CN111893169A - 一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本本申请属于核酸纯化技术领域，具体为一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。本申请适用于任何一种荧光PCR扩增试剂的预处理；且本申请减少操作步骤、提高试剂稳定性，保证临床荧光PCR检测结果的可靠性，实现常温保存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本。

Description

一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法
技术领域
本申请属于核酸纯化技术领域，具体为一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法。
背景技术
核酸扩增技术是分子生物学领域常用的技术，聚合酶链反应(polymerase chainreaction， PCR)是使用最为广泛的核酸扩增技术，可以扩增和分离目的基因，以其灵敏性、特异性和快速性得到广泛应用。然而，PCR技术需要反复的热变性，无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。自20世纪90年代初，很多实验室尝试发展无须热变性的核酸恒温扩增技术，现已开发出了如依赖核酸序列的扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、环介导恒温扩增、解链酶扩增等多种恒温扩增技术。
一般的核酸检测过程主要包括核酸提取、核酸扩增以及产物分析三个部分。在实验室研究中，核酸提取试剂和核酸扩增试剂各组分往往独立保存，使用前按照相应的需求配置混合即可，核酸扩增反应的必要条件包括：反应缓冲系统、引物、探针、各种酶类、dNTP等等。引物、探针、dNTP是一些通过化学方法合成的试剂，常温保存会破坏起基本结构从而影响后续的使用效果，一般是在-20℃下保存；核酸扩增反应还需要各种各样的酶来促进反应的特异性发生，而酶类作为一种活性蛋白，必须低温保存才能有活性，保存不善，将会直接影响扩增准确性，酶在干燥的情况比潮湿情况下对温度的耐受力要高，所以制成干粉的酶制剂更易于保存。
核酸检测试剂应用场景较多，普遍需要进行低温运输与低温保存，运输保存成本高，多场景应用难度大。反应缓冲液一般无需低温保存，引物、探针、dNTP需要低温保存，酶类需要单独低温保存，而且使用需要反复冻融和配制，极其不方便，也易造成交叉污染。这些极大地增加了核酸检测应用成本和操作成本。
因此，为了满足临床需求，亟需发明一种使用方便、且不需要低温运输及保存的荧光PCR 扩增试剂。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种用于核酸扩增的冻干粉试剂及其制备方法和使用方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。
优选的，包括下述体积份数的原料：4-6份荧光PCR扩增缓冲液、1-3份引物、0.2-1份探针、0.2-1份热启动Taq酶、0.1-0.3份UNG酶、2-10份dNTP9和35-38份冻干保护剂。
优选的，包括下述体积份数的原料：5份荧光PCR扩增缓冲液、2份引物、0.5份探针、0.5份热启动Taq酶、0.2份UNG酶、5份dNTP9和36.8份冻干保护剂；所述印务包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的体积比为1:1。
优选的，所述冻干保护剂包括下述原料：甘油，蔗糖，DTT，牛血清白蛋白，Proclin300，甲酰胺和ddH20。
优选的，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：0.5-2份甘油，5-8份蔗糖，0.05-0.2 份DTT，1-3份牛血清白蛋白，0.3-0.9份Proclin 300，0.1-0.3份甲酰胺和25-28份ddH20。
优选的，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：1份甘油，6.7份蔗糖，0.1份DTT， 2份牛血清白蛋白，0.6份Proclin 300，0.2份甲酰胺和26.2份ddH20。
优选的，所述荧光PCR扩增缓冲液的浓度为10x，上游引物的浓度为50μmol/L，下游引物的浓度为50μmol/L，探针的浓度为50μmol/L，热启动Taq酶的浓度为5U/μL，UNG 酶的浓度为1U/μL、dNTP9的浓度为100mmol/L。
一种用于核酸扩增的试剂的冻干粉冻干方法，(1)将荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂于23℃下混合均匀，并平均分装到八联管中；(2)预冻：将八联管置于冻干机中，冻干机降温至-40℃，降温时间70min，后保温3h；(3) 升华干燥：将冻干机内压力至升0.16mbar、温度至降-45℃，此过程用时40min；后将冻干机内温度由-45℃升至55℃并保温6h，此过程用时1h；(4)将冻干机内压力降至0.10mbar，此过程用时1h；(5)将冻干机内温度由55℃降升至30℃并保温6h，此过程用时1h；(6)取出八连管，封盖待用，常温避光保存。
优选的，步骤如下：将冻干粉试剂、Tween20、蔗糖、Tris-HCl、NaCl和ddH20混合均匀得冻干粉溶解液，冻干粉溶解液即可直接使用。
优选的，所述冻干粉溶解液中Tween20的浓度为0.5％，蔗糖的浓度为3％、Tris-HCl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为20mmol/L。
有益效果：本申请适用于任何一种荧光PCR扩增试剂的预处理；且本申请减少操作步骤、提高试剂稳定性，保证临床荧光PCR检测结果的可靠性，实现常温保存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本。
Proclin 300与DTT共同作用，能够保证酶的稳定性，且不影响Taq酶的活性；甘油、牛血清白蛋白二者结合能够保证酶在冻干后高盐条件下的活性；蔗糖和甲酰胺共同作用，在保持酶活性的同时能够避免引物二聚体的产生；；Tween20和蔗糖协同，可使干粉完全溶解并且在溶解过程中保持酶的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请冻干粉试剂结果图；
图2为液体试剂结果图；
图3为样本1第0天扩增曲线图；
图4为样本1第7天扩增曲线图；
图5为样本1第14天扩增曲线图；
图6为样本2第0天扩增曲线图；
图7为样本2第7天扩增曲线图；
图8为样本2第14天扩增曲线图；
图9为样本3第0天扩增曲线图；
图10为样本3第7天扩增曲线图；
图11为样本3第14天扩增曲线图；
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。
实施例2
在实施例1的基础上包括下述体积份数的原料：：4-6份荧光PCR扩增缓冲液、1-3份引物、0.2-1份探针、0.2-1份热启动Taq酶、0.1-0.3份UNG酶、2-10份dNTP9和35-38份冻干保护剂。
实施例3
在实施例2的基础上，包括下述体积份数的原料：5份荧光PCR扩增缓冲液、2份引物、0.5份探针、0.5份热启动Taq酶、0.2份UNG酶、5份dNTP9和36.8份冻干保护剂；
所述印务包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的体积比为1:1。
实施例4
在实施例3的基础上，所述冻干保护剂包括下述原料：甘油，蔗糖，DTT，牛血清白蛋白，Proclin 300，甲酰胺和ddH20。
实施例5
在实施例4的基础上，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：0.5-2份甘油，5-8份蔗糖，0.05-0.2份DTT，1-3份牛血清白蛋白，0.3-0.9份Proclin 300，0.1-0.3份甲酰胺和25-28 份ddH20。
实施例6
在实施例5的基础上，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：1份甘油，6.7份蔗糖， 0.1份DTT，2份牛血清白蛋白，0.6份Proclin 300，0.2份甲酰胺和26.2份ddH20。
实施例7
在实施例6的基础上，所述荧光PCR扩增缓冲液的浓度为10x，上游引物的浓度为50μ mol/L，下游引物的浓度为50μmol/L，探针的浓度为50μmol/L，热启动Taq酶的浓度为5U/μL，UNG酶的浓度为1U/μL、dNTP9的浓度为100mmol/L。
实施例8
在实施例7的基础上，一种用于核酸扩增的试剂的冻干粉冻干方法，(1)将荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂于23℃下混合均匀，并平均分装到八联管中；(2)预冻：将八联管置于冷冻机中，冷冻机降温至-40℃，降温时间70min，后保温3h；(3)升华干燥：将冷冻机内压力至升0.16mbar、温度至降-45℃，此过程用时40min；后将冷冻机内温度由-45℃升至55℃并保温6h，此过程用时1h；(4)将冷冻机内压力降至0.10mbar，此过程用时1h；(5)将冷冻机内温度由55℃降升至30℃并保温6h，此过程用时1h；(6)取出八连管，封盖待用，常温避光保存。
实施例9
在实施例8的基础上，步骤如下：将冻干粉试剂、Tween20、蔗糖、Tris-HCl、NaCl和ddH20混合均匀得冻干粉溶解液，冻干粉溶解液即可直接使用。
实施例10
在实施例9的基础上，所述冻干粉溶解液中Tween20的浓度为0.5％，蔗糖的浓度为3％、 Tris-HCl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为20mmol/L。
实施例1：甲型流感病毒检测试剂(荧光PCR)的制备及冻干
(1)引物探针设计
按照引物探针设计原则，设计甲型流感核酸检测引物探针。
引物名称 引物序列(5′-3′)
上游引物 CGCCRATCCTGTCAACCTCTGAA
下游引物 GCCCATTYTGGACAAAKCGTCTAAG
探针 FAM-TCCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ2
(2)按照如下配方配制甲型流感荧光PCR试剂
试剂 用量(μl) 终浓度
PCR缓冲液(10x) 200 1x
上游引物(50μmol/L) 40 0.2μM
下游引物(50μmol/L) 40 0.2μM
探针(50μmol/L) 20 0.1μM
dNTPs(100mmol/L) 200 200μM
Taq酶(5U/μL) 20 2.5U/50μl
UNG酶(1U/μL) 8 2.5U/50μl
甘油 40 5％
蔗糖 268 200mmol/L
DDT 4 5mmol/L
牛血清白蛋白 80 1％
Proclin300 24 0.3％
甲酰胺 8 1％
ddH<sub>2</sub>0 1048
总体积 2000
(3)将步骤(2)所述试剂混匀后，按照50μL/孔分装至八联管中。
(4)将分装好的八连管放入冻干机中，试剂冷冻干燥及保存操作流程如下(冻干机置于除湿间内，温度恒定为23℃，湿度恒定为10％)。
Figure BDA0002629236700000071
冻干完成后，盖上八连管盖，遮光保存。
(5)采用3例临床样本以及1例阳性对照对冻干试剂进行验证，同时做一组液体试剂作为对照试剂。
(6)反应条件为
步骤 温度 时间
1.UNG消化 37℃-45℃ 5-10min
2.预变性 94℃ 10min
3.变性 94℃ 30s
4.退火 55℃ 30s
5.延伸 72℃ 1kb/min
6.终延伸 72℃,Go to step 3 35x 5min
(7)结果分析：
检测结果如下表和图1-2，对扩增Ct值进行分析：
样本编号 1 2 3 阳性对照
干粉试剂ct值 25.58 26.87 27.12 27.89
液体试剂ct值 26.43 26.19 26.31 28.66
由上表和图1-2可知冻干试剂结果与液体试剂扩增Ct值无明显差异，冻干过程不会影响试剂性能。
实施例二：冻干试剂稳定性验证
冻干试剂相较于液体试剂，最大的特点是能够实现常温储存及运输。为了验证本发明中涉及到的冻干工艺的稳定性，设计以下实验：
(1)引物探针设计
按照引物探针设计原则，设计甲型流感核酸检测引物探针。
引物名称 引物序列(5′-3′)
上游引物 CGCCRATCCTGTCAACCTCTGAA
下游引物 GCCCATTYTGGACAAAKCGTCTAAG
探针 FAM-TCCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ2
(2)按照如下配方配制甲型流感荧光PCR试剂
试剂 用量(μl) 终浓度
PCR缓冲液(10x) 1200 1x
上游引物(50μmol/L) 240 0.2μM
下游引物(50μmol/L) 240 0.2μM
探针(50μmol/L) 120 0.1μM
dNTPs(100mmol/L) 1200 200μM
Taq酶(5U/μL) 120 2.5U/50μl
UNG酶(1U/μL) 48 2.5U/50μl
甘油 240 5％
蔗糖 1608 200mmol/L
DDT 24 5mmol/L
牛血清白蛋白 480 1％
Proclin300 144 0.3％
甲酰胺 48 1％
ddH<sub>2</sub>0 6288
总体积 12000
(3)将步骤(2)所述试剂混匀后，按照50μL/孔分装至八联管中。
(4)将分装好的八连管放入冻干机中，试剂冷冻干燥及保存操作流程如下(冻干机置于除湿间内，温度恒定为23℃，湿度恒定为10％)。
Figure BDA0002629236700000081
冻干完成后，盖上八连管盖，遮光保存。
(5)采用3例临床样本以及1例阳性对照对冻干试剂进行验证。将冻干试剂用铝箔袋真空密封后保存在常温环境(约20℃)中，分别于冻干第0天、第7天、第14天复溶后进行扩增检测，并设置未冻干液态试剂为对照组。
(6)反应条件为
步骤 温度 时间
1.UNG消化 37℃-45℃ 5-10min
2.预变性 94℃ 10min
3.变性 94℃ 30s
4.退火 55℃ 30s
5.延伸 72℃ 1kb/min
6.终延伸 72℃,Go to step 3 35x 5min
(7)结果分析
检测结果如下表和图3-11，对扩增Ct值进行分析：
样本1 第0天 第7天 第14天
干粉试剂Ct值 26.69 26.32 26.07
液体试剂Ct值 26.48 26.25 26.13
阳性对照 28.70 28.55 28.33
样本2 第0天 第7天 第14天
干粉试剂Ct值 26.87 26.61 26.33
液体试剂Ct值 26.92 26.75 26.27
阳性对照 28.54 28.37 28.30
样本3 第0天 第7天 第14天
干粉试剂Ct值 26.75 26.43 26.32
液体试剂Ct值 26.69 26.45 26.31
阳性对照 28.69 28.53 28.42
由以上数据可知，无论是在冻干后第0天，第7天，还是第14天，冻干试剂扩增效率均不受影响，冻干试剂结果与液体试剂扩增Ct值无明显差异。实验结果表明本实验制备的核酸扩增冻干试剂检测性能较好，稳定性尚可，为后续冻干试剂的长期保存稳定性评价奠定了基础。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述原料：荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂。
2.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述体积份数的原料：4-6份荧光PCR扩增缓冲液、1-3份引物、0.2-1份探针、0.2-1份热启动Taq酶、0.1-0.3份UNG酶、2-10份dNTP9和35-38份冻干保护剂。
3.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，包括下述体积份数的原料：5份荧光PCR扩增缓冲液、2份引物、0.5份探针、0.5份热启动Taq酶、0.2份UNG酶、5份dNTP9和36.8份冻干保护剂；所述印务包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的体积比为1:1。
4.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括下述原料：甘油，蔗糖，DTT，牛血清白蛋白，Proclin 300，甲酰胺和ddH20。
5.如权利要求4所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：0.5-2份甘油，5-8份蔗糖，0.05-0.2份DTT，1-3份牛血清白蛋白，0.3-0.9份Proclin 300，0.1-0.3份甲酰胺和25-28份ddH20。
6.如权利要求5所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括下述体积份数的原料：1份甘油，6.7份蔗糖，0.1份DTT，2份牛血清白蛋白，0.6份Proclin300，0.2份甲酰胺和26.2份ddH20。
7.如权利要求3所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂，其特征在于，所述荧光PCR扩增缓冲液的浓度为10x，上游引物的浓度为50μmol/L，下游引物的浓度为50μmol/L，探针的浓度为50μmol/L，热启动Taq酶的浓度为5U/μL，UNG酶的浓度为1U/μL、dNTP9的浓度为100mmol/L。
8.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的试剂的冻干粉冻干方法，其特征在于，(1)将荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dNTP9和冻干保护剂于23℃下混合均匀，并平均分装到八联管中；(2)预冻：将八联管置于冻干机中，冷冻机降温至-40℃，降温时间70min，后保温3h；(3)升华干燥：将冻干机内压力至升0.16mbar、温度至降-45℃，此过程用时40min；后将冻干机内温度由-45℃升至55℃并保温6h，此过程用时1h；(4)将冻干内压力降至0.10mbar，此过程用时1h；(5)将冻干机内温度由55℃降升至30℃并保温6h，此过程用时1h；(6)取出八连管，封盖待用，常温避光保存；步骤(2)、(3)、(4)、(5)的过程中冻干机置于除湿间内，温度恒定为23℃，湿度恒定为10％。
9.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂的使用方法，其特征在于，步骤如下：将冻干粉试剂、Tween20、蔗糖、Tris-HCl、NaCl和ddH20混合均匀得冻干粉溶解液，冻干粉溶解液即可直接使用。
10.如权利要求9所述的一种用于核酸扩增的冻干粉试剂的使用方法，其特征在于，所述冻干粉溶解液中Tween20的浓度为0.5％，蔗糖的浓度为3％、Tris-HCl的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为20mmol/L。
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