CN114231605B - 一种用于核酸扩增的冻干组合物 - Google Patents

一种用于核酸扩增的冻干组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种冻干组合物，属于生物技术领域，具体涉及一种用于核酸扩增的冻干组合物。本发明的冻干组合物冻干形态良好，能够保持冻干前后的反应性能无明显变化，且可以实现冻干品的常温运输和储存，避免常规试剂反复冻融对试剂性能所造成的不良影响。

Description

一种用于核酸扩增的冻干组合物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于核酸扩增的冻干组合物。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是美国科学家KaryB.Mullis1985年发明的一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝，基于其快速、灵敏和特异性等优点，自1989年开始用于医学检测和临床检验，目前仍是医学和诊断学常用的手段之一。
虽然PCR技术应用广泛，但是PCR反应相关试剂对储存温度的要求极高，一旦储存或运输过程中温度过高，相关试剂尤其是酶等蛋白类原料容易失活，从而导致试剂功能损失；而PCR试剂的冷链运输会极大地增加成本消耗。
真空冷冻干燥技术简称冻干，该技术始于19世纪，1935年问世了第一台商用冻干机。随着高新技术的涌现，冻干技术的研究和生产发展迅速，广泛用于医药、食品等领域，该技术操作原理是将湿物料或溶液在较低的温度(-10℃～-50℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3～13Pa)下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。
可通过真空冷冻干燥技术将PCR反应试剂冻干以实现常温运输储存的目的，但是用于PCR反应的聚合酶及其它蛋白组分在冷冻干燥过程中由于体系中水分的分布改变及含量减少都有可能造成这些酶及其它蛋白质类分子发生一定程度的变性，因此可通过添加冻干保护剂的方式来减少酶及其它蛋白质类物质在冷冻干燥过程中受到的损害；此外，单纯的扩增体系冻干后表面疏松多孔不利于转移，可以在配方中加入相关赋形剂来赋予产品一定的结构形态。
在对生物制品进行冻干的过程中需要用到各种冻干辅料，糖类是最常用的辅料之一，可作为蛋白质的非特异性稳定剂，二糖类物质如海藻糖和蔗糖有非常普遍的应用，其中蔗糖化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变以及冻干和储藏过程中蛋白质的伸展和聚集起显著作用；同时蔗糖有较高的Tg值(玻璃转化温度)，可有效的维持蛋白分子的结构。除了糖类，多元醇，蛋白类和氨基酸类物质也是冻干中常用的保护剂。
目前真空冷冻干燥技术极大增加了PCR试剂常温储藏运输的可能性，但是在冻干品制备过程中耗时长，且冻干品的储存稳定性、反应性能及冻干产物的形态都因冻干保护剂及赋形剂的不同而有巨大差异，因此寻找合适的PCR试剂冻干体系仍面临诸多挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻干组合物，能够保护经过真空冷冻干燥技术制备得到的PCR试剂冻干品，使得冻干品实现常温运输和储存，增加产品运输效率的同时减少对成本的消耗，为现场核酸快速检测的实现增加了可行性，同时制备的冻干品即溶即反应，可以避免常规试剂反复冻融对试剂性能所造成的不良影响。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供一种冻干组合物，其由包含蔗糖、脯氨酸、甘露醇和聚合酶的溶液经过真空冷冻干燥制备获得。
在一些实施方案中，所述蔗糖浓度范围是0.1-0.8M，优选地，所述蔗糖浓度为0.3M，更优选地，蔗糖浓度为0.5M，再优选地，蔗糖浓度为0.8M。
在一些实施方案中，所述脯氨酸浓度范围是0.05-0.2M，优选地，所述脯氨酸浓度为0.05M，更优选地，脯氨酸浓度为0.1M，再优选地，脯氨酸浓度为0.2M。
在一些实施方案中，所述甘露醇浓度范围是0.02-0.1M，优选地，所述甘露醇浓度为0.05M，更优选地，甘露醇浓度为0.1M。
在一些实施方案中，所述聚合酶浓度范围是0.1U/μl-0.4U/μl，优选地，所述聚合酶浓度范围是0.1U/μl-0.3U/μl，更优选地，聚合酶浓度范围是0.1U/μl-0.2U/μl。
在一些实施方案中，所述溶液中蔗糖浓度为0.5M，脯氨酸浓度为0.1M，甘露醇浓度为0.1M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
在一些实施方案中，所述溶液中蔗糖浓度为0.8M，脯氨酸浓度为0.2M，甘露醇浓度为0.1M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
在一些实施方案中，所述溶液中蔗糖浓度为0.5M，脯氨酸浓度为0.1M，甘露醇浓度为0.05M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
在一些实施方案中，所述溶液中蔗糖浓度为0.5M，脯氨酸浓度为0.05M，甘露醇浓度为0.05M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
本发明第二方面提供一种冻干组合物，其由包含蔗糖、甘露醇和聚合酶的溶液经过真空冷冻干燥制备获得。
在一些实施方案中，所述蔗糖浓度范围是0.1-0.8M，优选地，所述蔗糖浓度为0.3M，更优选地，蔗糖浓度为0.5M，再优选地，蔗糖浓度为0.8M。
在一些实施方案中，所述甘露醇浓度范围是0.02-0.1M，优选地，所述甘露醇浓度为0.05M，更优选地，甘露醇浓度为0.1M。
在一些实施方案中，所述聚合酶浓度范围是0.1U/μl-0.4U/μl，优选地，所述聚合酶浓度范围是0.1U/μl-0.3U/μl，更优选地，聚合酶浓度范围是0.1U/μl-0.2U/μl。
在一些实施方案中，所述蔗糖浓度为0.5M，甘露醇浓度为0.05M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
在一些实施方案中，所述溶液中还包含核苷酸、镁离子、钾离子和Tris-HCL中的一种或多种成分，优选地，所述镁离子来源于MgCl2或MgSO4中的一种或多种，优选地，所述钾离子来源于KCl。
在一些实施方案中，所述溶液中包含Tris-HCl、KCl、核苷酸、MgCl2和聚合酶，优选地，所述聚合酶为DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所述溶液中包含100mM Tris、100mM KCl、3mM MgCl2、0.4mMdNTPs和DNA聚合酶，优选地，DNA聚合酶其序列如SEQ ID NO.1所示，更优选地，所述DNA聚合酶为抗体修饰的DNA聚合酶。
在一些实施方案中，所述冻干组合物可在常温下储存至少6个月，在一些实施方案中，所述的常温条件为20-25℃，优选25℃。
在一些实施方案中，所述真空冷冻干燥技术包含预冷冻程序、冷凝器制冷程序、一次干燥程序和解析干燥程序中的一种或多种。
本发明的第三方面提供一种制备PCR扩增用冻干组合物的方法，所述方法包含对上述任一方面所述的溶液进行真空冷冻干燥步骤。
附图说明
图1A-F依次为实施例1中由方案1-方案6获得的冻干品形态对比图；
图2A-F依次为实施例1中由方案1-方案6获得的冻干品在冻干前后扩增性能比较结果；
图3A-F依次为实施例2中由方案7-方案12获得的冻干品形态对比图；
图4A-F依次为实施例2中由方案7-方案12获得的冻干品在冻干前后扩增性能比较结果；
图5A-F依次为实施例2中由方案7-方案12获得的冻干品分别在常温和-20℃条件下储存6个月后的扩增性能比较结果。
具体实施方式
以下所述为结合具体实施方式对本发明所涉及的技术进行具体描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅限于本领域相关技术人员理解本发明，而不是对本发明的限制；同时本发明中用到的试剂及仪器，如无特殊说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
实验材料
蔗糖购自Sigma公司，货号V90016；
脯氨酸购自Sigma公司，货号P5607；
甘露醇购自Sigma公司，货号M4125；
无甘油抗体是以Taq DNA聚合酶作为抗原免疫BALA/c小鼠获得的抗体，其中抗体保存液中不含有甘油；
无甘油抗体酶是Taq DNA聚合酶(序列如SEQ ID NO.1所示)按照活性单位1:1与无甘油抗体进行孵育得到，其中保存液中不含有甘油；
2×PCR Mix：100mM Tris(pH8.5@25℃)，100mM KCl，3mM MgCl2，0.4mM dNTPs，0.2U/μl无甘油抗体酶；
实施例1
1、配制冻干保护液
按照表1配制6种不同冻干保护液方案，根据表1中所述对各个组分进行称量配制，最终用ddH2O定容至100mL，得到5×浓度的冻干保护液。
表1不同冻干保护液方案
Figure BDA0003435092280000041
Figure BDA0003435092280000051
2、配制冻干体系
根据上述6种冻干保护液方案，按照表2配制6种冻干体系。
表2冻干体系
加入组分 加入体积
5×冻干保护液 10μL
2×PCRMix 25μL
ddH<sub>2</sub>O 15μL
总体积 50μL
3、获得冻干品
按照表2配制的6种冻干体系，混匀之后按照表3进行冷冻干燥操作，获得6种冻干品。
表3冷冻干燥程序
Figure BDA0003435092280000052
4、评价冻干品
对方案1-6获得的冻干品进行形态和性能评价，具体的评价指标如下所述：
(1)冻干品的形态：形态是否完整且不易破碎；
(2)冻干品的扩增性能：冻干品试剂在冻干前后试剂扩增性能是否不变。
图1的结果可以看出，添加冻干保护液配方后试剂可以冻干成固体形态，但其中方案1、方案2、方案3和方案5获得的冻干品形态不完整，方案4和方案6得到的冻干品，形态完整且表面光滑。
使用方案1-方案6获得的冻干品，对人NC_000008.11基因进行扩增性能测试，从图2的结果可以看出，方案1-方案5得到的冻干品在冻干后扩增性能相比于冻干前扩增性能都有较大程度的降低；而方案6得到的冻干品冻干前后扩增性能无明显差异。
实施例2
根据实施例1结果，对冻干保护液成分进一步优化调整，使得冻干保护液能有效地保护冻干品的形态和性能。
1、配制冻干保护液
按照表4配制优化后的冻干保护液，对各个组分进行称量配制，最终用ddH2O定容至100mL，得到5×浓度的冻干保护液。
表4优化的冻干保护液方案
Figure BDA0003435092280000061
2、配制冻干体系
根据方案7-方案12获得的冻干保护液，按照表2配制6种冻干体系。
3、获得冻干品
按照表2配制的6种冻干体系，混匀之后按照表3进行冷冻干燥操作，获得6种冻干品。
4、评价冻干品
对获得的冻干品进行形态和性能评价，具体的评价指标如下所述：
(1)冻干品的形态：形态是否完整且不易破碎；
(2)冻干品的扩增性能：冻干品试剂在冻干前后试剂扩增性能是否不变；
(3)冻干品的稳定性：室温储存6个月后扩增性能是否不变。
图3的结果可以看出，由方案7-方案12冻干保护液获得的冻干品，同样可以冻干成固体形态，其中方案7和方案8获得的冻干品形态不完整相对较差，而方案9、方案10、方案11和方案12获得的冻干品表面光滑且形态完整。
使用由方案7-方案12得到的冻干品，对人NC_000008.11基因进行扩增性能测试，从图4的结果可以看出，方案7-方案9的冻干品在冻干后扩增性能相比于冻干前扩增性能都有不同程度的降低，而由方案10、方案11和方案12得到的冻干品冻干前后扩增性能均无明显差异。
将由方案7-方案12获得的冻干品，分别放置于-20℃和常温(25℃)6个月进行储存，6个月后通过对人NC_000008.11基因扩增性能的检测，评价常温储存的冻干品的稳定性，图5的结果可以看出，由方案7-方案10获得的冻干品常温储存相较于-20℃储存，其扩增性能均有所下降，而由方案11和12获得的冻干品常温储存与-20℃条件下储存扩增性能无明显差异。
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司
<120> 一种用于核酸扩增的冻干组合物
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Glu Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ser Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Arg Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys His Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Arg Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Arg Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Glu Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Glu Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Asn Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830

Claims (12)

1.一种冻干组合物，其由包含蔗糖、脯氨酸、甘露醇和聚合酶的溶液经过真空冷冻干燥制备获得，所述溶液中蔗糖浓度范围是0.5-0.8M；所述脯氨酸浓度范围是0.05-0.2M；所述甘露醇浓度范围是0.05-0.1M；所述聚合酶的浓度范围为0.1-0.4 U/μL。
2.如权利要求1所述的冻干组合物，所述溶液中蔗糖浓度为0.5M，脯氨酸浓度为0.1M，甘露醇浓度为0.1M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
3.如权利要求1所述的冻干组合物，所述溶液中蔗糖浓度为0.8M，脯氨酸浓度为0.2M，甘露醇浓度为0.1M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
4.如权利要求1所述的冻干组合物，所述溶液中蔗糖浓度为0.5M，脯氨酸浓度为0.1M，甘露醇浓度为0.05M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
5.如权利要求1所述的冻干组合物，所述溶液中蔗糖浓度为0.5M，脯氨酸浓度为0.05M，甘露醇浓度为0.05M，所述聚合酶的浓度为0.1U/μL。
6.如权利要求2或3任一项所述的冻干组合物，其可在常温下储存至少6个月。
7.如权利要求1-5任一项所述的冻干组合物，所述溶液中还包含核苷酸、镁离子、钾离子和Tris-HCL中的一种或多种成分。
8.如权利要求7所述的冻干组合物，所述溶液中包含Tris-HCl、KCl、核苷酸、MgCl2和聚合酶。
9.如权利要求7所述的冻干组合物，所述溶液中包含100mM Tris、100mM KCl、3mMMgCl2、0.4mM dNTPs和DNA聚合酶；所述DNA聚合酶的序列如SEQ ID NO. 1所示。
10.如权利要求9所述的冻干组合物，所述DNA聚合酶为抗体修饰的DNA聚合酶。
11.如权利要求1-5、8-10任一项所述的冻干组合物，所述真空冷冻干燥技术包含预冷冻程序、冷凝器制冷程序、一次干燥程序和解析干燥程序中的一种或多种。
12.一种制备PCR扩增用冻干组合物的方法，所述方法包含对如权利要求1-5、8-10任一项所述的溶液进行真空冷冻干燥。
CN202111610054.6A 2021-12-27 2021-12-27 一种用于核酸扩增的冻干组合物 Active CN114231605B (zh)

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