CN109593834A - 一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药制备技术领域，具体涉及一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％‑25％。本技术中的冻干试剂体积小，冻干时间短、效率高、耗能低，可直接用于基因芯片实验，不会造成试剂反复冻融和浪费，可以有效的保证冻干过程中的有效物质的活性。

Description

一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法
技术领域
本发明属于医药制备技术领域，具体涉及一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法。
背景技术
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种可以在恒温条件下可短时间内实现核酸扩增的技术，具有“简便、快速、低价、精确”的优点，该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上可以媲美PCR反应，可不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。但是LAMP反应的扩增体系中含有聚合酶、dNTP等活性成分，需要在低温条件下保存，使用时需要进行解冻及反复冻融，不仅操作繁琐，且会对试剂中有效成分产生一定的影响甚至是失活。另外，低温保存会增加储存、运输方面的成本以及能耗。
冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥技术具有如下优点：1)许多热敏性的物质不会发生变性或失活；2)在冻干过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状；3)体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象；4)干燥在真空下进行，氧气极少，一些易氧化的物质得到了保护；5)能排除95％～99％以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。
现有技术存在的缺陷和问题主要包括：
1.恒温扩增试剂中含有的酶、dNTP等成分无法在相对高温的条件下稳定存在，需要储存于-20℃的冷冻环境中，且试剂反复复融对于试剂性能有一定的影响，试剂低温保存对于运输、储存及使用过程等有较高的要求，使用本技术可以使恒温扩增试剂于2-8℃或者常温保存；
2.使用液体试剂需要长时间解冻以及反复复融，操作比较繁琐；冻干后试剂只需要加入复溶液即可。
3.现有专利中的试剂反应体系较大，相同反应所需的冻干试剂体积较大，耗费的时间和能量均较大；而本体系的反应体系较小，对于一张芯片(5-10个反应体系)所需的冻干试剂体系不超过40μL，试剂用量少、冻干时间短、耗能低，冻干成本降低。
4.冻干试剂中所用的Bst酶含有一定量的甘油，对试剂形态和冻干过程均会有一定程度的影响，故现有的部分技术需要去除甘油或者购买无甘油的Bst酶，增加了试剂成本；本技术中所用的Bst酶为市售，常见易得、价格相对较低并货源稳定。
例如，现有技术“CN105274192 A”的中国专利申请公开了一种LAMP反应试剂混合物的保存方法，该方法在试剂混合物中加入了特定的一种或几种冻干保护剂，冻干保护剂与试剂混合物的体积或重量比为5％-20％，冻干后的试剂可于室温长期保存。该方法存在的缺点为：所用的核酸聚合酶为不含甘油的Bst核酸聚合酶。甘油在原料酶溶液中具有保护酶活性的作用，而基本上市面上所售的Bst酶中均含有50％的甘油溶液，少有的不含有甘油的Bst酶可能需定制，且价格高；而购买后进行去甘油处理的Bst酶浓度可能不准确且损失量较大。使用不含甘油的Bst酶会提高试剂成本。
还有，现有技术“CN 105274192 A”的中国专利申请公开了一种环介导等温扩增反应试剂混合物的一种保护方法。该方法通过在环介导等温扩增试剂混合物中添加一种特定的干燥保护剂，然后将混合物在低于80℃的条件下进行真空干燥或快速风干，实现环介导等温扩增反应试剂混合物在常温或室温下的长期保存。该方法存在的缺点为：真空干燥或者快速风干的温度过高，存在试剂失活的风险。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种保证核酸扩增试剂冻干品在2-8℃或者室温下长期保存所需的冻干试剂及保护体系。
本发明通过以下技术方案来实现：一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％-25％。
通过大量的实验研究发现，所列取冻干保护剂为生物冻干中常用保护剂，对LAMP反应无影响或影响很小。
作为本发明的一种优选技术方案，LAMP反应扩增试剂的组成为0.1-4.0U/μL的Bst酶、0.0001-0.0005U/μL的UNG酶、0.4-2.0mmol/L的dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4和纯化水中的两种或两种以上。此配方为试剂为通过大量实验优选得到，是筛选得到的适合LAMP反应扩增的配方。
作为本发明的一种优选技术方案，冻干保护剂组成按质量比计为：甘露醇3％-12％、聚乙二醇1-5％、苏氨酸0.5％-2％，余量为纯化水。通过大量的实验研究发现，该保护剂配方中可使得冻干试剂形态较好，试剂性能较好且可长期稳定储存。
作为本发明的一种优选技术方案，反应扩增试剂分为冻干部分试剂以及复溶液，冻干部分试剂如前所述，所述复溶液含有分别为0.4-2.0mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4中的两种或两种以上。
具体的优选的复溶配置和使用方法包括：
将MgSO4(1.0-10.0mmol/L)按照一定的比例溶于纯化水中，加入所述其他物质，使得最终复溶液的体积为30μL/管冻干试剂，将配制好的复溶液标明配制时间及保存条件(4℃)待用。
取出一管已冻干的试剂，加入30μL复溶液，震荡至冻干试剂完全溶解，离心后可进行扩增反应。
作为本发明的一种优选技术方案，所述荧光染料选择SYBR GREEN I或EVA GREEN。
作为本发明的一种优选技术方案，冻干体系包括：核酸扩增试剂的冻干试剂1-10μL，以及冻干保护剂混合液5-30μl，终冻干体系约为6-40μL，冻干用离心管为100μL、200μL、500μL、1500μL中的一种。
通过大量的实验研究发现，进一步优选选用500μL的离心管。相对于200μL离心管，选用500μL离心管可以使得试剂形态良好，冻干时间大大缩短；相对于1500μL，500μL离心管单价较低，节约资源。
本发明的另一目的在于提供一种制备前述的冻干保护体系的方法，包括：
1)核酸扩增试剂配制步骤：
将Bst酶、UNG酶、dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、甜菜碱、荧光染料(SYBRGREEN I或EVA GREEN)、MgSO4和纯化水中的两种或两种以上取出置于室温中，待试剂融化后，按照一定的体积比例取出，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用，标明配制日期和保存条件(-20℃)；
2)冻干保护剂配制步骤：
(2.1)将各保护剂使用天平称量一定的质量，分别溶于100ml的纯化水中，震荡混匀，配制为保护液原液，标明配制日期和保存条件；
(2.2)根据冻干保护剂的配方，按照一定的体积比例取出保护剂，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用；
3)冻干用液体试剂的配制
各取出核酸扩增试剂(100个反应)和冻干保护剂(100个反应)相应的体积混合均匀后进行分装(40μL/反应)，离心待用；
冷冻干燥处理包括以下步骤：
1)预冻阶段：液氮1-8min或控制温度-50℃～-40℃，压强为1atm，维持1-3h；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持3-6h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
4)升华阶段：控制温度-35℃～-25℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
5)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
6)解析阶段：控制温度0℃～15℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-4h；
解析阶段：控制温度15℃～30℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-4h。
通过大量的实验研究发现，此冻干参数下，冻干后的试剂体积基本保持不变，试剂形态较好，且可以使得冻干试剂水分含量≤5％，且此参数用时最短，较节能。
除另有说明外，本发明所述的冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。是将热能通过与物料接触的壁面以传导方式传给物料，使物料中的湿分气化并由周围空气气流带走而干燥的操作。
本发明所述酶通过市售产品获得，所述产品中含有酶和buffer等物质。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
1.恒温扩增试剂中含有的酶、dNTP等成分无法在相对高温的条件下稳定存在，需要储存于-20℃的冷冻环境中，且试剂反复复融对于试剂性能有一定的影响，试剂低温保存对于运输、储存及使用过程等有较高的要求，使用本技术可以使恒温扩增试剂于2-8℃或者常温保存，可以有效的保证冻干过程中的有效物质的活性。
2.本技术中所用辅料无生物危害、成本低廉、原料易得、保存方便且效期长。
3.冻干后试剂可迅速复溶，操作简单，避免液体试剂长时间解冻以及反复冻融，减小试剂中有效成分失活的情况发生概率。本技术中的冻干试剂可用于微流控芯片，复溶后全部使用，无需再冷冻，完全避免反复冻融。
4.用于芯片的扩增试剂仅需5-10个反应体系，加入冻干保护剂后的总体积不超过40μL，远远低于相同其他专利中冻干体积，故需要的冻干时间相对较短，耗能少。
5.本技术中所用的Bst酶为常见的市售试剂，无需经过处理去除甘油或购买价格较高的无甘油Bst酶。
6.本技术的产品可以室温保存半年，37℃保存指数4周或2-8℃保存1年甚至更长；可以短期45℃以下运输。
附图说明
图1本发明实施例1全体系和分体系冻干都的结果示意图；
图2试剂二高温14天热稳定性试验示意图，模板浓度为103CFU/ml和102CFU/ml；
图3试剂二高温28天热稳定性试验示意图，模板浓度为103CFU/ml和102CFU/ml；
图4试剂三高温7天热稳定性试验示意图，模板浓度为5*102CFU/ml和5*103CFU/ml；
图5试剂三高温14天热稳定性试验示意图，模板浓度为5*102CFU/ml和5*103CFU/ml。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种LAMP扩增试剂冻干保护体系及冷冻干燥处理步骤如下：
(1).全体系冻干：将Lamp反应所需的试剂全部混合在一起，试剂具体成分如下：
组分 体积 含量
Bst酶(8U/μL) 80μL 640U
UNG酶(1U/μL) 0.5μL 0.5U
dNTPS(100mM) 20μL 2μM
MgSO4(100mM) 40μL 4μM
Buffer(10X) 100μL /
SYBR GREEN I(250X) 15μL 3.75X
甜菜碱(5M) 2000μL 15mM
纯化水 44.5μL /
冻干保护剂为以下配方中的一种：
组分 体积 含量
甘露醇(18％，w/v) 1110μL 5％
BSA(10％，w/v) 200μL 0.5％
甘氨酸(100mM) 200μL 5mM
纯化水 290μL /
(2).分体系冻干：准备扩增反应液冻干部分(A溶液，100个反应)，除下表中的剩余组分配制为复溶液，具体成分见下表：
组分 体积 含量
Bst酶(8U/μL) 80μL 640U
UNG酶(1U/μL) 0.5μL 0.5U
dNTPS(100mM) 20μL 2μM
SYBR GREEN I(250X) 15μL 3.75X
甜菜碱(5M) 2000μL 15mM
纯化水 84.5μL /
准备冻干保护体系(B溶液，100个反应)，具体成分见下表：
组分 体积 含量
甘露醇(18％，w/v) 1110μL 5％
BSA(10％，w/v) 200μL 0.5％
甘氨酸(100mM) 200μL 5mM
纯化水 290μL /
将前述(1)全体系混合均匀后，和(2)分体系的A溶液和B溶液分别混合均匀后，将A溶液和B溶液混合在一起，离心后进行分装，冻干试剂液体体积约为40μL/管，或将试剂以冻干珠形式点于预冻处理后的金属板上，冻干珠体积为10μL/个，将分装好的PCR管或者冻干珠放置于冷冻干燥机内，冻干程序如下：
步骤 温度 时间 压强
1 -50℃ 2 1atm
2 -45℃ 8 1.5Pa
3 -40℃ 2 1.0Pa
4 -25℃ 1 1.0Pa
5 10℃ 1 1.0Pa
6 20℃ 2 1.0Pa
将冻干后的试剂形态进行初步比较如图1所示，在全体系和分体系中加入相同配方的保护剂，将冻干后的试剂形态进行比较：试剂全体系冻干后管内试剂呈鼓泡状，有极薄的表层，而冻干珠也为一空心珠，不容易使用镊子夹取并转移；分体系的试剂冻干后管内试剂为一分布均匀的规整块状固体，冻干珠为一实心珠，易夹取和转移，且极易复溶。
注：X是购买试剂时自带的浓度单位，按照产品说明书记载的方法，按比例稀释或者使用高浓度比例进行试验。
实施例2冻干保护试剂的配方筛选
冻干保护剂配方，质量比如下，余量为纯化水：
配方一：葡聚糖5％、聚乙二醇2％、蔗糖2％；
配方二：甘露醇8％、聚乙二醇1％、苏氨酸1％；
配方三、甘露醇5％、牛血清白蛋白2％、甘氨酸1％；
配方四、聚乙烯吡咯烷酮3％、牛血清白蛋白2％、海藻糖1％。
将以上四组配方与LAMP试剂(分体系中的A溶液部分)混合后进行冻干，将冻干试剂进行灵敏度实验以及形态比较，并设置对照组，对照组为未经冻干的反应试剂(不含有冻干保护剂)。
序号 组别 试剂形态 出箱当天灵敏度
1 冻干试剂(配方一) 海绵状疏松团块 10<sup>3</sup>CFU/ml
2 冻干试剂(配方二) 海绵状疏松团块 10<sup>2</sup>CFU/ml
3 冻干试剂(配方三) 海绵状疏松团块 5*10<sup>2</sup>CFU/ml
4 冻干试剂(配方四) 海绵状疏松团块 5*10<sup>3</sup>CFU/ml
5 对照试剂 液体 5*10<sup>2</sup>CFU/ml
冻干结束后将PCR管从冻干机中拿出，并迅速将管子扣盖并密封；将冻干后的试剂进行水分测定，水分含量为2.0％-5.0％。
实施例3热稳定性试验
经过冻干试剂配方筛选，选择配方二和配方三进行试剂热稳定性试验(37℃恒温)，对试剂的稳定性进行初步的评价，同时每次检测时设置对照组(未加入冻干保护剂的反应体系)，试验结果参照图2-5所示，
灵敏度 出箱当天 高温7天 高温14天 高温21天 高温28天
试剂二 10<sup>2</sup>CFU/ml 10<sup>2</sup>CFU/ml 10<sup>2</sup>CFU/ml 10<sup>2</sup>CFU/ml 10<sup>3</sup>CFU/ml
试剂三 5*10<sup>2</sup>CFU/ml 5*10<sup>2</sup>CFU/ml 5*10<sup>3</sup>CFU/ml 失效 失效
对照试剂 5*10<sup>2</sup>CFU/ml 失效 失效 失效 失效
本发明中，灵敏度测试中的反应曲线Ct≤48即可确定试剂有效性，从上述结果可见，本发明的冻干保护试剂，特别是试剂二，可以37℃保存指数4周甚至更长，大大提高了LAMP扩增试剂的储藏稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系，其特征在于，所述冻干保护体系包括核酸扩增试剂和冻干保护剂，核酸扩增试剂为用于LAMP反应扩增试剂，冻干保护剂为以下试剂中的一种或几种复合物：聚乙二醇、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、苏氨酸、甘氨酸，且所述冻干保护剂与扩增反应试剂的重量体积比浓度为3％-25％。
2.根据权利要求1所述的冻干保护体系，其特征在于，LAMP反应扩增试剂的组成为0.1-4.0U/μL的Bst酶、0.0001-0.0005U/μL的UNG酶、0.4-2.0mmol/L的dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4和纯化水中的两种或两种以上。
3.根据权利要求1或2所述的冻干保护体系，其特征在于，冻干保护剂组成按质量比计为：甘露醇3％-12％、聚乙二醇1-5％、苏氨酸0.5％-2％，余量为纯化水。
4.根据权利要求1或2所述的冻干保护体系，其特征在于，反应扩增试剂分为冻干部分试剂以及复溶液，所述复溶液含有分别为0.4-2.0mmol/L的dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、0.1-5.0mol/L的甜菜碱、0.1-3.0X荧光染料、1.0-10.0mmol/L的MgSO4中的两种或两种以上。
5.根据权利要求2或4所述的冻干保护体系，其特征在于，所述荧光染料选择SYBRGREEN I或EVA GREEN。
6.根据权利要求1所述的冻干保护体系，其特征在于，冻干体系包括：核酸扩增试剂的冻干试剂1-10μL，以及冻干保护剂混合液5-30μl，终冻干体系约为6-40μL，冻干用离心管为100μL、200μL、500μL、1500μL中的一种。
7.一种制备权利要求1-6任一项所述的冻干保护体系的方法，包括：
1)核酸扩增试剂配制步骤：
将Bst酶、UNG酶、dNTPS(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP)、甜菜碱、荧光染料(SYBR GREENI或EVA GREEN)、MgSO4和纯化水中的两种或两种以上取出置于室温中，待试剂融化后，按照一定的体积比例取出，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用，标明配制日期和保存条件(-20℃)；
2)冻干保护剂配制步骤：
(2.1)将各保护剂使用天平称量一定的质量，分别溶于100ml的纯化水中，震荡混匀，配制为保护液原液，标明配制日期和保存条件；
(2.2)根据冻干保护剂的配方，按照一定的体积比例取出各组分的保护剂原液，置于同一离心管中，混合均匀，离心备用；
3)冻干用液体试剂的配制
各取出核酸扩增试剂(100个反应)和冻干保护剂(100个反应)相应的体积混合均匀后进行分装(40μL/反应)，离心待用；
冷冻干燥处理包括以下步骤：
1)预冻阶段：液氮1-8min或控制温度-50℃～-40℃，压强为1atm，维持1-3h；
2)升华阶段：控制温度-50℃～-40℃，压强0.1-2.0Pa，维持3-6h；
3)升华阶段：控制温度-40℃～-30℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
4)升华阶段：控制温度-35℃～-25℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
5)升华阶段：控制温度-30℃～-20℃，压强0.1-2.0Pa，维持2-4h；
6)解析阶段：控制温度0℃～15℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-4h；
解析阶段：控制温度15℃～30℃，压强0.1-2.0Pa，维持1-4h。
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