WO2014137093A1

WO2014137093A1 - 교차오염 억제용 ｕｄｇ를 함유한 중합효소연쇄반응액의 동결건조물

Info

Publication number: WO2014137093A1
Application number: PCT/KR2014/001524
Authority: WO
Inventors: 윤기홍; 명현군; 이병철
Original assignee: 우송대학교 산학협력단; 솔젠트(주)
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2014-09-12
Also published as: KR20140110138A

Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응용 동결건조 시약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 중합효소연쇄반응용 동결건조 시약 조성물은 중합효소연쇄반응 성분들의 동결건조를 통해 상온에서의 안정성과 보관성을 향상시킬 수 있다. 동결건조된 시약 조성물을 상온에서 증류수를 첨가하여 핵산 증폭반응을 수행하는 경우 중합효소연쇄반응의 효능과 검체의 판별능을 유지할 수 있다. 또한, UDG (Uracil DNA Glycosylase)가 포함된 중합효소연쇄반응용 동결건조 시약 조성물의 경우 핵산 증폭 반응시 교차오염으로 인해 발생할 수 있는 진단 오류의 문제점과 위험성을 최소화할 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

교차오염 억제용 UDG를 함유한 중합효소연쇄반응액의 동결건조물 【기술 분야】

본 발명은 중합효소연쇄반응용 동결건조 시약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서， 보다 상세하게는 교차오염 억제 작용을 갖는 UDG(Uracil DNA Gylcosylase) 효소가 포함된 중합효소연쇄반웅용 동결건조 시약 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

【배경 기술]

중합효소연쇄반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction) 기반의 분자진단이란 PCR법을 사용하여 특정 DNA를 증폭하여 질병이나 유전자형을 확인하는 것으로 체외진단 (in vitro diagnosis)은 질병 감염 여부 등을 판정할 목적으로 혈액, 뇨， 타액 등 인체에서 유래하는 시료를 검체로 하여 특정 지표물질을 검출하거나 정량 분석하는 검사이다. 분자진단은 증상진단과 면역진단에 이어 특정한 유전자를 탐지해 낼 수 있는 기술을 기반으로 이루어진다. 분자진단은 배양검사가 어렵거나 불가능할 경우 또는 배양검사를 통해 신속하게 진단하기 힘들거나 매우 전염속도가 높으며 조류독감 바이러스처럼 변종의 출현이 빈번하게 일어나는 경우 매우 유익한 진단방법이다. 따라서 병원성 미생물이나 바이러스 진단에 적합한 특이적 유전자형을 탐지할 수 있는 바이오마커를 개발하는 것이 중요한데 이는 유전체 염기서열을 기반으로 이루어진다. 분자진단에 활용되는 PCR은 현재 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용하고 있는 검사방법으로， 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법이다. 중합효소 연쇄 반응에 의해， 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있다. 분자진단을 위해서는 크게 3 단계의 검사 과정이 있는데 첫째는 다양한 생물시료로부터 핵산을 추출하는 과정으로 핵산의 순도와 수율， 안정성 및 시료의 유전체간에 교차오염이 되지 않도록 해야한다. 둘째는 유전자 증폭과정으로 특정 염기서열로 구성된 탐지용 올리고뉴클레오티드를 사용하여 특정 유전자만을 증폭한다. 이때는 PCR 조건을 조절하여 유전자를 증폭하며 이과정에서 증폭된 유전자 단편을 최종 단계에서 전기영동이나, 실시간 (Real time) PCR 을 통해 조사한다. 경우에 따라서는 증폭된 유전자의 염기서열을 결정하여 유전적 다중도를 분석할 수 있다.

PCR 은 기본적으로 Taq 중합효소라는 내열성 효소에 의한 유전자의 중합반웅을 용액상태에서 실시하는 것이다. 내열성 DNA 중합효소라 하더라도 기본적으로 단백질은 상온의 수용액상태에서는 단백분해효소의 작용, 다양한 자유-라디칼의 산화작용 등으로 효소로서의 기능을 서서히 상실하게 되므로， 분자진단을 위한 키트로 개발하기 위해서는 특정 보존용액에 들어 있는 상태의 냉동상태로 보존하고 유통해야 한다. 따라서 제품의 유통 시 필연적으로 냉동상태가 요구되므로 드라이아이스 포장， 넁동박스 등의 추가적인 물류비가 상대적으로 많이 소요되는 것이 현실이다. 특히 사용자가 편리한 방식을 선호함에 따라 프리믹스 (Premix)의 형태， 즉 기존의 사용자가 직접 반웅용액을 흔합하던 방식에서， 이미 모든 기본적인 반웅액이 흔합된 상태로 제공되어 수요자가 최소한의 기질， 주형 DNA, 프라이머 (primer) 및 증류수만 첨가함으로써 PCR 반웅을 수행할 수 있도록 흔합하여 판매되는 형태의 시장이 점차 확대되고 있다. 더구나 진단시약의 해외 진출이 활발해지고 있으므 έ 유통과정의 문제점 해결을 위해 건조형태의 진단용 프리믹스 (premix)가 개발이 필요한 실정이다.

PCR 기술을 활용하여 진단제품의 경우， 사용자의 실수에 의해 전혀 다른 결과가 도출되고 따라서 진단의 오류가 발생할 가능성이 커지기 때문에 상대적으로 프리믹스 (premix) 형태의 제품이 시장에서는 더 선호되고 있다. PCR 관련 효소들의 프리미스 타입 제품들의 장점에도 불구하고， 프리믹스 (Premix) 제품이 가지는 큰 단점으로 흔합물의 안정성이 떨어지며 기존 제품보다 더 온도 등의 외부 환경에 취약하다는 점이 지적되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. 【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명자들은 의료， 식품, 화학, 환경 등의 광범위한 산업 분야에 적용될 수 있는 PCR 진단용 프리믹스 키트의 건조형 제품을 제조하는 기술 을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과， 동결보존제로서 당류 (sugars)를 첨가한 PCR 반웅용액을 동결건조한 후 다시 증류수를 가하여 PCR 반응에 사용하는 경우 PCR 반웅에 의한 진단 및 검출 효능이 전혀 저하 되지 않고 동등하게 유지됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서， 본 발명의 목적은 중합효소연쇄반응용 동결건조 시약 조성물 을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 중합효소연쇄반응용 동결건조 시약 조성 물의 제조방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 동결건조된 다음의 성분을 포함하는 중합효소연쇄 반웅용 동결건조 시약 조성물을 제공한다: (i) 중합효소연쇄반응 완층액， (ii) dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP), (iii)

DNA중합효소， (iv) 프라미어 (primer) 및 (v) 당 (sugar).

본 발명에서 상기 당은 중합효소연쇄반응 성분들의 동결건조시 동결보존제로서 작용한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 시약 조성물에서 상기 당 (sugar)은 글루코스 (glucose), 자일로스 (xylose)， 자일리를 (xylitol), 수크로스 (sucrose), 샐로비오스 (eel lobi^se) , 말토트리오스 (maltotriose), 만노스 (mannose) , 멜리비오스 (mel ibiose) , 트레할로스 (trehalose) 및 스타키오스 (stachyose)로 이루어지는 군에서 선택된 당이다.

본 발명의 다른 구현에에 따르면， 상기 당은 말토트리오스， 만노스， 멜리비오스， 트레할로스 및 스타키오스로 이루어지는 군에서 선택된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 당은 트레할로스 또는 스타키오스이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 당은 트레할로스이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 당은 상기 시약 조성물에서 10- 40중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 다른 구현에에 따르면， 상기 당은 상기 시약 조성물에서 16-40 중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 당은 상기 시약 조성물에서 16-30중량 &의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 상기 당은 상기 시약 조성물에서 20-30 중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 당은 상기 시약 조성물에서 20-25중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 DNA중합효소는 DNA 의존성 DNA 중합효소 (DNA dependent DNA polymerase), RNA 의존성 DNA 중합효소 (RNA dependent DNA polymerase), 또는 이들의 흔합물이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA중합효소이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 시약 조성물은 UDG(Uracil DNA Gylcosylase) 및 dUTP를 추가로 포함한다.

본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 중합효소연쇄반웅용 동결건조 시약 조성물의 제조방법을 제공한다: (a) (i) 중합효소연쇄반웅 완층액, (ii) dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP), (iii) DNA 중합효소， (iv) 프라미어 (primer)ᅳ (v) 당 (sugar) 및 (vi) 증류수가 포함된 중합효소연쇄반웅용 시약 조성물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조한 시약 조성물을 동결건조시키는 단계.

본 발명의 상기 제조방법에서 동결건조 시약 조성물에 대한 내용은 상기 시약조성물에서 설명된 내용과 동일하므로 중복하여 설명하지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 제조방법에서 단계 (a)의 상기 당은 글루코스， 자일로스, 자일리틀, 수크로스, 셀로비오스， 말토트리오스， 만노스， 멜리비오스, 트레할로스 및 스타키오스로 이루어지는 군에서 선택된 당이다.

본 발명의 다른 구현에에 따르면 , 상기 당은 말토트리오스， 만노스， 멜리비오스, 트레할로스 및 스타키오스로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 당은 트레할로스 또는 스타키오스이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 상기 당은 트레할로스이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 당은 상기 시약 조성물에서 10- 40 중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 상기 당은 상기 시약 조성물에서 16-30 중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 당은 상기 시약 초성물에서 20-30 중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 상기 당은 상기 시약 조성물에서 20-25 중량 %의 농도로 포함된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 , 상기 DNA 중합효소는 DNA 의존성 DNA 중합효소 (DNA dependent DNA polymerase), RNA 의존성 DNA 중합효소 (RNA dependent DNA polymerase), 또는 이들의 흔합물이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 시약 조성물은 UDGCUracil DNA Gylcosylase) 및 dUTP를 추가로 포함한다. 【유리한 효과】

본 발명의 중합효소연쇄반웅용 동결건조 시약 조성물은 중합효소연쇄반웅 성분들의 동결건조를 통해 상온에서의 안정성과 보관성을 향상시킬 수 있다. 동결건조된 시약 조성물을 상온에서 증류수를 첨가하여 핵산 증폭반웅을 수행하는 경우 중합효소연쇄반응의 효능과 검체의 판별능을 유지할 수 있다. 또한， UDGCUracil DNA Glycosylase)가 포함된 중합효소연쇄반웅용 동결건조 시약 조성물의 경우 핵산 증폭 반응시 교차오염으로 인해 발생할 수 있는 진단 오류의 문제점과 위험성을 최소화할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 동결 건조된 PCR 반응용 Taq 프리믹스 (윗쪽 패널)와 일반 건 조된 PCR 반웅용 Taq 프리믹스 (아래쪽 패널)의 PCR 효율을 비교한 결과를 보여준다.

도 2는 첨가당의 종류와 농도에 따른 PCR 반응용 Taq 프리믹스의 PCR 효율을 비교한 결과이다. A; 글루코스， B; 자일로스， C; 자일리를, D; 말 토트리오스， E; 수크로스， F; 셀로비오스， G; 만노스, H; 멜리비오스， I； 스타키오스， J; 트레할로스. 첨가당별로 주형의 농도는 왼쪽 레인부터 각각 50ng, 10ng, 2ng으로 실험하였다.

도 3은 PCR 반웅용 Taq 프리믹스의 동결건조과정과 동결건조 후 상태 를 보여주는 도면이다.

도 4는 첨가당의 종류와 농도를 달리하여 PCR 프리믹스 키트의 건조 후 활성을 비교한 결과를 보여준다. 각 당별로 왼쪽 레인부터 첨가량이 각 각 10， 20， 30, 40% 이다.

도 5는 한 단계 RT— PCR 프리믹스 키트의 건조 전후의 활성을 비교한 결과를 보여준다. 왼쪽 패널은 건조전 액상형 키트를 사용한 결과이며 오 른쪽 패널은 동결건조로 제조한 키트를 사용한 결과이다. 주형의 사용량은 각각 1; 50ng, 2； 5 ng, 3； 0.5 ng, 4； 0.05 ng, 5； 0.005 ng, 6； 0.0005 ng 이었다.

도 6은 한 단계 RT-PCR 프리믹스 키트의 건조 전 (A)과 동결건조 후 (B)의 활성을 비교한 결과이다.

도 7은 트레할로스 (Trehalose)의 첨가량에 따른 PCR 프리믹스 동결건 조 키트의 안정성을 측정한 결과이다. 트레할로스의 첨가농도는 0% (가장 위쪽 패널)， 10% (중간 패널), 20% (가장 아래쪽 패널)로 하여 실험하였다. 파란색은 대조군으로서 트레할로스가 아닌 글리세를을 첨가한 키트의 결과 이고， 검은색은 트레할로스를 첨가한 키트로서 동결 -해동 (Freeze-thawing) 을 하지 않은 것 (0회 반복)이며, 핑크색은 동결 -해동 (Freeze-thawing)을 5 회 반복， 파란색은 동결 -해동 (Freeze-thawing)을 10회 반복, 초록색은 동결 P T/KR2014/001524

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-해동 (Freeze-thawing)을 15회 반복， 빨간색은 동결 -해동 (Freeze—thawing) 을 20회 반복한 것의 결과이다.

도 8은 UDG Jracil DNA Glycosylase)를 첨가한 PCR 프리믹스의 건조 전 (1번 레인)과 건조후 (2번 레인)의 유전자 증폭활성을 비교한 결과이다. 밑줄 친 번호는 검체시료별 번호이다.

도 9는 UDGOJracil DNA Glycosylase)를 첨가한 멀티플렉스 (multiplex) PCR 프리믹스의 건조전과 건조후의 유전자 증폭활성을 비교한 결과이다. 밑줄위의 양은 사용된 주형 시료 유전체의 양이며 각각의 주형 에 대해 왼쪽은 건조전 프리믹스 키트를 사용한 결과이고， 오른쪽은 건조후 의 프리믹스 키트를 사용한 결과이다.

도 10은 트레할로스 (25%)를 첨가한 pfu 프리믹스의 효능 비교 결과 이다. 도면의 왼쪽 젤은 액상형이고 오른쪽 젤은 건조형 프리믹스이다. 사용한 주형의 유전체 양은 1; 50ng, 2; 10ng, 3； 2ng, 4； 0.4ng, 5； ^' 0.08ng, 6； 0.016ng 이다. NTC은 주형의 유전체를 사용하지 않은 대조군이 다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실시예 1: 건조방식에 따른 건조효율 측정

동결건조 방식은 건조과정 중 활성의 상실을 적어 안정성이 높다는 장점은 있지만, 동결건조기를 사용하여야 하고 생산 규모에 한계가 있어 산업용 효소에는 적합하지 않다. 일반건조의 경우 대량생산이 용이하며 생산단가가 상대적으로 동결건조에 비해 저렴하다는 장점이 있는 반면， 건조시간이 길며， 효소의 안정성에 영향을 미칠 수 있어 제품마다 건조 정도의 차이가 발생하는 등의 제품 품질의 균일성에 문제가 발생할 가능성이 크다는 단점이 있다. 분자진단용 PCR 프리믹스 (premix)에는 무기염과 고온에서 민감한 탐지용 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드가 첨가되어 있어 일반 열풍의 건조방식을 도입할 경우 진단 효능에 영향을 미칠 수 있다. 동결건조는 비교적 저렴한 산업용 효소 제품을 건조하는데는 적합하지 않으나 분자진단용 PCR 프리믹스의 원가에 미치는 영향은 낮은 편이다. 따라서 일반 건조방식과 동결 건조방식을 사용하여 건조한 Taq 프리믹스의 성능을 비교하기 위해 대장균 유전체를 주형으로 하여 PCR 반웅을 실시하였다. 그 결과 도 1에서 보여지는 바와 같이 동결 건조방식으로 제조한 프리믹스에서는 증폭된 DNA의 양이 주형의 DNA를 0.4 ng을 사용하였을 때도 관찰이 되었으나, 일반 건조방식으로 제조한 프리믹스에서는 10 ng의 주형을 사용하였을 때 관찰이 가능하여 약 25배의 증폭 효율에 차이를 보였다. 이러한 결과로부터 동결건조 방식이 PCR 프리믹스에 더 적합한 것으로 확인되었다. 실시예 2: 첨가당이 PCR프리믹스의 건조 효능에 미치는 영향 분석

액상형 PCR 프리믹스에는 -20^°C에서 보존하기 위한 동결보호제로 글리세를 (glycerol)을 사용한다. 그러나 글리세를은 건조형의 프리믹스를 제조할 때는 건조를 방해하는 물질로 작용하여 건조시 조성액의 점도가 높아지고 건조가 완전히 이루어지지 않는 단점이 있다. 따라서 건조형 프리믹스를 제조하기 위해서 동결건조시 효소의 활성과 안정성의 유지에 적합한 첨가물질을 선발할 필요가 있다. 본 실시예에서는 단당류， 이당류, 삼당류 중 10개의 당을 선발하여 프리믹스 키트에 첨가한 후 이를 동결건조하여 동결건조 전과 후의 활성을 비교하였다.

우선적으로 당을 첨가하였을 때 PCR 프리믹스의 효율에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서 당의 농도를 10%가 되도록 첨가한 상태에서 PCR을 실시하고 이로부터 증폭된 DNA 단편을 아가로즈 젤 (agarose gel) 전기영동을 통해 분석하였다. 그 결과 도 2와 같이 당의 종류와 첨가량에 따라 PCR 효율에 크게 차이가 있는 것으로 나타났다. 글루코스 (glucose), 자일로스 (xylose)와 자일리를 (xylitol)을 첨가하였을 때는 프리믹스의 효율이 가장 낮았으며， 수크로스 (sucrose)와 셀로비오스 (cellobiose)는 이보다 약간 효율이 높은 것으로 나타났다. 말토트리오스 (maltotriose), 만노스 (mannose)와 멜리비오스 (melibiose)를 첨가하였을 때는 효율이 우수하였고， 트레할로스 (trehalose)와 스타키오스 (stachyose)를 첨가하였을 때 가장 효율이 우수한 것으로 나타났다.

PCR 프리믹스의 반웅효율을 방해하는 정도가 낮은 당으로 확인된

5개의 당, 말토트리소스， 만노스, 멜리비오스， 트레할로스， 스타키오스를 10, 20， 30, 40%로 각각 첨가한 프리믹스 키트를 제조하여 동결건조 후 활성의 차이를 분석하였다. 동결건조 시간은 2일간 실시하였으며, 동결건조된 정도는 육안으로 관찰하고 동결건조된 반응액을 녹일 때 최종 부피가 첨가한 증류수의 양과 일치하는 지로 판단한 결과 모두 완전히 건조된 것으로 확인되었다 (도 3).

건조된 PCR 프리믹스를 사용하여 PCR을 수행한 후 증폭된 산물을 아가로즈 젤 (agarose gel) 전기영동으로 분석한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 당을 첨가하지 않은 프리믹스는 PCR 반웅이 정상적으로 수행되지 않았다. 이는 동결 및 건조과정 중에서 효소의 활성이 실활된 때문으로 추정된다. 그러나 당을 첨가한 상태에서는 첨가하지 않았을 때보다 모두 PCR 효율이 개선되었으며， 트레할로스를 첨가하였을 때 가장 높은 것으로 나타났다. 농도로 보았을 때는 20%를 첨가한 상태에서 활성의 유지가 전체적으로 높았다. 삼당류인 스타키오스는 트레할로스에 비해서는 낮지만 20% 이상에서는 다른 당 보다는 활성이 유지된 것으로 나타났다 (도 4). 실시예 3: 역전사효소가 포함된 PCR프리믹스의 활성 분석

RNA 바이러스 질환을 분자진단하기 위해서는 DNA 중합효소 뿐만 아니라 RTase가 함유된 PCR 프리믹스에 대한 건조형 제품 개발도 요구되므로 이를 위해서 일ᅳ단계 RT-PCR 프리믹스 키트를 건조하고 이의 활성을 조사하였다. 그 결과 도 5와 같이 건조전의 액상형으로 PCR을 수행한 것에 비해 건조후에 활성이 약간 저하된 것으로 나타났으나 그 정도가 매우 적어 건조형으로 RNA 바이러스를 탐지하는 분자진단 키트의 개발이 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 탐지용 프라이머를 달리하여 건조형 RT-PCR 프리믹스의 활성을 비교한 결과 건조 전후에 활성이 거의 동일하게 유지되는 것으로 확인되어 트레할로스를 25%로 첨가한 건조형 RT-PCR 프리믹스 키트는 RNA 바이러스 진단에 적합한 것으로 나타났다 (도 6). 一 실시예 4: 실시간 PCR에서 트레할로스의 농도별 활성 분석

PCR 프리믹스의 동결과정에서 트레할로스가 안정성쎄 미치는 영향을 검토하기 위해 농도를달리 첨가하고 동결과 해동을 반복하면서 PCR 효율을 실시간 PCR로 조사하였다. 그 결과, 트레할로스를 첨가하지 않은 프리믹스는 5회 이상 동결 해동을 반복하면 증폭효율이 감소하였고 20회의 동결 해동을 반복하면 매우 증폭효율이 감소하였다. 그러나, 10%의 트레할로스를 첨가하였을 때는 20회 동결 해동 반복시에 증폭효율이 감소하였으나， 20%를 첨가하였을 때는 20회 동결 해동 반복시에도 PCR 증폭효율이 약간 저하되는 것으로 나타났다. 이로부터 트레할로스는 동결건조 과정에서 동결에 의한 프리믹스의 효능 저하를 방지하는 것으로 판단된다 (도 7). 실시예 5: 교차오염 방지용 UDG가 첨가된 건조형 PCR프리믹스의 제조

분자진단에서 검체시료의 채취단계부터 PCR 반응단계에 이르기 까지 판정에 문제를 일으킬 소지가 많은 것이 시료간 교차오염이다. 검체시료를 채취하는 단계에서는 검사할 시료외의 물질이 흔입되지 않도록 하는 주의가 필요하지만, 일반적으로 여러개의 검체를 한꺼번에 취급하게 되는 PCR 과정에서는 시료간 교차오염이 발생할 수 있다. 이 경우 PCR 증폭산물의 분석이 어려워지게 되므로 교차오염을 줄이기 위해서는 UDG (uracil DNA glycosylase) 시스템을 적용한 PCR 제품이 유리하다. 그러나 UDG 시스템은 UDG 효솨가 동결과 건조에 매우 취약하다는 문제가 있다. 따라서， 본 실시예에서 PCR 조성물에 UDG를 첨가하여 건조형 PCR 프리믹스를 제조하고 이의 효능을 분석하였다. 그 결과 도 8에 나타난 바와 같이， 건조전과 건조후 PCR 효능에 차이가 없이 증폭된 DNA의 양이 거의 동일한 것으로 나타나 동결건조 과정에서 효능이 저하되지 않은 것으로 확인되었다 (도 8). 또한, 여러개의 유전자 타겟을 동시에 증폭하여 시료를 판정하는 것이 좀 더 정확한 방법이므로 UDG를 첨가한 멀티플렉스 PCR 프리믹스를 제조하여 그 효능을 분석하였다. 사용된 주형 시료의 양은 UDG를 첨가하지 않았을 때 보다는 높은 농도로 첨가하였다. 그 결과 도 9의 결과에 나타난 바와 같이, 동결건조 전과 후에 증폭된 DNA의 다형성이 동일하게 관찰되었으며 이로보아 PCR 프리믹스의 건조형 제품의 개발시 교차오염 방지를 위해 UDG를 첨가하는 것이 가능함을 확인하였다 (도 9). 실시예 6: 건조형 Pfu DNA증합효소를 포함한 PCR프리믹스 키트의 효능

Pfu DNA 중합효소는 중합과정 중 증폭된 DNA에 실수 발생 확률이 매우 낮아 주형의 유전체 염기서열과 동일한 유전자 단편이 증폭된다. 분자진단용 프리믹스는 질병의 검사뿐 아니라 인체를 비롯한 생물의 유전체 형의 판별에도 사용되며, 또한 증폭된 유전체의 염기서열을 결정할 때는 증폭과정 중에 변이가 일어나는 현상을 최소화 해야 한다. 따라서 Taq DNA 중합효소를 사용하는 것 보다 Pfu DNA 중합효소를 사용하는 것이 유리하다. PCR 프리믹스 키트의 건조형 기술을 Pfu DNA 중합효소를 사용한 프리믹스에도 적용하는 것이 가능한지를 조사하기 위해서 Pfu PCR 프리믹스의 건조 전과 후에 유전자 증폭효율을 조사하였다. 그 결과 동결건조 전의 액상형이나 동결건조 후의 건조형의 프리믹스를 사용하여 증폭된 유전자단편은 그 크기가 동일하였고 증폭량도 거의 동일한 것으로 확인되었다 (도 10). 따라서 트레할로스는 Pfu DNA 중합효소를 사용하는 프리믹스의 건조형 제품의 개발에도 활용이 가능한 것으로 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

동결건조된 다음의 성분을 포함하는 중합효소연쇄반웅용 동결건조 시약 조성물: (i) 중합효소연쇄반응 완층액， (ii) dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP), (iii) DNA 중합효소， (iv) 프라미어 (primer) 및 (v) 당 (sugar).

【청구항 2】

제 1 항에 있어서, 상기 당 (sugar)는 글루코스 (glucose), 자일로스 (xylose), 자일리틀 (xylitol), 수크로스 (sucrose)， 셀로비오스 (cellobiose), 말토트리오스 (maltotriose)， 만노스 (mannose) , 멜리비오스 (melibiose), 트레할로스 (trehalose) 및 스타키오스 (stachyose)로 이루어지는 군에서 선택된 당인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.

【청구항 3】

제 1 항에 있어서, 상기 당 (sugar)은 10-40 중량 %의 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 시약 조성물.

【청구항 4】

제 1 항에 있어서， 상기 DNA 중합효소는 DNA 의존성 DNA 중합효소 (DNA dependent DNA polymerase), NA 의존성 DNA 중합효소 (RNA dependent DNA polymerase), 또는 이들의 흔합물인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.

【청구항 5】

제 1 항에 있어서 , 상가 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.

【청구항 6】

제 1 항에 있어서， 상기 시약 조성물은 UDG (Uracil DNA

Gylcosylase) 및 dUTP를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물. 13

【청구항 7]

다음의 단계를 포함하는 중합효소연쇄반웅용 동결건조 시약 조성물의 제조방법：

(a) (i) 중합효소연쇄반웅 완층액， (ii) dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP), (iii) DNA 중합효소, (iv) 프라미어 (primer), (v) 당 (sugar) 및

(vi) 증류수가 포함된 중합효소연쇄반웅용 시약 조성물을 제조하는. 단계;

(b) 상기 제조한 시약 조성물을 동결건조시키는 단계.

【청구항 8】

제 7 항에 있어서, 상기 당은 글루코스， 자일로스, 자일리를， 수크로스， 셀로비오스， 말토트리오스, 만노스, 멜리비오스， 트레할로스 및 스타키오스로 이루어지는 군에서 선택된 당인 것을 특징으로 하는 방법.

【청구항 9】

제 7 항에 있어서, 상기 당은 10-40 중량 %의 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 10】

제 7 항에 있어서， 상기 DNA 중합효소는 DNA 의존성 DNA 중합효소 (DNA dependent DNA polymerase), RNA 의존성 DNA 중합효소 (RNA dependent DNA polymerase), 또는 이들의 흔합물인 것을 특징으로 하는 방법ᅳ

【청구항 11】

제 7 항에 있어서， 상기 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법 .

【청구항 12】

제 7 항에 있어서, 상기 시약 조성물은 UDG (Uracil DNA

Gylcosylase) 및 dUTP를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.