37℃条件下的稳定性验证图，其中a为37℃0天，b为37℃30天。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1冻干保护剂效果验证
冻干保护剂原料：海藻糖购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，羟丙基-β-环糊精、葡聚糖40和甘氨酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
25μL荧光PCR冻干反应体系的配制：
| 试剂 | 配方1 | 配方2 | 配方3 |
| 5×RT mix | 5 | 5 | 5 |
| dNTP mixture(10mM each) | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| FluA-F(100μM) | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| FluA-R(100μM) | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| FluA-P(100μM)-FAM | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 海藻糖 | - | 10％ | 10％ |
| 羟丙基-β-环糊精 | - | 2％ | - |
| 葡聚糖40 | - | 0.5％ | - |
| 甘氨酸 | - | - | 1％ |
| 无菌纯化水 | 补水至25μL | 补水至25μL | 补水至25μL |
将配制好的荧光PCR冻干反应体系按25μL/T分装到PCR管中，使用上海宏石荧光定量PCR进行PCR扩增反应。PCR扩增反应程序按以下方式设定：
PCR扩增反应程序
PCR扩增结束后，对冻干保护剂的性能进行评价。如图1所示：分别是三种不同配方反应体系的扩增曲线。从以上实验可以得出，配方2添加冻干保护的扩增反应体系与配方1中未添加冻干保护剂的扩增反应体系相比无明显差异，表明配方2的冻干保护剂对扩增反应体无抑制作用；而配方3添加的冻干保护剂与配方1中未添加冻干保护剂的扩增反应体系相比具有明显的抑制作用，后续实施例使用配方2的冻干保护剂进行性能验证。
实施例2
根据实施例1中配方2的冻干反应体系，将配制好的荧光PCR冻干反应体系按25μL/T分装到一种四联PCR管中，再将PCR管放入冻干机中。
冻干程序按以下方式设定：
(1)预冻：将层板温度降至-50℃，并在-50℃保持1h。
(2)一次干燥：抽真空至10Pa，保持10h；然后在保持真空度条件下将层板温度升至-30℃，保持1h；然后在保持真空度条件下将层板温度升至-5℃，保持1h。
(3)二次干燥：抽真空至5Pa，将层板温度上升至25℃，保持6h。
冻干结束后，对冻干保护剂冻干效果进行外观、冻干后扩增性能、冻干试剂加速稳定性进行评价。
(1)冻干外观：
如图2所示：冻干产物表面完整，冻干产物外观一致。
(2)荧光PCR试剂冻干前后性能比较
如图3所示：与液态PCR反应体系相比，冻干后对模板扩增性能与液态对照组无明显差异。
(3)荧光PCR试剂冻干前后37℃条件下加速稳定性
如图4所示：冻干试剂在37℃条件下放置30d，性能与第0天无明显差异。
从以上实验可以得出，荧光PCR试剂冻干保护剂不仅能够对荧光PCR试剂的冻干过程起到的保护剂和稳定剂的作用，而且添加的保护剂成分简单，结合优选的冷冻干燥程序，不影响荧光PCR的扩增反应。使用优化的冻干保护剂冻干后外观成型完整，冻干前后试剂性能变化小，冻干后产物稳定性好。海藻糖、羟丙基-β-环糊精和葡聚糖40对荧光PCR试剂冻干前后PCR性能起到关键作用。
Claims (2)
1.荧光PCR试剂冻干保护剂在无甘油的PCR酶反应体系中的应用，其特征在于，按质量百分含量计，所述冻干保护剂由以下组分组成：海藻糖5-15%，羟丙基-β-环糊精1-10%，葡聚糖40 0.5-5%，余量为水；
所述冻干保护剂的冻干方法，包括以下步骤：
（1）预冻阶段：在冻干机内将层板温度在0.5h~1h内降至-50℃~-40℃，保持1~3h；
（2）一次干燥阶段：抽真空至10~30Pa，继续保持10~20h；然后将层板温度升至-35℃~-25℃，保持1~2h；然后将层板温度升至-5℃~5℃，保持1~2h；
（3）二次干燥阶段：抽真空至5~10Pa，将层板温度上升至20℃~30℃，保持6~12h；
所述冻干保护剂的结构为球状，其中羟丙基-β-环糊精和葡聚糖40形成骨架结构，海藻糖嵌入骨架中；
冻干保护剂与PCR试剂混合的比例范围为1:1.5-1:2。
2.根据权利要求1所述的荧光PCR试剂冻干保护剂在无甘油的PCR酶反应体系中的应用，其特征在于，按质量百分含量计，所述冻干保护剂由以下组分组成：海藻糖10%，羟丙基-β-环糊精2%，葡聚糖40 0.5%，余量为水。
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