CN110747263B - 一种冻干添加剂及荧光pcr反应混合物干粉和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种冻干添加剂及荧光PCR反应混合物干粉和制备方法，具体涉及生物技术领域，冻干添加剂包括A组分和B组分，A组分由二硫苏糖醇、吐温20、海藻糖、明胶和BSA组成，B组分由叔丁醇组成。将该A组分加入到荧光PCR反应混合物原液的其他组分中存储待用，冻干前再将B组分加入获得荧光PCR反应混合物原液，最后冻干得到荧光PCR反应混合物干粉。本发明制备的荧光PCR反应混合物干粉保证扩增性能的同时，缩短冻干时间，减少冻干成本，并使冻干后的成品结实，不易碎，并且能长期保存。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冻干添加剂及荧光PCR反应混合物干粉和制备方法。
背景技术
荧光PCR方法的核酸检测体外诊断试剂，一般包括DNA聚合酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液等。这些组分聚合酶，引物需要低温保存，保持生物活性。试剂在销售运输过程中需要冷链运输，增加了试剂成本，很大程度限制了偏远、甚至小型城市医院的使用。
越来越多的人开始研究冻干的PCR产品，主要问题还是冻干时间长，冻干成本高；干粉容易散，运输过程中散开粘壁，开盖容易飞出，就算用前离心也不理想；长期保存性能下降。
冷冻干燥的基本过程有预冻，制品的冻结；第一阶段干燥，升华干燥；第二阶段干燥，解析干燥。冻结温度一般比溶液的共晶点低10-15℃为宜。升华干燥温度冻结部分温度不能超过共熔点温度和崩解温度(冷冻干燥技术与设备赵鹤皋等编著华中科技大学出版社，2005年6月)。
因此，急需一种能够解决现有问题的冻干添加剂及荧光PCR反应混合物干粉和制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种冻干添加剂及荧光PCR反应混合物干粉和制备方法，筛选一组合适的PCR添加剂制作成荧光PCR反应混合物干粉，保证扩增性能的同时，提高混合物的共晶点温度，提高冻结温度，减少冷冻时间；提高共熔点和玻璃化转化温度，可以在较高温度升华干燥，缩短升华时间，从而缩短冻干时间，减少冻干成本，并使冻干后的成品结实，不易碎，并且能长期保存。
本发明提供了如下的技术方案：
一种冻干添加剂，包括A组分和B组分，A组分由二硫苏糖醇、吐温20、海藻糖、明胶和BSA组成，B组分由叔丁醇组成。二硫苏糖醇是还原剂，跟吐温20，BSA作为PCR促进剂，在冻干过程起到保护聚合酶的作用。海藻糖既是一种PCR促进剂，可以降低高GC模板的TM值，也是冻干的赋形剂和保护剂。明胶除了是PCR的添加剂，本身具有较高的崩解温度，还提高冻干物质的结合力，起到胶体的作用。叔丁醇在PCR试剂分装好准备冻干之前按体积比加入，混合后可提高混合物共晶点15-20度，在冻干显微镜下，叔丁醇升华后形成的微通道有利于水分的析出，也加快了升华解析的速度。
优选的，A组分在冻干前后的量无变化，这里的量没有变化是指，A组分不会损失，在扩增体系中的浓度如下：
A组分在冻干前后的量无变化，在扩增体系中的浓度如下：
二硫苏糖醇的浓度为0.2-1mM(指0.2mM-1mM,以下类同)，吐温20的浓度为0.2％-1％
(v/v)，海藻糖的浓度为0.2M以下，明胶的质量体积比为0.1％-1％(w/v)，BSA的浓度为0.2-1mg/ml；
B组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的浓度为：叔丁醇的浓度为10％-40％
(v/v)。
优选的，A组分在扩增体系中的浓度如下：
二硫苏糖醇的浓度为1mM，吐温20的浓度为0.2％(v/v)，海藻糖的浓度为0.2M，明胶的质量体积比为1％(w/v)，BSA的浓度为1mg/ml；
B组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的浓度为：叔丁醇的浓度为40％(v/v)。
优选的，B组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的浓度为：叔丁醇的浓度为10％-20％(v/v)。
优选的，在扩增体系中，海藻糖的浓度为0.05-0.2M。
优选的，A组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的各物质的浓度与冻干后使用水溶解后的各物质的浓度相同。
一种荧光PCR反应混合物干粉，由荧光PCR反应混合物原液冻干而成，所述荧光PCR反应混合物原液包含冻干添加剂、PCR缓冲液、dNTPs、无甘油taq酶以及引物混合物，所述PCR缓冲液在扩增反应体系中的浓度为：100mM氯化钾、2.5mM氯化镁和20mM Tris-HCl缓冲液Ph8.3。
一种荧光PCR反应混合物干粉的制备方法，包括如下步骤：
S1、按照配方，将除了叔丁醇的原料外混合均匀并分装，将分装好的溶液加入叔丁醇得到荧光PCR反应混合物原液；
S2、将S1中分装好的荧光PCR反应混合物原液放入冻干机冻干。
优选的，冻干程序为：预冻，-15℃，1.5小时；升华，-4℃0.5小时；解析干燥10℃，0.5小时，25℃，0.5小时。
本发明的有益效果是：
本发明的荧光PCR反应混合物含有冻干添加剂，不仅扩增性能好，又节省冻干时间，显著的优点在于：
1、提高了共晶点，预冻温度从常见的-40℃～-30℃提高到-15℃；
2、冻干时间仅需3小时；
3、冻干的成品在试剂管中形态完整，晃动不易碎；
4冻干组分复溶良好，并且有良好的稳定性。
具体实施方式
实施例一
添加剂组分筛选
添加剂(赋形剂、保护剂)需要对PCR扩增无抑制，为测试各种添加剂添加量对PCR的影响，在反应体系中添加不同浓度，测试对扩增的影响。
1、各添加剂母液配制
二硫苏糖醇(DTT)配制成10mmol/L,明胶配制成10％(w/v),海藻糖配制成2mol/L,牛血清白蛋白(BSA)配制成10mg/ml，均是以水溶解；吐温20(tween-20)和叔丁醇以水稀释成10％(v/v)。DTT、明胶、海藻糖、BSA和tween-20购自上海生工，叔丁醇购自上海阿拉丁试剂。
2、各添加剂按0.2μl,0.4μl,1μl,2μl,4μl,6μl,8μl等七种加量，各自单独加入以下扩增体系中，并与不加添加剂的做对比：
表1扩增体系
无甘油Taq酶(5U/μl)购自美国罗氏，模板为奈瑟氏淋球菌样本，加入2μl模板(1000
拷贝)，20X引物混合物序列及浓度如下表：
表2 20X引物混合物序列及浓度
| FW | CACGGCGATTGCCAGTTT | 4μM |
| RW | GAAGTTGCCCTGTCCGTCT | 4μM |
| Probe | FAM-CAACACCATCGTCCGTATGGCGCAA-BHQ1 | 2μM |
3、检测奈瑟氏淋球菌gyrA基因
使用博日9600荧光定量PCR仪器扩增检测，PCR扩增程序如下：
扩增程序为预变性95℃3分钟；95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。
单组分添加试验结果表明：二硫苏糖醇(DTT)浓度在0.2-1mM浓度内对扩增有促进，BSA浓度在0.2-1mg/ml对扩增有促进，再多产物出现沉淀；明胶0.1％-1％(w/v)对扩增均有促进；Tween-20浓度在0.2％-1％(v/v)对扩增有促进，再多抑制；海藻糖浓度0.2M以下对扩增有促进。叔丁醇0.2％(v/v)以下浓度对扩增无影响，浓度在0.5％((v/v)时对扩增有抑制。进一步的交叉试验，不同组分扩增互相之间无干扰。
实施例二
共晶点检测
1、DTT配制成1mol/L,明胶配制成10％(w/v),海藻糖配制成2mol/L,BSA配制成100mg/ml，均是以水溶解。
2、配制扩增试剂，用于共晶点检测，检测机器为LGJ-20F压盖型冻干机(北京松源华兴)。配制好的试剂装入西林瓶中，启动机器共晶点检测程序进行检测。加样比例如下表：
表3扩增体系
添加剂在体系中的浓度及对应检测的共晶点如下表：
表4添加剂在体系中的浓度及对应检测的共晶点
五个添加剂中，从添加剂组1和添加剂组7的对比中可看出，二者仅仅是吐温20的含量不同，所以从这里得知吐温20使共晶点降低，且影响明显；从添加剂组2和添加剂组6的对比中可看出，二者仅仅是海藻糖的浓度不同，从这里可得知海藻糖会使共晶点降低。
3、叔丁醇加入扩增体系中，扩增时会抑制反应(实施例1中)。叔丁醇加入扩增体系中，随着冻干过程，叔丁醇会升华出去(加16.5μl水复溶，以气相色谱法检测叔丁醇含量，溶液中叔丁醇含量低于0.01％)。加入叔丁醇之后，共晶点有明显提高。各组分别加入体积比为10％，20％，40％，60％的叔丁醇，检测共晶点，结果如下；
表5加入叔丁醇后的共晶点检测结果
实施例3
不同组分冻干时间及扩增效率的比较
按实施例2中，表4所示：添加剂组分1-7的组合及浓度，加入到扩增体系中，其他组分如下：
表6扩增体系
放入LGJ-20F压盖型冻干机冻干，冻干程序为，预冻，-30℃，2小时；升华，-15℃3小时；解析干燥10℃，3小时，25℃，0.5小时。冻干的成品均为均一白色的，晃动不散。
冻干后的各组产品，放入56℃烘箱做加速试验，分别加速1天，3天，5天，7天，8天，9天，10天，同时放入4℃冰箱作为0天的对照。
往冻干后单人份试剂加去离子纯化水16.5μl，加入2μl模板(含1000拷贝奈瑟氏淋球菌DNA)，按实施例1的程序进行扩增检测。
检测结果表明，各组的扩增效率，在第0天没有差别。第2，3，4，5组到第6天扩增信号变低，ct值变大(2-3个循环)。第1，6，7组至加速10天，扩增信号差异小,ct值变化小于1％。确定添加剂组1，6，7为优选。
如实施例2中的表5所示，向添加剂组1-7加入不同浓度叔丁醇之后，如上述步骤冻干。加入叔丁醇后，因叔丁醇冻干升华后，留下细小孔道，有利于水分升华，也导致成品更松散。各组叔丁醇加量60％的成品松散，成粉末状，容易粘壁；组1、组4和组7，叔丁醇加量10％-40％，冻干成品晃动不散；组2、组3、组4、组5和组6，叔丁醇加量10％,20％冻干成品晃动不散。可见加入明胶有利于干粉成型，不易松散。
56℃分别加速1至10天(与没有加叔丁醇的时间对应，即分别加速1天，3天，5天，7天，8天，9天，10天)，扩增效率检测结果与不加叔丁醇的结果没有差异。说明冻干之后叔丁醇几无残留，对扩增无影响。加入16.5μl水复溶之后，以色谱法检测叔丁醇含量低于0.01％。进一步测试发现，加入叔丁醇之后，升华干燥的时间与解析干燥的时间缩短，分别由原来的3小时，缩短至2小时，1小时，0.5小时测试(即分别做预冻，-15℃，1.5小时；升华,-4℃,3小时；解析干燥10℃,3小时，25℃，0.5小时；预冻，-15℃，1.5小时；升华,-4℃,2小时；解析干燥10℃,2小时，25℃，0.5小时；预冻，-15℃，1.5小时；升华,-4℃,1小时；解析干燥10℃,1小时，25℃，0.5小时；预冻，-15℃，1.5小时；升华,-4℃,0.5小时；解析干燥10℃,0.5小时，25℃，0.5小时。)，发现升华干燥与解析干燥时间缩短至0.5小时，均可以冻干。
考虑提高共晶点及成品不松散粘壁，最后优选的添加剂组合为添加剂组7，在冻干时添加40％的叔丁醇。该组添加剂，进一步优化后的冻干程序为：预冻，-15℃，1.5小时；升华，-4℃0.5小时；解析干燥10℃，0.5小时，25℃，0.5小时。
以上实施例1-实施例3中的扩增体系中是使用的5X Reaction mix、20X引物混合物、无甘油Taq酶和PCR模板均相同。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种荧光PCR反应混合物干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将冻干添加剂A组分、PCR缓冲液、dNTPs、无甘油taq酶以及引物混合物混合均匀并分装，向分装好的溶液中加入冻干添加剂B组分叔丁醇，得到荧光PCR反应混合物原液；所述冻干添加剂A组分由二硫苏糖醇、吐温20、海藻糖、明胶和BSA组成；
所述冻干添加剂A组分在冻干前后的量无变化，在扩增体系中的浓度如下：
二硫苏糖醇的浓度为0.2-1mM，吐温20的浓度为0.2%-1% v/v，海藻糖的浓度为0.05-0.2M，明胶的质量体积比为0.1%-1%，BSA的浓度为0.2-1mg/ml；
所述冻干添加剂B组分叔丁醇浓度为10%-40% v/v；
所述PCR缓冲液在扩增反应体系中的浓度为：100mM氯化钾、2.5mM氯化镁和20mM Tris-HCl缓冲液 Ph8.3；
S2、将步骤S1中分装好的荧光PCR反应混合物原液放入冻干机冻干，冻干程序为：预冻，-15℃，1.5小时；升华，-4℃ 0.5小时；解析干燥10℃，0.5小时，25℃，0.5小时。
2.根据权利要求1所述的荧光PCR反应混合物干粉的制备方法，其特征在于，
A组分在扩增体系中的浓度如下：
二硫苏糖醇的浓度为1mM，吐温20的浓度为0.2% v/v，海藻糖的浓度为0.2M，明胶的质量体积比为1% w/v，BSA的浓度为1mg/ml；
B组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的浓度为：叔丁醇的浓度为40% v/v。
3. 根据权利要求1所述的荧光PCR反应混合物干粉的制备方法，其特征在于，B组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的浓度为：叔丁醇的浓度为10%-20% v/v。
4.根据权利要求1所述的荧光PCR反应混合物干粉的制备方法，其特征在于，
A组分在冻干前的荧光PCR反应混合物原液中的各物质的浓度与冻干后使用水溶解后的各物质的浓度相同。
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