KR19980702110A - 핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물 - Google Patents

핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR19980702110A
KR19980702110A KR1019970705505A KR19970705505A KR19980702110A KR 19980702110 A KR19980702110 A KR 19980702110A KR 1019970705505 A KR1019970705505 A KR 1019970705505A KR 19970705505 A KR19970705505 A KR 19970705505A KR 19980702110 A KR19980702110 A KR 19980702110A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
activity
rna
composition
dna
nucleic acid
Prior art date
Application number
KR1019970705505A
Other languages
English (en)
Inventor
낸시 라우 리우 쉔
다니엘 루이스 캐시앙
제임스 가필드 푸트남
윌리암 마이클 데이비스
Original Assignee
다니엘 엘.캐시앙
젠-프로브 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다니엘 엘.캐시앙, 젠-프로브 인코포레이티드 filed Critical 다니엘 엘.캐시앙
Publication of KR19980702110A publication Critical patent/KR19980702110A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산 증폭에 사용하기 위한 안정화된 효소 조성물에 관한 것이다. 안정화된 단일 제제 중의 하나 이상의 효소의 안정화를 위한 조성물이 제공된다. 또다른 조성물은 재수화시에 사용하기 위한 단일 용기 중의 필요한 코팩터 및 효소 기질과 함께 안정화된 건조 효소 혼합물을 포함한다. 또한, 안정화된 효소 조성물의 제조 및 사용 방법 및 개시된 조성물을 포함하는 핵산 증폭용 키트도 제공된다.

Description

핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물
데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)은 공유결합된 뉴클레오티드 서브유닛으로 구성된 선형의 거대분자이다. DNA는 일반적으로 2개의 DNA 사슬이 평행의 반대 방향(antiparallel)으로 수소결합에 의해 결합된 이중 가닥 형태로 발견된다. RNA는 일반적으로 자연 상태에서 단일 폴리뉴클레오티드 사슬로 존재한다. 뉴클레오티드는 당 (데옥시리보스 또는 리보스) 및 질소성 염기 잔기를 갖는 분자이고, 일반적으로 포스포디에스테르 결합에 의해 핵산에서 서로 연결된다. 5개의 공통적인 질소성 염기가 존재한다. 아데닌 (A), 구아닌 (G) 및 시토신 (C)은 DNA 및 RNA 모두에서 발견된다. 다른 두 개는 티민 (T) 및 우라실 (U)로서 각각 DNA 및 RNA에 특이적이다.
모든 생물체의 유전 정보의 대부분 (전부는 아니지만)은 한 세대로부터 다음 세대로 DNA 또는 RNA의 형태로 전달된다. 이 정보는 유전 암호를 구성하는 단일 핵산 사슬 또는 가닥의 뉴클레오티드 서열로 전달된다. 또한, 핵산 가닥의 질소성 염기는 각각 동일하거나 상이한 핵산 가닥의 하나 이상의 다른 질소성 염기와 특이적으로 수소결합하는 능력을 갖는다. 따라서, 일반적인 조건 하에서 A는 T (또는 U)와 수소결합하고, C는 G와 수소결합하고, 이러한 특이적인 수소결합을 염기쌍이라로 부른다. 이중 가닥 DNA에서 2개의 가닥 각각은 뉴클레오티드의 대부분 또는 모두가 다른 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하는 뉴클레오티드 사슬로 구성된다. 이러한 경우에 하나의 DNA 가닥의 뉴클레오티드의 순서는 다른 DNA 가닥의 뉴클레오티드의 순서를 결정한다. 이러한 방식으로 서로 거울상인 2개의 핵산 가닥은 완전하게 상보성이라고 언급된다.
핵산은 각 핵산 가닥이 완전한 상보성 가닥의 뉴클레오티드 순서를 규정한다는 사실을 이용하는 메카니즘에 의해 체내에서 합성되고, 이것은 목적 핵산이 RNA 또는 DNA인지, 주형으로 사용되는 핵산이 RNA 또는 DNA인지의 여부와 관계없이 사실이다. DNA 복제의 특이적인 메카니즘의 대부분은 주형 핵산 가닥에 수소결합된 폴리뉴클레오티드 프라이머의 3' 히드록실기에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하는 DNA 폴리머라제의 사용을 수반한다. 새로 첨가되는 뉴클레오티드는 주형 가닥의 대응하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있는 능력을 토대로 하여 DNA 폴리머라제에 의해 선택된다. 프라이머의 한 말단에 뉴클레오티드를 첨가하는 상기 과정은 종종 프라이머 신장 (primer extension)으로 칭해진다.
DNA 합성과는 달리, RNA 합성은 정상적으로는 폴리뉴클레오티드 프라이머의 존재를 필요로 하지 않는다. 그 보다는, RNA 합성은 일반적으로 핵산 주형의 하나 이상의 특이 뉴클레오티드 서열을 인식하는 RNA 폴리머라제에 의해 매개된다. RNA 폴리머라제가 결합하는 주형의 영역, 즉 프로모터는 일반적으로 이중 가닥이다. 프로모터에 결합한 후 RNA 폴리머라제는 주형 가닥을 판독하여 주형에 상보성인 공유결합된 폴리리보뉴클레오티드 가닥을 합성한다. 상이한 종에서 유래한 RNA 폴리머라제는 상이한 프로모터 서열을 우선적으로 인식한다.
DNA 및 RNA 폴리머라제 효소는 많은 다양한 생물체에서 정제되었다. 이들 효소 중의 일부, 예를 들면 이. 콜리 (E. coli) DNA 폴리머라제 I, DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편, 및 상이한 RNA 폴리머라제는 일반적으로 시험관 내에서 분자 생물학 및 핵산 생화학 연구에서 도구로 사용된다. 문헌 참조 [예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. Cold Spring Harbor Press 1989)].
핵산 폴리머라제의 다른 용도는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)과 같은 다양한 핵산 증폭 방법의 출현과 함께 발생하였다 (예를 들면, Mullis 등의 미국 특허 제4683195호, 동 제4683202호 및 동 제4800159호 참조). 가장 간단한 형태의 PCR에서 각각 표적 뉴클레오티드 서열 영역의 3' 쪽에 위치한 표적 핵산의 영역에 상보성인 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 합성된다. 각각의 프라이머는 2개의 상보성 핵산 가닥의 하나에 상보성이고 표적 영역은 이중 가닥 표적 핵산의 2개의 핵산 가닥을 포함하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. 프라이머가 기질과 수소결합(혼성화)하도록 할 때 DNA 폴리머라제를 뉴클레오티드 트리포스페이트와 함께 반응 혼합물에 첨가하고 각각의 혼성화된 프라이머는 5'→3' 방향으로 효소에 의해 신장된다. 이어서, 반응 혼합물을 가열하여 프라이머 신장 생성물:주형 혼성체를 융해시키고 온도를 저하시켜 프라이머/표적 혼성화를 다시 실시하고 고온 단계에 의해 불활성화된 DNA 폴리머라제를 대체하기 위해 보다 많은 DNA 폴리머라제를 첨가하였다. 이 싸이클을 목적하는 횟수만큼 반복하여 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 양을 지수적으로 증가시켰다. 최근에는 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus)에서 유도된 열안정성 DNA 폴리머라제를 PCR 방법에 성공적으로 사용하여 고가의 효소를 다량 반복적으로 첨가할 필요를 완화시켰다. Taq 폴리머라제는 90 내지 95℃에서 불활성화에 내성을 갖기 때문에 각각의 라운드의 가닥 분리 후에 효소를 반복 첨가할 필요가 없다.
다른 핵산 증폭 방법, 예를 들면 증폭 방법의 한 단계로서 RNA 전사를 사용하는 방법이 고안되었다. 상기 방법 중의 하나는 프로모터 서열을 PCR 반응에 사용되는 프라이머 중의 하나에 포함시킨 후 PCR 방법에 의한 증폭 후에 이중 가닥 DNA를 DNA 지향 RNA 폴리머라제에 의한 단일 가닥 RNA의 전사를 위한 주형으로서 사용함으로써 기능한다 (예를 들면 Murakawa et al., DNA 7:287-295 (1988) 참조).
다른 증폭 방법은 DNA 또는 RNA 표적의 증폭을 위해 RNA 지향 DNA 합성 및 전사의 다수회 반복을 사용한다 (예를 들면 Burg et al., WO 89/1050, Gingeras et al., WO 88/10315 (때로는 전사 증폭계 또는 TAS로 불림), Kacian and Fultz, EPO 공고 번호 제EPO 408295호 (본 출원의 공동 소유권을 향유), Davey and Malek, EPO 출원번호 제88113948.9호, Malek et al. WO91/02818 참조). 이들 방법은 상보성 DNA 가닥 합성용 주형으로서 RNA 또는 DNA를 사용할 수 있는 역전사 효소 (RT)를 이용한다. 상기 방법 중 일부는 또한 필수 성분으로서 세포 RNAse H 활성을 이용한다. 대부분의 레트로바이러스 역전사효소, 예를 들면 몰로니 무린 백혈병 바이러스 (MMLV) 및 조류 골수성 백혈병 바이러스 (AMV)에 의해 코딩되는 효소는 RNA 지향 DNA 폴리머라제, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAase H 활성을 갖는다. RNAse H 활성은 RNA:DNA 혼성체 핵산 분자의 RNA 가닥을 선택적으로 분해하여 온도 싸이클의 필요없이 증폭 반응을 진행시킬 수 있다.
핵산 증폭은 다양한 세트 내의 유일 또는 특유한 핵산 세그먼트의 특이적 동정 및(또는) 증폭을 위한 도구로서 그 인기가 증가하고 있다. 따라서, 핵산 증폭은 식품 및 농작물 시험, 의학 진단, 인간 유전 시험 및 카운셀링, 고고학 및 범인 확인에 사용된다. 이들 방법은 모두 효소를 사용하기 때문에 다량의 고활성 효소의 생산, 처리, 수송 및 보관 방법이 핵산 증폭용 효소 및 키트의 제조, 마케팅 및 판매의 매우 중요한 이슈가 되어 왔다. 구체적으로는, 전사 기초 증폭을 사용하는 방법을 위해 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 활성 제제의 보관을 위한 시판가능한 방법 및 제제가 핵산 증폭용 키트의 성공적인 제조 및 마케팅에 필요하다.
역전사효소 및 RNA 폴리머라제 (및 분자 생물학 연구에 사용되는 많은 다른 효소)의 일반적인 안정화 방법은 50% (v/v) 글리세롤 및 환원제, 예를 들면 디티오트레이톨 (DTT) 또는 β-메르캅토에탄올 (βME)을 함유하는 용액 내에 각각의 효소의 액상 제제를 -20℃에서 보관하는 것이다. 이 방법은 활성을 거의 상실함이 없이 수개월 동안 효소의 활성을 유지시킨다. 이와 대조적으로, 효소를 실온 또는 4℃에서 보관할 경우에 효소 활성은 쉽게 상실된다. 상기 제제는 일반적으로 효소 제조자로부터 최종 사용자에게 전달될 때까지 드라이 아이스 중에 보관되고 30% 이상의 효소 활성이 효소 제제의 냉동 및 해동에 의해 상기 수송 동안에 일반적으로 상실된다. 이들 효소는 별개로 제제화되고 공급된다.
냉동의 필요성이 없는 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 보관 수송 방법은 냉동 수송 및(또는) 드라이 아이스, 습식 팩, 건식 팩 또는 스티로폼 수송 컨테이너와 같은 냉동 보관 방법의 필요성을 제거할 것이다. 이러한 방법은 또한 효소 활성의 보존 방법에 관련된 제조 비용이 불필요하기 때문에 보다 비용이 적게 소요될 것이다. 효소 제제가 보다 고온에 대한 제한된 노출을 이겨낼 수 있도록 하는 효소 보관 방법은 효소 제제가 수송 동안 적재 창고 또는 트럭에 위치할 때 발생할 수 있는 효소 활성의 상실을 제거할 것이다. 이러한 방법은 그 재현성이 높아야 할 것이다. 또한, 효소가 그 의도된 용도에 적합한 형태로 (예를 들면 필요한 코팩터 및 기질의 전부 또는 대부분을 포함하는 제제로) 단일 용기로 제공할 수 있는 경우에 이러한 제제는 그 제조가 보다 경제적이고 사용이 보다 편리할 것이다.
냉동-건조 (동결 건조)는 식품, 생물학적 멤브레인, 세포 전체 (예를 들면 American Society for Microbiology, Manual of Methods for General Bacteriology 210-217 (1981) 참조) 및 효소를 포함한 생물학적 거대분자의 보존에 사용되었다. 동결건조는 감압 하의 승화에 의해 냉동 시료로부터 물의 제거를 수반한다. 승화는 고체가 액체 단계를 거치지 않고 증발되는 과정이다.
동결건조의 이론적 특성은 복잡하다. 단백질과 같은 생물학적 물질이 수용액 중에 존재할 때 이 분자는 물 분자를 포함하는 수화 외각에 의해 둘러싸이고 이 수화 외각은 단백질을 안정화시키고 그의 활성 유지를 돕는다. 물이 제거될 때 정상적으로는 수화 외각에 의해 마스킹되는 단백질의 반응기가 서로 반응하도록 자유롭게 되어 새로운 필수적으로 비가역적인 결합을 형성한다. 이 결합은 단백질의 천연 형태를 변형시킬 수 있다. 또한, 새로운 소수성/친수성 상호작용이 물의 부재시에 발생하여 단백질의 형태를 변형시킬 수 있다. 많은 단백질의 3차원 형태는 생물학적인 활성을 부여하기 때문에 그 형태 변화는 건조시에 생물학적 활성을 변경시킬 수 있다. 동일한 메카니즘에 의해 단백질의 가교결합 및 응집이 발생할 수 있다.
건조 전의 단백질 시료의 냉동은 건조에 의한 형태 변화의 정도를 저하시키는 데 도움을 준다. 저하된 초기 온도는 반응물로부터 에너지를 박탈함으로써 아미노산 반응기 사이의 원치않는 반응을 최소로 유지시키는데 도움을 준다. 이와 동시에 냉동 상태에서 단백질은 용액 상태일 때보다 입체 자유도가 작고 전체적인 형태 변화의 경향이 적다.
그러나, 완전히 건조된 동결건조물은 여전히 소량의 물을 함유하는 불완전하게 건조된 동결건조물보다 저장 또는 보관 수명이 더 짧기 쉽다. 이러한 불완전하게 건조된 동결건조물은 종종 약 4 내지 10℃ 이하의 온도에서 보관하여야 하고 물이 존재하지 않으면 불가능한 화학 반응의 불활성화를 여전히 받을 수 있다. 따라서, 많은 불완전하게 건조된 생물학적으로 활성인 동결건조된 단백질의 저장 수명이 완전 건조된 단백질보다 더 길지만 활성을 유지하기 위해서는 여전히 제제를 냉동할 필요가 있다. 이러한 경우에도 상기 제제의 활성은 비교적 단기간에 걸쳐서 상실된다. 또한, 일부 효소, 예를 들면 포스포프럭토키나제는 제제의 완전 건조 여부에 관계없이 항냉동제의 부재시에 동결건조 후에 완전하게 불활성화된다 (예를 들면 Carpenter et al., Cryobiology 25:372-376 (1988) 참조).
본 명세서에서 사용되는 용어 항냉동제는 냉동, 건조 및(또는) 건조 물질의 복원 동안에 생물학적 활성 물질의 활성을 보호하는 화합물 또는 조성물을 의미한다.
용어 안정화제는 생물학적 활성 물질에 첨가될 때 이 물질이 안정화제 부재 상태로 보관하는 경우에 비해 시간 경과에 따른 물질의 생물학적 활성의 손실을 억제하거나 지연시키는 물질을 의미한다.
다양한 항냉동제가 사용되고 있거나 특정 단백질을 포함하여 생물학적 물질의 건조시에 생물학적 활성의 보존을 돕는 부형제로서의 용도가 제안되었다. 문헌 [Clegg et al., Cryobiology 19:106-316 (1982)]은 바다 새우인 아르테미아 (Artemia) 포낭의 건조 후에 계속 생존하는 능력에 있어서 글리세롤 및(또는) 트레할로스의 역할을 연구하였다. 문헌 [Carpenter et al., Cryobiology 24:455-464 (1987)]은 이당류 말토스, 수크로스, 락토스 및 트레할로스가 공기 건조되는 정제 효소 제제의 포스포프럭토키나제 활성의 안정화를 증가시키는 역할을 할 수 있음을 보고하였다. EPO 공개 번호 제0431882A2에는 유도체화된 후 만니톨 또는 락토스의 존재 하에 동결건조된 정제 알칼린 포스파타제의 안정화된 제제가 기재되어 있다. EPO 공개 번호 제0091258A2에는 인간 혈청 알부민, 젤라틴, 인간 γ 글로불린 또는 연어 프로타민 술페이트와 같은 안정화 단백질의 존재 하에 정제 단백질의 보관 또는 동결건조에 의한 종양 괴사 인자 (TNF)의 안정화 방법이 기재되어 있다. 미국 특허 제4451569호에는 정제 글루타티온 페록시다제의 활성을 안정화시키는 펜토스, 당 알콜 및 일부 이당류의 용도가 기재되어 있다. 안정화된 조성물은 동결건조된 후 20℃ 미만의 온도에서 보관될 수 있다. EPO 공개 번호 제0448146A1호에는 디카르복실산 염을 함유하는 안정화된 동결건조 고나도트로핀 제제가 기재되어 있다. 이 제제는 또한 수크로스 또는 트레할로스와 같은 이당류를 추가로 포함할 수 있다. 문헌 [Roser, Biopharm, 47-53 (1991년 9월)]에는 트레할로스를 사용하여 실온에서 건조된 다양한 생물학적 분자의 생물학적 활성을 보존하는 것이 기재되어 있다. PCT 출원 공개 제WO87/00196호는 트레할로스의 존재 하의 공기 건조에 의한 모노클로날 항체 및 송아지 장 알칼린 포스파타제의 안정화를 보고하였다. PCT 출원 공개 제WO89/00012호 및 동 제WO89/06542호에는 일부 식품 및 살아있는 바이러스 입자의 항원성을 보존하기 위한 트레할로스의 용도가 기재되어 있다. EPO 출원 공개 제02270799A1에는 세제 또는 글리세롤과 같은 안정화제를 함유하는 제제에서의 재조합 β-인터페론의 안정화가 기재되어 있다. 이 조성물은 수크로스 및 트레할로스를 포함한 다양한 당, 당 알콜 및 단백질을 추가의 안정화제로서 추가로 포함할 수 있고, 이중에서 덱스트로스가 가장 바람직하다.
이들 첨가제 중 일부는 필수적으로 탈수 형태로 실온에서 보관될 때 생물학적 활성 물질의 저장 수명을 수개월 이상 연장시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 특정 유망한 첨가제의 효용, 적합성 또는 우수성은 안정화되는 생물학적 활성 물질의 화학 조성에 따라 상이하고 단백질의 경우에 상기 인자에는 단백질의 아미노산 서열, 그의 2차, 3차 및 4차 구조가 포함되며 이에 제한되지 않는다. 따라서, 특정 조성물이 특정 생물학적 활성 물질의 생물학적 활성을 보존하는 기능을 할 것인지의 여부는 선천적으로 예측할 수 없다.
또한, 단백질이 동결건조되는 경우에 완충액 조성, 냉동 속도, 부의 압력의 양, 초기, 작동 및 최종 동결건조 온도 및 동결건조 과정의 기간을 포함하여 추가의 요인이 활성 단백질의 안정성 및 저장 수명의 결정에 중요하다.
일부 단백질은 다중 효소 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 레트로바이러스 역전사 효소, 예를 들면 몰로니 무린 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소 (MMLV-RT)는 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAase H 활성을 갖는다. 이러한 활성은 동일한 효소에 포함되지만 건조 제제 내의 이들 활성의 어느 하나의 보존 조건은 나머지 효소 활성 중의 하나 또는 두 개가 동일한 조건 하에 보존될 것이라는 것을 보장하지 않는다.
또한, Kacian Fultz의 상기 문헌 (본 출원의 공동 소유권을 향유하고 본 명세서에 참고로 포함됨)의 전사 기초 핵산 증폭 시스템에서와 같이 특정 용도로 사용하기 위해서는 역전사효소의 3개의 활성의 비교적 특이적인 활성의 균형이 복원 후에도 건조 전의 이들 활성의 균형과 계속 유사할 것을 요구할 경우 특정 보존 방법은 이들 효소 활성의 미묘한 균형을 혼란시켜 효소를 상기 특정 용도에 부적합하게 만들 수 있다. 따라서, 상기 효소의 RNAse H 활성이 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성보다 더 많이 보존되는 경우에 RNA:DNA 개시 복합체는 DNA 합성이 시작될 수 있기 전에 분해될 수 있다.
제공된 효소 활성의 장기간 보존에 효과적인 제공된 항냉동 조성물은 다른 효소 활성에 적용될 경우 분명하게 효과적이지 않거나 우수하지 않기 때문에 상이한 효소는 종종 활성 안정화를 위해 매우 상이한 보호제를 필요로 한다. 그 결과, 시판되는 동결건조 효소 제제 모두 또는 대부분은 하나의 특이 효소의 활성의 보존에 맞추어진 제제 중에 건조된 하나의 효소만을 함유한다.
발명의 요약
본 발명은 효소 활성을 실질적으로 상실하지 않고 장기간 동안 실온에서 보관할 수 있는 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 건조 제제를 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 제제는 레트로바이러스 역전사효소 및(또는) 박테리오파지 RNA 폴리머라제의 제제를 포함한다. 보다 바람직하게는, 제제는 항냉동 부형제 중의 몰로니 무린 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소 (MMLV-RT) 및 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명은 하나 이상의 항냉동 부형제 중의 MMLV-RT 및 T7 RNA 폴리머라제를 함유하는 건조 제제를 포함하는 단일 용기에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 MMLV-RT 및 T7 RNA 폴리머라제, 트레할로스 및 폴리비닐피롤리돈 (PAP)을 포함하는 하나 이상의 항냉동 부형제, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 상기 효소 활성에 필요한 금속 이온 및 코팩터를 함유하는 건조 제제를 포함하는 단일 용기에 관한 것으로 안정화된 동결건조물의 복원 및 표적 핵산 및 하나 이상의 적합한 프라이머의 첨가시에 상기 제제는 과도한 조작이 필요없어 핵산 증폭에 편리하고 저비용의 형태이다. 임의로, 상기 제제는 핵산 합성의 개시를 위한 프라이머를 함유할 수 있다. 마지막으로 본 발명은 상기 건조 제제의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
역전사효소 및 RNA 폴리머라제는 전사 매개 핵산 증폭법 (예를 들면 Burg et al., 상기 문헌, Gingeras et al., 상기 문헌 (종종 전사증폭 시스템 또는 TAS로 불림), Kacian and Fultz, 상기 문헌, Davey and Malek, EPO 출원 번호 제88113948.9호 및 Malek et al., PCT 출원 공개 제WO91/02818호에 기술된 방법)에서 중요한 물질이다. 이러한 방법은 법의학 및 의료 진단과 같은 분야에서 그 중요성이 증가하고 있고, 시간 경과에 따른 증폭시약의 안정성은 핵산 증폭을 사용하는 제품의 제조 비용, 마케팅 및 사용에 있어 중요한 고려대상이다.
본 출원인은 역전사효소의 DNA 지향 DNA 폴리머라제, RNA 지향 DNA 폴리머라제 및 RNAse H 활성의 보존 방법 및 그 건조 제제를 발견하였다. 동일한 방법 및 제제가 RNA 폴리머라제 활성의 보존에 적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 출원인은 놀랍게도 상기 2개의 효소 및 4개의 효소 활성 모두가 고온에서 장기간 인큐베이션한 후에도 상당한 시간에 걸쳐 4개의 활성 중 어느 것도 실질적으로 상실하지 않고 단일 용기 내의 건조 제제로서 안정화되어 보존될 수 있음을 발견하였다.
본 발명 방법의 한 특징은 정제된 활성 역전사효소에 비환원성 이당류 (바람직하게는 수크로스 또는 트레할로스) 또는 폴리비닐피롤리돈 (PAP), 또는 역전사효소 및 항냉동제 함유 용액의 동결건조와 같은 방법에 의한 효소의 건조 후에 역전사효소의 DNA 지향 DNA 폴리머라제, RNA 지향 DNA 폴리머라제 및 RNAse H 활성의 보호 및 보존제로서 작용하기에 효과적인 양의 상기 화합물의 혼합물을 포함하는 항냉동 부형제를 제공하는 것을 포함한다.
제2 특징에서 본 발명은 90일 이상 동안 실온에서 실질적으로 안정한 탈수 형태로 정제된 활성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제의 안정화 및 보존 방법을 제공한다. 이 특징에서 RNA 폴리머라제는 Mg++또는 Zn++을 함유하는 것과 같은 금속 염, 비환원성 이당류, 바람직하게는 트레할로스 및 폴리비닐피롤리돈 (PAP)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 보호 안정화제 및 n-아세틸-L-시스테인 (NALC)의 존재 하에 건조된다. 이론으로 성립되기를 바라는 것은 아니지만, 본 출원인은 환원제가 효소에 존재하는 임의의 시스테인 잔기의 산화를 통한 효소의 불활성화의 억제를 돕는 것으로 생각한다. 상기 특징에서 RNA 폴리머라제는 바람직하게는 탈수된 제제의 45℃에서 30일 이상 동안 또는 35℃에서 61일 이상 동안의 노출 후에 그의 본래 활성의 70% 이상을 보유한다.
또다른 특징에서 본 발명은 역전사효소 (바람직하게는 MMLV-RT), RNA 폴리머라제 (바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제), 건조된 효소 활성의 보존에 효과적인 양의 항냉동 부형제 (바람직하게는 트레할로스 및(또는) 폴리비닐피롤리돈), 뉴클레오티드 트리포스페이트, 필요한 코팩터, 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 환원제, 바람직하게는 티올 화합물의 혼합물을 포함하는 하나의 건조 제제를 특징으로 한다.
또다른 특징에서 본 발명은 예를 들면 하나의 과에 속하는 하나의 속 또는 하나 이상의 속 내의 하나 이상의 종의 특이적 검출을 위하여 유기체의 하나 이상의 계통발생적 그룹에 속하는 핵산의 증폭 및 특이적 동정을 위한 성분의 키트를 포함한다. 본 발명은 단일 용기에 역전사효소, RNA 폴리머라제, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 아연 및(또는) 마그네슘염 및 환원제를 포함하는 복원가능한 건조제제를 제공한다. 증폭 프라이머 및 복원 수용액은 키트의 하나 이상의 별개의 성분으로서 공급될 수 있다. 별법으로, 증폭 프라이머는 건조 제제 내에 포함될 수 있다. 표적 서열에 특이적인 핵산 혼성화 분석 프로브 및 임의의 목적하는 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 건조 제제 내에 포함되거나 별개의 시약으로 제공될 수 있다. 목적 제제의 복원 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 첨가 (이미 존재하지 않는 경우)시에 혼합물은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥 표적 핵산과 접촉한다. 표적 핵산이 프라이머(들) (또는 프로모터-프라이머(들)의 프라이머 부분)에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖는다면 반응은 핵산 증폭에 충분한 온도에서의 반응 혼합물의 인큐베이션시에 진행될 것이다.
또다른 특징에서 본 발명은 역전사효소 (바람직하게는 MMLV-RT), RNA 폴리머라제 (바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제), 항냉동 부형제, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 필요한 코팩터, 및 환원제, 바람직하게는 티올기를 갖는 화합물의 혼합물을 포함하는 하나의 동결건조물을 포함한다. 동결건조물은 냉동할 필요없이 수송 및 보관할 수 있고 승온에 일시적인 노출, 예를 들면 55℃에서 30일 동안 노출시켜도 효소 활성의 실질적인 감소없이 견딜 수 있다.
뉴클레오티드 트리포스페이트는 각각 RNA 폴리머라제 및 DNA 폴리머라제, 바람직하게는 역전사효소의 기질로서 작용할 수 있는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 그의 유도체를 의미한다. 이러한 유도체에는 질소성 염기 (일반적으로 아데닌, 티민 또는 우라실, 시토신 및 구아닌), 리보스 또는 데옥시리보스 잔기 또는 포스페이트 기에 혼입된 메틸 (또는 다른 알킬) 및(또는) 황기를 갖는 뉴클레오티드가 포함된다.
뉴클레오티드는 하나의 질소성 염기 (일반적으로 아데닌, 티민 또는 우라실, 시토신 및 구아닌), 당 잔기 (리보스 또는 데옥시리보스) 및 포스페이트기를 포함하는 핵산 서브유닛을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 이 용어는 문맥에 따라 비혼입된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 가닥의 공유결합된 뉴클레오티드 서브유닛을 모두 의미한다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학, 핵산 증폭 및 안정화된 생물학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 핵산 폴리머라제를 포함하는 안정한 동결건조 효소에 관한 것이다.
본 발명은 항냉동제 또는 안정화 벌킹제의 존재 하에 하나 이상의 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제를 함유하는 용액으로부터 용매를 제거함으로써 상기 효소의 활성을 안정화시키는 방법을 포함한다. 상기 항냉동제에는 사카라이드, 특히 비환원성 이당류, 및 효소와 수소결합할 수 있는 양전하 및(또는) 음전하기를 갖는 수용성 중합체가 포함된다. 특히 바람직한 항냉동제는 이당류 수크로스 및 트레할로스 및 중합체 폴리비닐피롤리돈 (PAP)이다.
또한, 본 발명은 건조 DNA 폴리머라제, 건조 RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제를 모두 함유하는 건조 혼합물을 포함하는 안정화된 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물을 구성하는 바람직한 효소는 역전사효소 및 박테리오파지 RNA 폴리머라제이고, 특히 바람직한 효소는 몰로니 무린 백혈병 바이러스의 레트로바이러스 역전사효소 및 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머라제이다.
본 발명의 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제의 바람직한 건조 방법은 동결건조에 의한 것이다. 이 방법에서 효소를 함유하는 용액은 동결되고 이 동결 효소 용액에 진공을 가하고 승화에 의해 제제로부터 용매를 제거하고 용질이 남는다.
또한, 본 발명은 DNA 폴리머라제 (바람직하게는 역전사효소), RNA 폴리머라제, 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 효소 활성에 필요한 코팩터의 건조 제제를 포함하는 하나 이상의 특정 핵산 서열의 복제를 위한 조성물을 특징으로 한다. 또한, 건조 제제는 표적 뉴클레오티드 서열의 특이적 복제를 위한 증폭 프라이머 및(또는) 혼성화 분석 프로브 및 헬퍼를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 건조 조성물은 동결건조에 의해 제조된다.
본 발명의 조성물은 고온에서 보관될 경우에도 오랜 기간 동안 안정하다. 따라서, 이러한 조성물은 상기 효소의 상업적 제제 및 상기 효소를 함유하는 핵산 증폭용 키트의 수송 및 보관에 유용하다.
실시예
실시예는 본 발명의 다양한 바람직한 실시형태를 예시하고자 제공되는 것으로서 어떤 방식으로든 본 발명의 내용을 제한하려는 것은 아니다. 실시형태의 기술은 본 발명이 언급하고자 하는 하나 이상의 목적의 달성에 보다 효과적인 본 발명의 다른 실시형태가 존재하지 않는다는 것을 나타내지는 않는다.
실시예 1: 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 동결건조
본 실시예 및 하기 실시예에 사용되는 역전사효소는 이. 콜리 균주 1200에서 발현되고 세포 페이스트에서 정제된 재조합 몰로니 무린 백혈병 바이러스 역전사효소 또는 미국 오하이오주 클리블랜드 소재의 United States Biochemicals에서 시판하는 정제된 MMLV-RT 제제이다. 효소 제제를 20-50 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1 M NaCl, 0.1 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 1.0 mM 디티오트레이톨 (DTT), 0.01% (v/v) TERGITOL NP(등록상표)-40 (TERGITOL NP(등록상표)는 Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.의 등록상표명임) 또는 0.1% (v/v) TRITON (등록상표) X-100 (TRITON(등록상표)는 Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.의 등록상표명임) 및 50% (v/v) 글리세롤을 함유하는 보관 완충액 중에서 -20℃에서 보관하였다. 정제 T7 RNA 폴리머라제는 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Epicentre Technologies의 제품이었다. 투석하기 전에 효소를 50% (v/v) 글리세롤, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl, 1.0 mM DTT, 0.1 mM EDTA 및 0.1% (v/v) TRITON X-100 중에 보관하였다. 또한, 이 효소를 투석 전에 -20℃에서 보관하였다.
3개의 효소 제제를 동결건조를 위한 제제 중에 투석시켰다. 제1 제제는 20 mM HEPES ([2-히드록시에틸] 피레라진-N'-[2-에탄술폰산]) (pH7.5), 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 2 mM NALC, 0.1 mM 황산아연, 0.2 M 트레할로스 및 물을 함유하는 완충액 중에 희석시킨 MMLV-RT 324,012 단위를 함유하였다. 최종 용량은 720 μl이었다. 이를 동일한 완충액 (트레할로스 완충액) 250 ml에 대하여 4℃에서 6시간 동안 투석하였다. 투석막은 2% (w/v) 중탄산나트륨 및 10 mM EDTA (pH8.0) 중에서, 이어서 10 mM EDTA (pH8.0) 중에서, 최종적으로 탈이온수 중에서 순으로 각각 10분 동안 비등시켜 제조하였다. 이어서, 막을 사용 전에 탈이온수로 철저하게 세척하였다. 투석 완충액을 동일 용량의 새로운 완충액으로 교환하여 추가로 10시간 동안 투석을 계속하였다. 완충액을 다시 교환하여 추가로 3시간 동안 계속하였다. 최종 용량은 655 μl이었다.
제2 제제는 720 μl 중에 T7 RNA 폴리머라제 144,000 단위를 함유하였다. 이를 트레할로스 완충액에 대하여 역전사효소 제제와 동일한 과정 및 용량으로 투석시켰다. 최종 용량은 1270 μl이었다.
제3 제제는 역전사효소 및 RNA 폴리머라제를 모두 포함하였고, 역전사효소 324,012 단위 및 RNA 폴리머라제 144,000 단위를 합하여 최종 용량 1440 μl로 만들었다. 이를 다른 2개의 제제와 동일한 과정으로 트레할로스 완충액 3배 용량에 대해 투석시켰다. 투석액의 최종 용량은 1975μl이었다.
투석 후에 각각의 제제를 바이알에 12개의 균등 분취액으로 분할하였다. 각각의 바이알은 역전사효소 27,000 단위, T7 RNA 폴리머라제 12,000 단위 또는 상기량의 효소 두 개 모두를 함유하였다. 바이알을 FCP-III 조절계를 갖는 프로그램 가능 Virtis 모델 동결건조기에 위치시켰다. 바이알을 약 5분 내에 -40℃로 냉각시켰다. 압력을 -180 토르까지 저하시켜 동결건조를 시작하고 동결건조 과정 전체에 걸쳐 진공을 일정하게 유지시켰다. 이어서, 온도를 향후 2시간 동안 -10℃까지 선형 방식으로 승온시킨 후 6시간 동안 상기 온도에서 유지시켰다. 이어서 온도를 1시간에 걸쳐서 10℃까지 선형으로 가온시키고 10℃에서 4시간 동안 유지시켰다. 다시, 온도를 30분에 걸쳐서 25℃까지 선형으로 가온시키고 25℃에서 10.5 시간 동안 유지시켰다. 이어서, 무수 질소를 가하여 압력을 대기압으로 복귀시키고 바이알을 질소 하에 밀봉하여 동결건조기로부터 꺼냈다. 이어서, 바이알을 25℃에서 22일 동안 보관하였다.
보관 후에 동결건조 효소 제제를 복원 완충액 (0.01% (v/v) TRITON X-100, 41.6 mM MgCl2, 1 mM ZnC2H3O2, 10% (v/v) 글리세롤, 0.3% (v/v) 에탄올, 0.02% (w/v) 메틸 파라벤 및 0.01% (w/v) 프로필 파라벤) 중에 복원시키고 그의 핵산 증폭 지지 능력을 분석하였다.
50 mM Tris-HCl (pH8.0), 17.5 mM, 2 mM 스페르미딘, 25 mM KCl, 각각 2 mM의 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP, 2.5 mM CTP 및 UTP, 6.5 mM ATP 및 GTP, 5 mM DTT, 박테리오파지 T7 유전자 10의 하나의 가닥의 영역에 상보성인 표적 결합 영역을 갖는 프로모터-프라이머 (서열 1) 675 μg (0.44 μl)/용액 ml , 박테리오파지 T7 유전자 10의 다른 가닥에 상보성인 표적 결합 영역을 갖는 프라이머 (서열 2) 451 μg (0.3 μl)/용액 ml, T7 유전자 10 표적 핵산 100 카피 및 물을 함유하는 총 용량 90 μl의 반응 혼합물을 제조하였다. T7 유전자 10 RNA 표적은 플라스미드 pGEMEX-1 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega Corporation)에서 유도된 플라스미드 유래 T7 유전자 10 제한 단편의 (+) 센스 전사체이었다. 이 정제 RNA 전사체는 0.61 피코몰/μl의 농도로 존재하였다. 표적 핵산의 100 카피를 각 튜브에 첨가하였다. 또한, 각 튜브를 광유 200 μl로 깔아분석 동안 시료의 증발을 억제하였다.
모든 튜브를 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 실온으로 냉각시킨 후 상기한 바와 같이 복원된 효소를 첨가하였다. 이 단계는 표적 핵산이 이중가닥 DNA가 아니라 RNA 또는 단일가닥 DNA인 경우에는 불필요하고 초기 가열 단계는 RNA 분자내 수소결합의 임의의 영역의 융해를 돕는다. 이어서, 별개로 동결건조된 효소 제제를 함유하는 실험 튜브에 T7 RNA 폴리머라제 400 단위 및 동결건조된 MMLV-RT 600 또는 900 단위를 함유하는 용액 10 μl를 첨가하였고, 동시 동결건조된 T7 RNA 폴리머라제 및 MMLV-RT는 각각 10 μl당 400 단위 및 900 단위의 농도로 존재하였다. 튜브를 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
문헌 [Arnold and Nelson, 미국 특허 제5283174호 (본 출원의 공동 소유권을 향유하고 본 명세서에 참고로 포함됨)]에 기재된 균질 보호 분석법을 사용하여 반응 동안에 생성된 증폭 핵산의 양을 측정하였고, 방사선 표지 프로브를 사용하는 것과 같은 다른 많은 분석 시스템 및 핵산 표적 검출 방법이 당업계에 사용될 수 있음을 당업계의 숙련가는 분명하게 알 것이다.
200 mM 숙신산리튬 (pH 5.2), 17% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 3 mM EDTA (에틸렌디아민 테트라아세트산) 및 3 mM EGTA ([에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)]-테트라아세트산)) 및 T7 유전자 10 RNA 전사체에 상보성인 아크리디늄 에스테르-표지 프로브 (서열 3)을 함유하는 혼성화 완충액 100 μl를 각 튜브에 첨가하여 증폭 반응을 종결시켰다. 튜브를 60℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 182 mM NaOH, 600 mM 붕산 및 1% (v/v) TRITON X-100 300 μl를 첨가하여 비혼성화 프로브에 결합된 아크리디늄 에스테르를 가수분해시키고 튜브를 60℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 0.4 N HNO3중의 1% (v/v) H2O2200 μl를 첨가하고 그 직후에 1M NaOH 200 μl를 첨가하여 용액을 알칼리화시켜 광도계로 잔류 화학발광을 측정하였다. 그 결과를 화학발광 표지에 의해 방출된 광자 수의 측정치인 상대 광단위 (RLU)로 기록하였다. 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
25℃에서 22일 동안 보관한 동결건조 효소와 비동결건조 효소의 비교
RNA 표적 음성 대조군
MMLV-RT 600 단위 및 T7 폴리머라제 400 단위 MMLV-RT 900 단위 및 T7 폴리머라제 400 단위 MMLV-RT 600 단위 및 T7 폴리머라제 400 단위 MMLV-RT 900 단위 및 T7 폴리머라제 400 단위
액상 MMLV-RT 및 액상 T7 RNA 폴리머라제 321329 428872 1868 5630
동결건조 MMLV-RT 및 액상 T7 RNA 폴리머라제 301253 463561 1681 1684
액상 MMLV-RT 및 동결건조 T7 RNA 폴리머라제 549204 343582 1366 1545
동결건조 MMLV-RT 및 동결건조 T7 RNA 폴리머라제 (별개로 동결건조됨) 415080 493779 1352 1374
동시에 동결건조된 MMLV-RT 및 T7 RNA 폴리머라제 677531(MMLV-RT 900 단위) 654359 1376 (MMLV-RT 900 단위) 1296
상기 결과는 동시에 동결건조된 MMLV-RT 및 T7 RNA 폴리머라제가 다른 효소의 액상 효소 제제와 혼합된 효소 제제를 갖거나 또는 두 개의 효소가 모두 비동결건조된 반응 혼합물에서보다 효과적으로 RNA 유전자 10 표적을 증폭시켰음을 나타낸다. 액상 효소와 비교시에 임의의 동결건조된 효소 제제의 증폭 촉매 능력은 크게 저하되지 않았다. 따라서, 상기 결과는 또한 각각의 효소를 트레할로스의 존재 하에 단독으로 또는 서로 함께 건조 상태로 보관시킴으로써 효과적으로 안정화시킬 수 있음을 입증한다. 상기 조건 하의 핵산 증폭은 역전사효소의 3가지 효소 활성 (RNA 지향 DNA 폴리머라제, DNA 지향 DNA 폴리머라제 및 RNAse H) 모두의 존재에 의존하기 때문에 분석은 상기 활성이 본 발명의 방법에 의해 효과적으로 안정화되고 핵산 증폭을 촉진할 수 있는 방식으로 공동작용하는 상태를 유지한다는 것을 효과적으로 나타낸다.
추가의 실험은 역전사효소를 유사한 조건 하에 트레할로스가 아닌 수크로스의 존재 하에 동결건조할 수 있고, 항냉동 안정화제로서 트레할로스가 수크로스보다 약간 더 우수하다는 것을 보여주었다 (실시예 6 참조).
b. 비이온계 세제의 존재 하의 역전사효소 및 T7 RNA 폴리머라제의 동결건조
동결건조 과정 동안에 단백질의 침전을 최소화시키면서 효소의 활성을 유지시키기 위해 비이온계 세제의 존재 하에 역전사효소 및 RNA 폴리머라제를 동시 투석시키고 동결건조시켰다. 투석 완충액 중의 0%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2% 및 0.5% TRITON X-102를 함유하는 6개의 투석 혼합물을 제조하였다. 투석 완충액은 20 mM HEPES, 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 5 mM NALC, 0.1 mM 아세트산아연 및 0.2 M 트레할로스를 포함하였다. 각 투석 혼합물의 최종 용량은 250 ml이었다. 각각의 투석액 587 μl에 대한 출발 용량을 위해 각각의 완충액 467 μl를 MMLV-RT 46 μl (2900 단위/μl) 및 T7 RNA 폴리머라제 74 μl (800 단위/μl)와 합하였다. 4℃에서 동용량의 완충액으로 3회 교체하면서 대응하는 완충액 60 ml에 대하여 시료를 투석시켰다. 3번째의 완충액 교체 후에 0%, 0.01% 및 0.05% TRITON X-102를 함유하는 시료에서 침전물이 관찰되었고 0.1%, 0.2% 또는 0.5% TRITON X-102를 함유하는 시료에서는 침전물이 관찰되지 않았다.
투석 후에 각 투석액의 용량을 측정하고 그에 따라서 계산된 효소 농도를 조절하였다. 각각 MMLV-RT 24,750 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 11,000 단위를 함유하는 4개의 바이알에 각각의 시료를 분할하였다. 상기한 바와 같이 동결건조를 실시하였다. 건조 후에 세제 함유 동결건조물의 발생은 TRITON X-102의 부재 하에 제조한 동결건조물과 식별할 수 있었다. 동결건조 후에 바이알을 4℃ 및 55℃에서 32일 동안 보관하였다.
비이온계 세제의 효소 활성에 대한 효과를 T7 유전자 10 증폭 시스템을 사용하여 증폭 분석으로 분석하였다. 각각의 동결건조된 효소 제제를 복원 완충액 중에서 재수화시키고 MMLV-RT 900 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 400 단위를 각각의 반응 혼합물 중에서 분석하였다. RNA 유전자 10 전사체 (반응당 100 카피)를 표적 핵산으로 사용하였다. 다른 표현이 없는 한 상기한 바와 같이 분석을 실시하였다. 그 결과를 RLU로 기록하였다.
세제 존재 하에 32일 동안 보관시의 동결건조 효소의 안정성
4℃에서 보관 55℃에서 보관
시료* RNA 표적 (이중체) 표적 부재 RNA 표적 (이중체) 표적 부재
A 1612901 1317601 1543
B 1151828 1146113 1700 791757 320417 1701
C 1286845 1219888 1544 1190527 905066 1690
D 1215264 1205790 1513 1251635 1388493 1513
E 1208586 1418260 1545 1245880 1052251 1591
* 시료 A = -20℃에서 보관한 비동결건조 효소시료 B = 0% TRITON X-102 중의 동결건조 효소시료 C = 0.1% TRITON X-102 중의 동결건조 효소시료 D = 0.2% TRITON X-102 중의 동결건조 효소시료 E = 0.5% TRITON X-102 중의 동결건조 효소
상기 결과는 TRITON X-102와 같은 비이온계 세제가 MMLV-RT 또는 T7 RNA 폴리머라제의 투석 후에 단백질 침전물의 형성을 효과적으로 억제할 수 있음을 입증한다. 또한, 상기 결과는 TRITON X-102는 표적 핵산의 증폭에 유해한 효과를 주지 않고 오히려 동결건조 효소가 승온에서 보관할 때 시간 경과에 따라 효소 활성을 보다 양호하게 안정화시키는 작용을 할 수 있다는 것을 보여준다. TRITON X-102는 상기 분석에서 배경 발광의 증가를 야기하지 않았다. 또한, 상기 결과는 세제 부재시에 동결건조된 시료 (시료 B)의 경우에도 비동결건조 효소와 거의 동일한 활성을 갖는 상태를 유지함을 입증한다. 상기 결과는 추가로 동결건조 효소 제제가 장기간 승온에서 보관될 때 동결건조 효소 제제는 활성의 검출가능한 감소를 보이지 않음을 나타낸다.
상기 결과는 상기한 바와 같이 효소 활성에 대해 유해한 효과를 주지 않으면서 동결건조 동안 건조된 단백질을 가용 상태로 유지하는 BRIJ계, TWEEN계의 세제, TRITON계 및 TERGITOL계의 다른 세제와 같은 (이에 제한되지 않음) 기타 비이온계 세제의 능력을 용이하게 스크리닝할 수 있음을 제시한다는 것을 당업계의 숙련가는 분명하게 알 것이다.
실시예 2: 증폭시약과 함께 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 동시 동결건조
몰로니 무린 백혈병 바이러스 역전사효소 및 T7 RNA 폴리머라제 효소 제제를 건조 전에 50 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.1 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% (v/v) NP(등록상표)-40 또는 0.1% (v/v) TRITON (등록상표) X-100 및 50% (v/v) 글리세롤을 함유하는 보관 완충액 중에서 -20℃에서 유지시켰다.
동결건조를 위한 제조에서 MMLV-RT 3 x 106단위 및 T7 폴리머라제 1.3 x 106단위 (각각의 제제 2.5 ml)를 합하여 분자량 컷오프가 12,000 달톤인 투석막을 사용하여 20 mM HEPES (pH7.5), 5 mM NALC, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM 아세트산아연, 0.2% (v/v) TRITON X-102 및 0.2 M 트레할로스를 포함하는 50용량 이상의 완충액에 대해서 투석하되, 8시간마다 동용량의 완충액을 3회 교환하여 투석시켰다.
투석된 효소 제제 30 ml을, 10.0 mM 스페르미딘, 250 mM 이미다졸/150 mM 글루탐산 (pH6.8), 99 mM NALC, 12.5% (w/v) PAP, 각각 12.5 mM의 rCTP 및 rUTP, 각각 31.2 mM의 rATP 및 rGTP 및 각각 10.0 mM의 dCTP, dGTP, dATP 및 dTTP를 함유하는 증폭시약 60 ml과 혼합하였다 (용량비 6:2). 추가의 실험은 상기 시약을 7:1의 용량비 (증폭시약 대 효소 제제)로 혼합하여 크게 상이하지 않은 결과를 얻을 수 있음을 보여주었다. 이론적으로는, 투석된 효소 제제 및 증폭시약을 동일한 비율로 혼합할 수 있으며 증폭시약 대 효소의 적합한 비율은 당업계의 숙련가에 의해 충분히 결정될 수 있다.
동결건조 전의 혼합된 효소:증폭시약 제제의 최종 조성은 MMLV-RT 2.7 x 106단위 및 T7 폴리머라제 1.2 x 106단위, 5.0 mM HEPES (pH6.8 내지 7.0), 0.025 mM EDTA, 0.025 mM 아세트산아연, 10.0 mM 스페르미딘, 187.5 mM 이미다졸, 112.5 mM 글루탐산, 75.6 mM NALC, 0.05% (v/v) TRITON X-102, 9.4% (w/v) PAP (평균 MW 40,000 달톤), 0.05 M 트레할로스, 각각 9.4 mM의 rCTP 및 rUTP, 각각 23.4 mM의 rATP 및 rGTP 및 각각 7.5 mM의 dCTP, dGTP, dATP 및 dTTP이었다.
혼합된 효소:증폭시약 제제 (이하 효소:증폭시약으로 표시) 800 μl를 동결건조를 위해 각각의 유리 바이알에 위치시켰다 (바이알당 총 효소 약 39,000 단위). 실시예 1과 같이 동결건조를 실시하였다. 동결건조 후에 바이알을 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 처리하였다.
실시예 3: 동결건조된 시약의 증폭 활성 분석
역전사효소, RNA 폴리머라제 및 증폭시약의 새로운 동결건조 제제를 3 내지 61일의 상이한 시간 동안 25℃, 35℃ 및 45℃에서 인큐베이션하였다. 모든 바이알을 동일한 제제로부터 동일하게 제조하였다. 나타낸 시점에서 동결건조된 시약을 함유하는 바이알을 승온에서 제거하여 -30℃에서 보관한 후 최종 시료를 수거하였다. 각각의 온도에 대해 0 시간을 나타내는 시료를 전체 실험 기간 동안 -30℃에서 보관하였다.
최종 시점으로부터 바이알을 수거할 때 모든 시료를 복원 시약 (0.01% (v/v) TRITON X-102, 41.6 mM MgCl2, 1 mM ZnC2H3O2, 10% (v/v) 글리세롤, 0.3% (v/v) 에탄올, 0.02% (w/v) 메틸 파라벤 및 0.01% (w/v) 프로필 파라벤) 중에 재수화시키고 각각의 바이알의 내용물의 핵산 증폭 능력을 분석하였다.
모델 증폭 시스템에서의 활성을 본 실시예에서 하기 방법으로 측정하였다. 각각의 증폭 반응 혼합물은 표적 핵산으로서 간염 B 바이러스 게놈의 일부를 함유하는 플라스미드 (간염 B 바이러스 게놈의 2.6 kb 단편을 함유하는 PUC 플라스미드)의 이중가닥 DNA 제한 단편 500 카피를 함유하였다. 표적 DNA를 물 또는 인간 혈청 20 μl 중에 희석하였다. 음성 대조군을 표적 DNA 없이 동일한 방식으로 제조하였다. 이를 2배의 프라이머 용액 20 μl에 첨가하였으며, 상기 용액의 최종 조성은 총용량 40 μl 중의 0.1 N KOH, 17.5 mM EGTA, 25 mM 이미다졸, 25 mM 글루탐산, 0.025% (w/v) 페놀 레드 및 각각 0.3 μM의 2개의 프라이머이었다. 제1 프라이머 ((-) 센스)는 DNA 표적의 (+) 센스 가닥에 상보성인 3' 표적 결합 뉴클레오티드 서열 영역으로 구성되고 5' 비상보성 영역은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5' 비상보성 영역의 하류에 위치하였다. 제2 프라이머 ((+) 센스)는 다른 ((-) 센스) DNA 가닥에 상보성인 표적 결합 영역으로 구성된 뉴클레오티드 서열을 가졌다.
각각의 반응 혼합물 40 μl를 약 95℃에서 인큐베이션하여 이중 가닥 DNA 표적을 단일가닥으로 변성시켰다. 이어서, 반응물을 5분 동안 실온으로 냉각시키고 330 mM 이미다졸 및 200 mM 글루탐산을 함유하는 완충액 10 μl로 중화시켰다. 표적 핵산이 DNA가 아니라 RNA인 경우에 상기 변성 단계는 불필요할 것이다.
각각의 복원된 효소:증폭시약 50 μl를 변성되고 중화된 DNA 반응 혼합물에 첨가한 후 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. RNAse 부재 DNAse I 20 μl (40 단위)를 첨가하여 각각의 반응을 종결시켰다.
각각의 복원된 효소:증폭시약의 상대적인 증폭도를 문헌 [Arnold Nelson, 미국 특허 제5283174]에 기재된 균질 보호 분석법 (HPA)을 사용하여 측정하였고, 이러한 측정은 방사선 표지와 같은 다른 검출 수단을 사용하는 다른 분석 방법을 사용하여 실시할 수 있음을 당업계의 숙련가는 이해할 것이다. 각각의 증폭 반응물에 증폭되는 RNA 앰플리콘에 상보성이도록 고안된 약 75 fmol의 아크리디늄 에스테르 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 ((+) 센스)를 함유하는 10 Mm 리튬 숙시네이트 (pH 5.0), 2% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 1 mM 메르캅토에탄술폰산, 0.3% (w/v) PAP-40, 230 mM LiOH, 1.2 M LiCl, 20 mM EGTA, 20 mM EDTA, 100 mM 숙신산 (pH 4.7) 및 15 mM 2,2'-디피리딜 디술피드의 용액 100 μl를 첨가하였다. 각각의 튜브를 혼합하고 60℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후 냉각시켰다. 각각의 반응 혼합물에 0.6 M 붕산나트륨 (pH 8.5), 1% (v/v) TRITON X-100 및 182 mM NaOH를 함유하는 용액 300 μl를 첨가하고 60℃에서 6분 동안 인큐베이션하여 혼성화된 프로브에 결합하지 않은 표지를 파괴하였다.
반응 혼합물을 5분 동안 냉각시키고 잔류 화학 발광을 0.1% (v/v) 과산화수소 200 μl, 0.1 mM 아질산의 자동주입 및 그 직후의 1.0 N 수산화나트륨을 주입한 후에 광도계 (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 젠프로브 인코포레이티드사의 LEADER (등록상표))를 사용하여 측정하였다. 이어서 방출되는 광의 양을 상대 광단위 (RLU)로 나타내었다. 상기 조건 하에 광 방출의 배경 수준은 약 2000 내지 4000 RLU이었다.
그 결과를 기록하여 각각의 보관 온도 (25℃, 35℃ 및 45℃)에 대해 하기 표에 나타내었다. 각 시료를 3회 분석하여 평균하였다. 이 평균치를 사용하여 데이터를 각 온도에 대하여 그래프로 나타내었다. 도 1은 표 3에, 도 2는 표 4에, 도 3은 표 5에 대응한다.
동결건조된 효소:증폭시약의 보관 온도 25℃에서의 안정성
보관 일수 0 11 16 20 30 40 61
DNA 표적 부재시의 시약 (RLU) 2053 1911 1524 2188 1851 1548 1972
2130 1590 1561 1990 1847 1726 1655
2148 1752 2037 1606 1923 2382 1538
평균 RLU 2110 1751 1707 1928 1874 1885 1722
DNA 표적 존재시의 시약 (RLU) 1562029 2105440 1248988 2129935 1927067 1417883 1486111
1756224 1903081 1509929 2363198 1422699 1601071 1290950
1070164 1492458 1944566 1922529 1274124 1889588 1210344
평균 RLU 1462806 1833659 1567828 2138554 1541297 1636181 1329135
DNA 표적 부재시의 인간 혈청 내의 시약 (RLU) 8437 2904 2660 3044 2919 2465 2946
3902 2893 2993 3152 2971 3089 3473
3534 3003 2768 2951 2379 2958 3686
평균 RLU 5291 2933 2807 3049 2756 2837 3368
DNA 표적 존재시의 인간 혈청 내의 시약 (RLU) 1955525 2282336 2282171 1760428 2034705 1936366 1643624
2255411 2204415 1860043 1992765 2101999 1770109 1762360
2282281 2206778 1903519 2093235 2064041 1811820 1622750
평균 RLU 2164406 2231176 2015244 1948809 2066915 1839432 1676245
동결건조된 효소:증폭시약의 보관 온도 35℃에서의 안정성
보관 일수 0 3 9 16 21 50 61
DNA 표적 부재시의 시약 (RLU) 2429 17989 1768 1878 2378 1430 1559
2203 1775 1649 1919 2330 1411 1566
1996 1891 1840 2043 1995 1338 1692
평균 RLU 2209 7218 1752 1947 2234 1393 1606
DNA 표적 존재시의 시약 (RLU) 1173260 2310573 2186899 1559681 1876363 1458120 1366068
1580018 2136598 2119044 1385165 1919833 1932847 1443874
1389614 2303010 1568334 1632416 1979406 1343433 1421081
평균 RLU 1380964 2251060 1958092 1525754 1925201 1578133 1410341
DNA 표적 부재시의 인간 혈청 내의 시약 (RLU) 4819 3298 3608 3575 2912 3074 3836
4779 9577 3200 3535 3422 3044 4160
24541 3349 3114 3712 3151 3027 3901
평균 RLU 11380 5408 3307 3607 3162 3048 3966
DNA 표적 존재시의 인간 혈청 내의 시약 (RLU) 1946881 2228745 2233566 2087936 1984355 2255784 1873070
2158003 2289829 2303812 2163922 2192597 2147927 1789954
2110796 2286956 2179206 2152655 2121658 2087549 2049762
평균 RLU 2071893 2268510 2238861 2134838 2099537 2163753 1904262
동결건조된 효소:증폭시약의 보관 온도 45℃에서의 안정성
보관 일수 0 6 11 16 33
DNA 표적 부재시의 시약 (RLU) 2508 1613 1687 2626 1594
2250 1872 1781 2027 1596
2159 1903 2206 2056 1661
평균 RLU 2306 1796 1891 2236 1617
DNA 표적 존재시의 시약 (RLU) 1431296 1097084 975001 1320113 1017853
1329706 949892 758705 939417 1368153
1288191 798877 1242188 972442 1015174
평균 RLU 1349731 948618 991965 1077324 1133727
DNA 표적 부재시의 인간 혈청 내의 시약 (RLU) 3554 3375 3011 3068 3183
3109 4452 3119 3559 3115
4239 2960 3382 3381 2826
평균 RLU 3634 3596 3171 3336 3041
DNA 표적 존재시의 인간 혈청 내의 시약 (RLU) 1663770 1850263 1691590 1691372 1615426
1677985 1868747 1684565 1709387 1913706
1747637 2016609 1646303 1765393 1799445
평균 RLU 1696464 1911873 1674153 1722051 1776192
상기 데이터는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 동시 동결건조된 효소:증폭시약이 사용되는 전사 매개 증폭 방법에 따른 핵산 증폭의 달성에 필요한 4개의 효소 활성 (RNA 지향 DNA 폴리머라제, DNA 지향 DNA 폴리머라제, RNAse H 및 RNA 폴리머라제)을 모두 보유함을 보여준다. 추가로, 상기 데이터는 시약이 역전사효소 및 RNA 폴리머라제와 동시에 동결건조될 때 뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 증폭시약의 임의의 다른 성분에 대한 현저하게 유해한 효과가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다.
또한, 상기 결과는 증폭 반응을 인간 혈청과 같은 복잡한 생물학적 시료의 존재 하에 실시할 경우에 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 효소 활성이 크게 억제되지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, 동결건조된 증폭시약은 임상 진단물에서 수득되는 것과 같은 시료와 함께 사용하기 적합한 것으로 보인다.
상기 데이터는 많은 방식으로 해석할 수 있다. 보다 유용한 해석 방법 중의 하나는 실제 시험 시간보다 훨씬 오랜 시간에 걸쳐서 조성물의 안정성을 예 측하는 아레니우스 (Arrhenius) 식의 형태를 이용한다. 아레니우스식은 화학 반응 속도 및 온도의 함수로서의 상이한 비내열성 화합물의 안정성을 예측하기 위해 당업계의 숙련가가 일반적으로 사용한다.
본 명세서에서 이용하는 바와 같이, 아레니우스식은 활성 효소 또는 시약이 제시된 온도에서 단일의 불활성화 속도를 갖고 모든 시험 온도에서 단일의 불활성화 메카니즘을 갖는 효소 (또는 시약) 불활성화의 1차 반응을 가정한다. 출원인이 사용한 식은 다음과 같다.
ln(k2/k1) = (-Ea/R)((T2-T1)/(T2x T1))
상기 식에서, k2는 실험 온도(。K)에서의 속도 상수이고, k1은 비교 온도에서의 반응에 대한 속도 상수이고, Ea는 반응의 활성화 에너지이고, R은 기체 상수 (1.987 cal/。K·mole)이고, T1은 비교 온도 (예를 들면 298.16。K (25℃))이고, T2는 실험 온도 (。K로 표시)이다.
Ea를 15,000 cal/mole으로 가정하고 비교 온도 및 실험 온도를 안다면 속도 상수의 비 (k2/k1)를 결정할 수 있다. 비교 온도 및 실험 온도가 모두 25℃인 간단한 경우에 이들 상수의 비는 상수가 동일하기 때문에 1이다. 실험 온도가 35℃이고 비교 온도가 25℃인 경우에 이들 상수의 비는 2.27로 예상된다. 실험 온도가 45℃이고 비교 온도가 25℃인 경우에 상수의 비는 4.91로 예상된다. 동일한 식을 사용하여 비교 온도가 5℃이고 실험 온도가 45℃인 경우에 상수의 비는 30.33이다.
속도 상수의 비는 실험 보관 시간 대 정상 보관 시간의 분해 비율로 간주할 수 있고 상기 시간은 시, 일, 주 등으로 표현된다. 따라서, 동결건조 효소/증폭시약이 45℃에서 30일 내에 그의 본래 효능의 90%까지 분해되는 경우에 아레니우스식을 사용하면 활성이 상기와 유사하게 감소하기 위해서는 25℃에서 147.3 (30 x 4.91)일이 소요될 것으로 예상된다.
따라서, 상기 데이터는 동결건조 제제의 혼합 성분이 45℃에서 30일이 경과한 후에도 실시간에서의 증폭을 지지하는 능력을 크게 상실하지 않음을 입증한다. 또한, 아레니우스식을 이용함으로써 동일한 데이터를 통하여 동결건조 시약이 사용 전에 25℃에서 거의 5개월 동안 또는 5℃에서 2.5년 (30.33 x 30일) 동안 실제로 보관되는 경우에도 시약이 그 활성을 크게 상실하지 않을 것이라는 것을 예측할 수 있다.
본 출원인은 본 발명의 이해를 돕기 위한 수단으로서 상기 데이터 분석 방법을 제시한 것으로서 이론적 연구에 의해 제한되거나 지지되기를 바라는 것은 아니다. 본 발명의 조성물의 실제 안정성은 아레니우스식의 예상과 다를 수 있으며, 이는 동결건조 시약의 안정성을 예측하는 일반적인 지침을 제공하는 것이다.
실시예 4: 동결건조 시약의 T7 RNA 폴리머라제 분석
실시예 2에서 제조한 동결건조 효소:증폭시약을 0, 3, 9, 16, 21 및 30일 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 상기 각각의 시점에서 바이알을 스트레스 온도에서 제거하여 -30℃에서 보관한 후 최종 시료를 수거하였다.
동결건조 시약의 각각의 분취액을 복원 완충액 (0.01% (v/v) TRITON X-100, 41.6 mM MgCl2, 1 mM ZnC2H3O2, 10% (v/v) 글리세롤, 0.3% (v/v) 에탄올, 0.02% (w/v) 메틸 파라벤 및 0.01% (w/v) 프로필 파라벤) 1.5 ml 중에 복원시켜 RNA 폴리머라제 활성을 측정하였다. 이어서, 시약을 20 mM HEPES (pH7.5), 5 mM NALC, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM ZnC2H3O2, 0.1 mM NaCl 및 0.2% (v/v) TRITON X-102를 함유하는 용액 중에 100배, 200배 및 400배 희석하였다. 22 mM MgCl2, 각각 7.8 mM의 ATP 및 GTP, 각각 2.5 mM의 CTP 및 UTP, 62.5 mM Tris (pH7.5), 2.5 mM 스페르미딘 및 표적 핵산 0.5 nmol을 함유하는 반응 예비 혼합물을 별도로 제조하였다. 표적은 박테리오파지 T7 유전자 10의 바로 상류에 위치하는 T7 프로모터를 갖는 선형 pUC T7G10 플라스미드이었다. 이 플라스미드는 플라스미드 pGEMEX-1 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega Corporation)로부터 유도되었다.
반응 예비 혼합물을 40 μl의 분취액으로 분할하여 각각의 분취액을 37℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 효소:증폭시약의 각각의 희석액 10 μl를 가온된 예비 혼합물 튜브에 첨가하여 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 전사 생성물에 상보성이도록 고안된 약 75 fmol의 아크리디늄 에스테르 표지된 유전자 10 올리고뉴클레오티드 프로브 ((-) 센스)를 함유하는 10 Mm 리튬 숙시네이트, 2% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 1 mM 메르캅토에탄술폰산, 0.3% (w/v) PAP-40, 230 mM LiOH, 1.2 M LiCl, 20 mM EGTA, 20 mM EDTA, 100 mM 숙신산 (pH 4.7) 및 15 mM 2,2'-디피리딜 디술피드의 용액 50 μl를 각 튜브에 첨가하였다. 실험 반응 혼합물에 생성된 RNA의 양을 정량하기 위해 유전자 10 프로브에 상보성인 단일가닥 DNA 10 fmol을 함유하는 표준 시료를 HPA 단계에서 포함시켰다. 혼성화 용량을 1/2로 한 것을 제외하고는 필수적으로 실시예 2와 동일하게 혼성화를 실시하였다. 혼성화되지 않은 표지를 분해한 후에 잔류 아크리디늄 에스테르를 반응시키고 방출된 광을 RLU로서 광도계로 측정하였다.
조 데이터를 다음과 같이 μl당 RNA 폴리머라제 활성의 단위로 전환시켰다. 양성 대조군 반응에서 얻은 조 RLU를 음성 대조군 (표적 RNA 부재)에서 얻은 RLU에서 뺐다. 이 수치는 RNA 10 fmol이 시료에 존재할 때 얻는 순수한 양의 방출된 광을 나타내고 RLU/fmol (RNA)로 표현할 수 있다. 이와 유사하게, 각각의 시료에서 구한 RLU를 배경 발광 (RLU/20분)에서 뺄 수 있다. 이 수치를 표준으로 구한 수치 (RLU/fmol (RNA))로 나누면 20분당 각각의 반응에서 생성된 RNA fmol 수치를 구할 수 있다. 1단위의 RNA 폴리머라제 활성은 분석 조건 하에서 20분 내에 RNA 1 fmol의 생성으로 정의되었기 때문에 상기 수치는 또한 처음 첨가된 효소의 각각 10 μl 용량 내의 RNA 폴리머라제 활성 단위의 수치이다.
상기 반응으로부터 얻은 데이터는 35℃에서의 각각의 보관 시간에 대해 생성된 RNA fmol을 각 실험 튜브에 제공된 처음 1.5 ml에 복원된 효소:증폭시약의 μl 수치의 함수로서 표현함으로써 그래프로 나타내었다. 간단한 선형 함수를 설명한다. 데이터를 그래프로 나타낼 때 각 시점에서 구한 데이터에 대한 최적 라인을 계산하고 이 곡선의 경사를 μl당 T7 폴리머라제 활성의 단위로 표현하였다. 0시간 시점을 100% 활성으로 간주할 경우 각각의 나머지 시점에 대한 T7 RNA 폴리머라제의 단위 계산치는 활성 잔류율로서 표현하였다.
도 4는 35℃에서의 보관 일수의 함수로서 동결건조된 효소:증폭시약의 μl당 T7 RNA 폴리머라제의 단위 수치를 나타낸 그래프이다. 그 결과는 T7 RNA 폴리머라제가 35℃에서의 30일 동안의 인큐베이션 기간에 걸쳐서 거의 감소하지 않았음을 나타낸다.
실시예 5: 동결건조된 시약의 역전사효소 분석
35℃에서 3, 9, 16, 21 및 30일 동안 인큐베이션한 동결건조 MMLV-RT의 활성을 다음과 같이 분석하였다. 상기 시점에서 각각의 바이알을 스트레스 온도에서 제거하여 -30℃에서 보관한 후 최종 시료를 수거하였다.
각 바이알을 복원 완충액 1.5 ml 중에 복원시키고 실시예 4와 같이 100배, 200배 및 400배 희석하였다. 5 mM MgCl2, 30 mM KCl, 각각 0.25 mM의 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP, 62.5 mM Tris (pH7.5), 2.5 mM 스페르미딘, 3.75 nM 표적 RNA 및 750 nM 증폭 프라이머를 함유하는 별개의 역전사효소 예비 혼합물을 제조하였다. 표적 RNA는 실시예 4에서 생성된 T7 유전자 10 RNA 전사체이었다. 프라이머는 표적 RNA의 3' 말단 부근의 영역에 혼성화하도록 고안된 길이 22염기의 올리고뉴클레오티드이었다. 효소 희석액 10 μl를 얼음 상의 반응 예비 혼합물 40 μl에 각각 첨가하였다. 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 반응을 실시하였다. 아크리디늄 에스테르 표지된 혼성화 프로브 50 μl를 첨가하여 각각의 반응을 종결시켰다. 프로브는 새로 합성되는 유전자 10 cDNA에 상보성이 되도록 고안되었다.
실시예 3에서 기술한 바와 같이 HPA에 의한 검출을 실시하였다. 그 결과를 RLU로서 측정하였다.
상기 분석은 MMLV-RT의 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAse H 활성을 측정하였다. 유전자 10 프라이머의 신장에 의해 생성된 RNA:DNA 혼성체의 RNA 가닥이 분해되지 않으면 프로브는 cDNA에 혼성화할 수 없기 때문에 RNAse H 활성은 간접적으로 측정하였다.
상기 혼합 효소 활성의 1 단위를 상기 반응 조건 하에 15분 내에 cDNA 1 fmol의 검출로서 정의하였다. 각 시점에서 잔류하는 효소 활성의 단위의 계산 및 희석을, 증폭된 cDNA 10 fmol을 표준물질로서 사용하여 실시예 4에서와 같이 실시하였다.
도 5는 35℃에서의 보관 일수의 함수로서 동결건조된 효소:증폭시약의 μl당 RT 활성의 단위 수치를 나타낸 그래프이다. 그 결과는 RT 활성이 35℃에서의 30일 동안의 인큐베이션 기간에 걸쳐서 거의 감소하지 않았음을 나타낸다.
실시예 6: 뉴클레오티드 및 프라이머와 함께 역전사효소 및 RNA 폴리머라제의 동시 동결건조
선행 실시예는 핵산 증폭에 필요한 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 코팩터와 함께 RNA 폴리머라제 및 역전사효소의 건조 제제를 함유하는 단일 시약의 제조 및 사용을 예시하였다. 상기 단일 바이알 시약의 승온에서 연장 기간 보관 후에 핵산을 증폭할 수 있는 능력을 고려하면 상기 시약을 사용하는 방법의 단계의 수를 감소시키고 핵산 증폭용 키트의 내용물의 수를 3 (예를 들면, 동결건조 효소:증폭시약, 프라이머 및 복원 시약)에서 2 (예를 들면, 동결건조 효소/프라이머/증폭시약 및 복원 시약)로 감소시키기 위해 동결건조 제제에 증폭 프라이머를 용이하게 포함시킬 수 있음을 당업계의 숙련가는 분명하게 알 것이다.
상기 제제는 초기 표적 핵산이 RNA이고 증폭 방법이 등온 방법일 때와 같이 (예를 들면 Kacian Fultz, PCT 출원 공개 제WO91/01384호 또는 Kacian et al., PCT 출원 공개 제WO93/22461호) 증폭 반응이 하나 또는 두 개 모두의 효소를 변성시키는 온도를 이용하지 않을 때 유용하다.
실시예 7: 수크로스와 함께 역전사효소의 동결건조
본 출원인은 또한 수크로스 (예를 들면 0.2 M의 농도에서)를 역전사효소의 항냉동 안정화제로서 사용할 수 있고, 수크로스의 안정화 효과는 양호한 것으로 보이며, -20℃에서 50% (v/v) 글리세롤 중에 동일한 기간 동안 보관되고 MMLV-RT를 함유하는 표준 액체 용액에 비해 0.2 M 수크로스 중에 동결건조된 제제는 4℃에서 30일 동안 동결건조물을 보관한 후에 표준 MMLV-RT 제제 활성의 93%를 유지할 수 있음을 발견하였다. 수크로스가 아닌 0.2 M 트레할로스를 함유하는 유사하게 처리된 동결건조물은 동일한 조건 하에서 표준 물질 활성의 105%를 평균적으로 보였다.
실시예 8: PAT의 존재 하의 동결건조
본 출원인은 추가로 폴리비닐피롤리돈 (PAP)이 동결건조 전에 트레할로스와 완충액에 합해질 경우에 효소:증폭시약이 트레할로스 단독의 존재 하에 동결건조될 때보다 훨씬 큰 정도로 동결건조 T7 RNA 폴리머라제:MMLV-RT:증폭시약 제제의 안정성을 개선시키는 것을 발견하였다. 이 놀라운 발견은 항냉동 안정화제로서 트레할로스 단독 또는 트레할로스와 PAP의 혼합물을 함유하는 동결건조 조성물에서보다는 PAP를 단독으로 사용함으로써 동결건조 효소:증폭시약의 안정성을 거의 동일한 정도로 또는 더 큰 정도로 유지시킬 수 있음을 시사한다. 효소의 동결건조는 TRITON X-100 또는 다른 비이온계 가용화제를 함유하는 투석 용액에 대해 실시예 2에서 기술한 바와 같이 정제 효소를 투석시킴으로써 최적화할 수 있다. 투석 용액은 트레할로스를 포함하지 않는다. 완충액 교체 단계 후에 효소 용액의 분취액을 제조하여 각각의 분취액에 상이량의 PAP를 첨가할 수 있다. 이어서, 분취액을 효소:증폭시약에 첨가하고 실시예 2에서 기술한 바와 같이 동결건조시킬 수 있다. 이 동결건조 시료를 상이한 시간 동안 상이한 온도에서 인큐베이션하여 각각의 효소 활성 및 복원된 시약의 실시예 3에서와 같은 핵산 증폭 지지 능력을 분석하였다.
당업계의 숙련가는 상기 실시예들이 단지 본 발명의 방법 및 조성물의 바람직한 실시형태를 기술한 것으로서 본 발명을 제한하거나 한정하고자 하는 것이 아님을 이해할 것이다. 다른 실시형태는 하기 특허청구의 범위 내에 포함된다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭: 핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물
(iii) 서열수: 3
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 리온 엔드 리온 (Lyon Lyon)
(B) 거리: 웨스트 피프쓰 스트리트 633 수트 4700
(C) 도시: 로스 엔젤레스
(D) 주: 캘리포니아주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 90071-2066
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM 호환형
(C) 작동 시스템: DOS
(D) 소프트웨어: FastSEQ 버전 1.5
(vi) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호: 미부여
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 선출원 데이터:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 이름: 셀돈 오. 헤버
(B) 등록 번호: 38,179
(C) 참조/요약 번호: 211/127-PCT
(ix) 통신 정보:
(A) 전화 번호: 213-489-1600
(B) 팩스: 213-955-0440
(C) 텔렉스:
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 48 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 무
(iv) 가설: 무
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 무
(iv) 가설: 무
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 무
(iv) 가설: 무
(v) 단편 형태:
(vi) 공급원:
(xi) 서열 설명:

Claims (32)

  1. a) i) 역전사효소, RNA 폴리머라제 및 역전사효소와 RNA 폴리머라제의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 활성 효소 조성물, 및
    ii) 비환원성 이당류, 폴리비닐피롤리돈 및 비환원성 이당류와 폴리비닐피롤리돈의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 안정화제를 포함하는 용액을 제공하는 단계,
    b) 용액을 동결시키는 단계, 및
    c) 진공을 가하여 상기 동결 용액의 용매 분획을 승화시켜 상기 활성 효소 조성물 및 상기 안정화제를 포함하는 동결건조물을 형성하는 단계
    로 이루어지는, 단일 바이알 중의 효소 조성물의 보관 및 안정화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성 효소 조성물이 역전사효소와 RNA 폴리머라제의 혼합물을 필수 성분으로 하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 안정화제가 트레할로스를 필수 성분으로 하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 안정화제가 폴리비닐피롤리돈을 필수 성분으로 하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 용액이, 상기 건조 분말이 복원되어 적합한 핵산 기질 및 반응물과 배합될 때 단일 용액에서 DNA 중합화 및 RNA 전사 모두를 가능하게 하기에 충분한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 금속염 및 코팩터를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 용액이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 효소 조성물이 상기 동결건조물을 실온에서 2개월 동안 보관할 때 표적 핵산을 증폭하는 능력을 70% 이상 보유하는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 효소 조성물이 상기 동결건조물을 35℃에서 2개월 동안 보관할 때 표적 핵산을 증폭하는 능력을 70% 이상 보유하는 것인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 효소 조성물이 상기 동결건조물을 45℃에서 2개월 동안 보관할 때 표적 핵산을 증폭하는 능력을 70% 이상 보유하는 것인 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 효소 조성물이 상기 동결건조물을 55℃에서 2개월 동안 보관할 때 표적 핵산을 증폭하는 능력을 70% 이상 보유하는 것인 방법.
  11. 동결건조된 역전사효소를 포함하는 조성물.
  12. 동결건조된 RNA 폴리머라제를 포함하는 조성물.
  13. a) RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAse H 활성이 하나 이상의 별개의 효소에 의해 제공되는 유효량의 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, RNAse H 활성 및 DNA 지향 RNA 폴리머라제 활성,
    b) 항냉동 활성을 갖는 하나 이상의 안정화제,
    c) 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오티드 트리포스페이트,
    d) 금속염, 및
    e) 환원제
    를 갖는 단일 동결건조물을 포함하는 표적 핵산 증폭용 조성물로서, 상기 동결건조물을 수성 용매를 첨가하여 복원시킬 경우 생성 용액은 표적 뉴클레오티드 서열 영역을 갖는 단일 가닥 RNA 분자 및 하나 이상의 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 용액에 첨가하고 상기 효소 활성의 촉진에 충분한 온도에서 용액을 인큐베이션하면 상기 RNA 분자를 증폭시키는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 적합한 프라이머가 동결건조물에 포함되는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, 및 RNAse H 활성이 재조합 레트로바이러스 역전사효소에 의해 제공되고, 상기 DNA 지향 RNA 폴리머라제 활성이 박테리오파지 RNA 폴리머라제에 의해 제공되는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 역전사효소가 몰로니 무린 백혈병 바이러스에서 유도된 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제가 T7 박테리오파지에서 유도된 것인 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 안정화제가 비환원성 이당류, 폴리비닐피롤리돈 및 비환원성 이당류와 폴리비닐피롤리돈의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 수크로스, 트레할로스 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 안정화제를 포함하는 조성물
  20. 제13항에 있어서, 상기 안정화제가 트레할로스를 포함하는 것인 조성물.
  21. a) RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAse H 활성이 하나 이상의 별개의 효소에 의해 제공되는 유효량의 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, RNAse H 활성 및 DNA 지향 RNA 폴리머라제 활성,
    b) 항냉동 활성을 갖는 하나 이상의 안정화제,
    c) 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 리보뉴클레오티드 트리포스페이트,
    d) 금속염,
    e) 환원제, 및
    f) 완충액
    을 갖는 단일 동결건조물을 포함하지만 카르복실산은 포함하지 않는 표적 핵산 증폭용 조성물로서, 상기 동결건조물을 수성 용매를 첨가하여 복원시킬 경우 생성 용액은 표적 뉴클레오티드 서열 영역을 갖는 단일 가닥 RNA 분자 및 하나 이상의 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 상기 용액에 첨가하고 상기 효소 활성의 촉진에 충분한 온도에서 용액을 인큐베이션하면 상기 RNA 분자를 증폭시키는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 RNA 지향 DNA 폴리머라제 활성, DNA 지향 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAse H 활성이 재조합 레트로바이러스 역전사효소에 의해 제공되고 상기 DNA 지향 RNA 폴리머라제 활성이 박테리오파지 RNA 폴리머라제에 의해 제공되는 것인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 역전사효소가 몰로니 무린 백혈병 바이러스에서 유도된 것인 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제가 T7 박테리오파지에서 유도된 것인 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 상기 안정화제가 비환원성 이당류, 폴리비닐피롤리돈 및 비환원성 이당류와 폴리비닐피롤리돈의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 상기 안정화제가 비환원성 이당류 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 조성물
  27. 제22항에 있어서, 상기 안정화제가 트레할로스를 포함하는 것인 조성물.
  28. 트레할로스 및 폴리비닐피롤리돈으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 항냉동 안정화제와 함께 단일 동결건조 제제 중에 배합된 역전사효소 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 표적 핵산 증폭용 키트로서 상기 동결건조 제제의 재수화 및 올리고뉴클레오티드 프라이머의 존재 하의 표적 핵산의 첨가시에 상기 표적 핵산의 일부 또는 전부가 증폭되는 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 동결건조 제제가 추가로 금속염 및 뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함하는 것인 키트.
  30. 제28항에 있어서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머를 추가로 포함하는 것인 키트.
  31. 제28항에 있어서, 상기 안정화제가 트레할로스를 포함하는 것인 키트.
  32. 제28항에 있어서, 상기 안정화제가 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 것인 키트.
KR1019970705505A 1995-02-10 1996-02-02 핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물 KR19980702110A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8/387,011 1995-02-10
US08/387,011 US5556771A (en) 1995-02-10 1995-02-10 Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR19980702110A true KR19980702110A (ko) 1998-07-15

Family

ID=23528056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970705505A KR19980702110A (ko) 1995-02-10 1996-02-02 핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물

Country Status (10)

Country Link
US (3) US5556771A (ko)
EP (1) EP0726310B1 (ko)
JP (1) JP3282819B2 (ko)
KR (1) KR19980702110A (ko)
AT (1) ATE244759T1 (ko)
AU (1) AU699590B2 (ko)
CA (1) CA2210584A1 (ko)
DE (1) DE69628959T2 (ko)
ES (1) ES2202387T3 (ko)
WO (1) WO1996024664A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100984483B1 (ko) * 2007-03-19 2010-10-01 (주)바이오니아 순환적 역전사 방법
WO2014137093A1 (ko) * 2013-03-04 2014-09-12 우송대학교 산학협력단 교차오염 억제용 ｕｄｇ를 함유한 중합효소연쇄반응액의 동결건조물

Families Citing this family (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08131171A (ja) * 1994-11-11 1996-05-28 Asahi Chem Ind Co Ltd 逆転写酵素の安定化組成物
US5556771A (en) * 1995-02-10 1996-09-17 Gen-Probe Incorporated Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification
US6551794B1 (en) * 1995-11-09 2003-04-22 E. R. Squibb & Sons, Inc. Stable biotinylated biomolecule composition
US5876992A (en) * 1996-07-03 1999-03-02 Molecular Biology Resources, Inc. Method and formulation for stabilization of enzymes
ATE357513T1 (de) * 1996-07-16 2007-04-15 Qiagen North American Holdings Verfahren zur herstellung komplexer multienzymatischer lagerstabiler reaktionsgemische und deren verwendung
US6013488A (en) 1996-07-25 2000-01-11 The Institute Of Physical And Chemical Research Method for reverse transcription
US6458556B1 (en) * 1996-07-25 2002-10-01 The Institute Of Physical & Chemical Research Method for enhancing enzyme activity at elevated temperature
US5861251A (en) * 1996-10-15 1999-01-19 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
EP0868916A3 (en) * 1997-03-04 2004-09-15 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity
ATE445630T1 (de) 1997-04-22 2009-10-15 Life Technologies Corp Verfahren zur herstellung von aslv reverser transkriptase zusammengestellt aus mehreren untereinheiten
US6429007B1 (en) 1997-05-02 2002-08-06 BIOMéRIEUX, INC. Nucleic acid amplification reaction station for disposable test devices
US6558901B1 (en) * 1997-05-02 2003-05-06 Biomerieux Vitek Nucleic acid assays
US6410275B1 (en) 1997-05-02 2002-06-25 Biomerieux, Inc. Disposable test devices for performing nucleic acid amplification reactions
US5989499A (en) * 1997-05-02 1999-11-23 Biomerieux, Inc. Dual chamber disposable reaction vessel for amplification reactions
IL124275A (en) 1997-05-02 2002-03-10 Bio Merieux Vitek Inc A method to produce sequences of nucleic acids
GB9717972D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Amersham Int Ltd Labelling composition and method
US6461817B1 (en) 1997-09-12 2002-10-08 The Public Health Research Institute Of The City Of New York Non-competitive co-amplification methods
US6844158B1 (en) 1997-12-22 2005-01-18 Hitachi Chemical Co., Ltd. Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
US20040002079A1 (en) * 1998-02-11 2004-01-01 Gunn Robert B. Sodium-phosphate cotransporter in lithium therapy for the treatment of mental illness
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
US6451572B1 (en) * 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
AU5345999A (en) 1998-08-14 2000-03-06 Valentis, Inc. Protected one-vial formulation for nucleic acid molecules, methods of making thesame by in-line mixing, and related products and methods
DE19840531C2 (de) * 1998-08-28 2003-05-15 Roboscreen Ges Fuer Molekulare Mit Nukleinsäuren beschichtete Reaktionsräume, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US6153412A (en) * 1998-12-07 2000-11-28 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
CN100347303C (zh) * 1999-03-31 2007-11-07 康乃尔研究基金会有限公司 具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶
US6271004B1 (en) * 1999-06-25 2001-08-07 Display Systems Biotech A/S Method for improved reverse transcription at high temperatures
US6379930B1 (en) * 1999-07-30 2002-04-30 Applied Gene Technologies, Inc. Stabilization of nucleic acid amplification cocktails
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
EP1290149A4 (en) 2000-05-26 2004-03-17 Invitrogen Corp THERMOSTABLE INVERTED TRANSCRIPTASES AND USES
US7846733B2 (en) * 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
DE60141087D1 (de) * 2000-06-26 2010-03-04 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur auf transkription basierenden vervielfältigung von nukleinsäuren
US6653062B1 (en) * 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
FR2812306B1 (fr) * 2000-07-28 2005-01-14 Gabriel Festoc Systeme d'amplification en chaine par polymerse de sequences nucleiques cibles
US6455256B1 (en) * 2000-08-04 2002-09-24 E. & J. Gallo Winery Method of amplifying nucleic acids of microorganisms present in fruit juice
ATE316581T1 (de) 2000-09-05 2006-02-15 Zeltz Patrick Dr Verfahren zur spezifischen bestimmung von dna- sequenzen mittels paralleler amplifikation
EP1427847B1 (en) 2000-12-13 2010-07-28 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
MXPA02012739A (es) 2001-03-09 2004-04-20 Nugen Technologies Inc Metodos y composiciones para amplificacion de secuencias de arn.
ES2180416B1 (es) * 2001-03-12 2004-06-01 BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. Procedimiento para la preparacion de mezclas de reaccion estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reaccion y kits que las contienen.
EP1450627B1 (en) * 2001-10-31 2012-09-05 Phytex, Llc Use of phytase containing animal food
US7384739B2 (en) 2001-11-14 2008-06-10 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Compositions for enhancing DNA synthesis, DNA polymerase-related factors and utilization thereof
US7435572B2 (en) * 2002-04-12 2008-10-14 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for DNA manipulation
WO2004021986A2 (en) * 2002-09-03 2004-03-18 Quanta Biosciences, Inc. Improved compositions and methods for cdna synthesis
EP1554377B1 (en) 2002-09-13 2012-11-07 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US7309505B2 (en) * 2002-09-13 2007-12-18 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve Aspergillus phytases
JP2006507482A (ja) * 2002-09-17 2006-03-02 フアルマシア・コーポレーシヨン 遺伝子発現分析に使用するための複雑な生物構造物からの遺伝子分子の単離
US20040053318A1 (en) * 2002-09-17 2004-03-18 Mcwilliams Diana R. Preservation of RNA and reverse transcriptase during automated liquid handling
US7407747B2 (en) * 2002-10-15 2008-08-05 Applera Corporation Method for drying dye-terminator sequencing reagents
DE10252239B4 (de) * 2002-11-07 2006-08-17 Micronas Holding Gmbh Verfahren zum Drucken von Biomolekülen
AU2003287603A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-03 Pharmacia Corportion High throughput automatic nucleic acid isolation and quantitation methods
US20040101859A1 (en) * 2002-11-25 2004-05-27 Cepheid Compositions, methods and kits for polynucleotide amplification reactions and microfluidic devices
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
ES2214144B1 (es) * 2003-02-26 2005-09-01 BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. Composicion estabilizada para ensayos fluorimetricos, colorimetricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtencion.
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
ATE493508T1 (de) * 2003-05-19 2011-01-15 Univ Brandeis Verfahren, kits und vorrichtungen zur prozessierung von nukleinsäuren
FR2855177B1 (fr) * 2003-05-23 2005-07-08 Raymond Robert Composition contenant des acides nucleiques lyophilises en presence de collagene et de disaccharides
US20050048460A1 (en) * 2003-05-29 2005-03-03 The Regents Of The University Of California Preservative and method for preserving cells
US20090011488A1 (en) * 2003-08-18 2009-01-08 Rosetta Inpharmatics, Llc Methods for storing compositions useful for synthesizing nucleic acid molecules
WO2005030958A1 (ja) * 2003-09-30 2005-04-07 Riken 酵素が固定されている支持体、印刷物、試薬キット、該支持体の製造法、酵素の保存法及び酵素の再生法
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
NZ550119A (en) * 2004-04-08 2009-10-30 Biomatrica Inc Method for storing biological material in a dissolvable matrix
FI20040768A0 (fi) 2004-06-04 2004-06-04 Teemu Korpimaeki Menetelmä määritysreagenssien stabiloimiseksi, stabilisoituja määritysreagensseja sisältävä reagenssisäiliö ja sen käyttö
CA2957197C (en) 2004-08-27 2017-12-12 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US20060068398A1 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 Cepheid Universal and target specific reagent beads for nucleic acid amplification
US20060068399A1 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 Cepheid Multiple bead reagent system for protein based assays with optimized matrices
JP4699008B2 (ja) * 2004-11-02 2011-06-08 旭化成株式会社 酵素反応試薬
FR2878254B1 (fr) * 2004-11-22 2010-08-20 Bio Rad Pasteur Composition pour l'amplification d'acides nucleiques
EP1863908B1 (de) 2005-04-01 2010-11-17 Qiagen GmbH Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna
EP1896610A2 (en) * 2005-05-03 2008-03-12 Handylab, Inc. Lyophilized pellets
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US8137677B2 (en) * 2005-10-06 2012-03-20 Allergan, Inc. Non-protein stabilized clostridial toxin pharmaceutical compositions
US8168206B1 (en) 2005-10-06 2012-05-01 Allergan, Inc. Animal protein-free pharmaceutical compositions
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
JP5152929B2 (ja) 2006-06-06 2013-02-27 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 核酸増幅法におけるタグ化オリゴヌクレオチドおよびその使用
US8187557B2 (en) * 2006-07-13 2012-05-29 Cepheid Reagent reservoir system for analytical instruments
EP2069486A2 (en) * 2006-08-03 2009-06-17 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
DE102006056790B3 (de) * 2006-12-01 2008-01-17 IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH Laboreinmalartikel für Analyse und Diagnosik
CA2673772A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Meridian Bioscience, Inc. Stable reagents and kits useful in loop-mediated isothermal amplification (lamp)
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
US7738094B2 (en) 2007-01-26 2010-06-15 Becton, Dickinson And Company Method, system, and compositions for cell counting and analysis
CA2684959A1 (en) * 2007-04-24 2009-01-15 Biomatrica, Inc. Sample storage for life science
EP2139602A1 (en) * 2007-04-25 2010-01-06 3M Innovative Properties Company Chemical component and processing device assembly
US8835157B2 (en) * 2007-04-25 2014-09-16 3M Innovative Properties Company Supported reagents, methods, and devices
GB0711683D0 (en) * 2007-06-16 2007-07-25 Enigma Diagnostics Ltd Compositions
EP2175999B1 (en) 2007-06-21 2017-01-04 Gen-Probe Incorporated Receptacles for use in performing processes
US20110014676A1 (en) * 2007-06-29 2011-01-20 Battelle Memorial Institute Protein stabilization
US7816135B2 (en) 2007-07-05 2010-10-19 Becton, Dickinson And Company Method of analyzing lymphocytes
US8192734B2 (en) 2007-07-09 2012-06-05 Cornell University Compositions and methods for bone strengthening
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
KR101098764B1 (ko) * 2007-10-29 2011-12-26 (주)바이오니아 안정화된 핫스타트 ｐｃｒ용 건조 조성물
EP2215211A1 (en) * 2007-11-06 2010-08-11 3M Innovative Properties Company Processing device tablet
EP2238264B1 (en) 2007-12-21 2012-08-01 Gen-Probe Incorporated Detection of antibiotic-resistant microorganisms
US20090203531A1 (en) 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
KR100978215B1 (ko) * 2008-02-28 2010-08-26 주식회사 인트론바이오테크놀로지 건조형태의 ｐｃｒ 반응용 조성물에 기반한 ｐｃｒ의 최적증폭 조건 탐색 및 설정에 활용될 수 있는 키트 및 그것의제조방법
US7846666B2 (en) * 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
EP2806037B1 (en) 2008-05-13 2016-09-21 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
GB0814570D0 (en) 2008-08-08 2008-09-17 Diagnostics For The Real World Isolation of nucleic acid
JP5586631B2 (ja) 2009-01-30 2014-09-10 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 信号を検出し、信号伝送要素に熱エネルギーを加えるためのシステム及び方法
US8519125B2 (en) * 2009-05-11 2013-08-27 Biomatrica, Inc. Compositions and methods for biological sample storage
IT1394539B1 (it) * 2009-05-19 2012-07-05 Sentinel Ch S P A Uso di uno stabilizzante delle polimerasi per la liofilizzazione e la preparazione di kit pronti per l'uso
BR112012009023A2 (pt) 2009-10-22 2019-09-24 Biotools Biotechnologial & Medical Laboratories S A método pra detecção. diferenciação e identificação de eubactérias específica de táxons em uma amostra biológica por meio de técnicas de análise de sequenciamento e kit
CA2798635A1 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Ibis Biosciences, Inc. Integrated sample preparation systems and stabilized enzyme mixtures
DE102010038330A1 (de) * 2010-07-23 2012-03-01 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren, Vorrichtung und Testkit für Molekularbiologische Reaktionen
WO2012018639A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012018638A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
RU2573324C2 (ru) 2010-08-13 2016-01-20 Эдванст Байоньютришн Корпорейшн Стабилизирующая композиция для сухого хранения биологических материалов (варианты)
WO2012054727A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Reverse transcriptase mixtures with improved storage stability
US20130023010A1 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Genereach Biotechnology Corp. Method for reverse transcription polymerase chain reaction
US8192659B1 (en) 2011-09-12 2012-06-05 On Demand Therapeutics, Inc. Methods of making microtablets for drug delivery
JP6419576B2 (ja) 2011-11-11 2018-11-07 イムコア ジーティーアイ ダイアグノスティクス インコーポレイテッド プロテアーゼａｄａｍｔｓ１３を切断するフォン・ヴィレブランド因子の検出用ポリペプチド基体
CN104160011A (zh) * 2012-03-08 2014-11-19 索尼公司 用于核酸扩增反应的微芯片的制造方法
KR101870311B1 (ko) * 2012-03-09 2018-06-25 (주)바이오니아 핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 중합효소 연쇄반응용 조성물
RU2535995C2 (ru) * 2012-06-01 2014-12-20 Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" Сухая смесь для приготовления реакционной смеси для амплификации нуклеиновой кислоты и способ ее получения
BR112015007606A2 (pt) 2012-10-04 2018-01-30 Univ Leland Stanford Junior métodos e reagentes para a detecção, quantificação e serotipagem de vírus da dengue
EP3249054A1 (en) 2012-12-20 2017-11-29 Biomatrica, INC. Formulations and methods for stabilizing pcr reagents
JP6413228B2 (ja) * 2013-11-13 2018-10-31 東ソー株式会社 長期保存可能な核酸増幅試薬
US9663770B2 (en) 2014-01-22 2017-05-30 Life Technologies Corporation Reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis
JP2017504346A (ja) * 2014-01-27 2017-02-09 アーチャーディーエックス インコーポレイテッド 核酸を調製するための等温方法および関連組成物
ES2891555T3 (es) 2014-06-10 2022-01-28 Biomatrica Inc Estabilización de trombocitos a temperaturas ambiente
EP3157685A4 (en) * 2014-06-18 2018-03-21 Luminex Corporation Methods for generating stabilized lyophilized materials
WO2016181897A1 (ja) * 2015-05-08 2016-11-17 株式会社カネカ 乾燥形態の酵素反応試薬およびその調製法
EP4242628A3 (en) 2015-12-08 2023-11-08 Biomatrica, INC. Reduction of erythrocyte sedimentation rate
CA3011617A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 Gen-Probe Incorporated Dried amplification compositions
FI126979B (en) * 2016-02-29 2017-09-15 Faron Pharmaceuticals Oy Lyophilized pharmaceutical formulation and use thereof
MX2019002835A (es) 2016-09-13 2019-09-04 Allergan Inc Composiciones no proteínicas de toxina clostridial.
EP3512965B1 (en) 2016-09-15 2024-03-13 ArcherDX, LLC Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free dna
EP3512947B1 (en) 2016-09-15 2021-10-20 ArcherDX, LLC Methods of nucleic acid sample preparation
AU2018270296B2 (en) 2017-05-19 2022-11-10 Gen-Probe Incorporated Dried compositions containing flap endonuclease
US11268084B2 (en) 2017-08-08 2022-03-08 Thermo Fisher Scientific Baltics, UAB Glycerol-free formulations for reverse transcriptases
CN107365754A (zh) * 2017-09-04 2017-11-21 广州和实生物技术有限公司 一种m‑mlv逆转录酶的冻干工艺
US20230265531A1 (en) 2020-07-22 2023-08-24 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods for one-step nucleic acid amplification and diagnostic methods based thereon
CN116121349B (zh) * 2022-12-20 2024-04-09 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种扩增含乙醇的核酸样本的方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS589688A (ja) * 1981-07-06 1983-01-20 Toyobo Co Ltd 安定な酵素組成物
US4447355A (en) * 1982-04-07 1984-05-08 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for stabilizing a tumor necrosis factor and a stable aqueous solution or powder containing the same
US4806478A (en) * 1984-10-17 1989-02-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Dry enzyme formulations containing D-amino acid oxidase
US4891319A (en) * 1985-07-09 1990-01-02 Quadrant Bioresources Limited Protection of proteins and the like
CA1294215C (en) * 1986-10-27 1992-01-14 Ze'ev Shaked Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes
GB8715238D0 (en) * 1987-06-29 1987-08-05 Quadrant Bioresources Ltd Food process
GB8801338D0 (en) * 1988-01-21 1988-02-17 Quadrant Bioresources Ltd Preservation of viruses
ATE117434T1 (de) * 1988-03-30 1995-02-15 Toray Industries Gefriergetrocknete zusammensetzung, die ein mit meerrettichperoxydase markiertes fab'-fragment eines gegen menschliches beta-interferon gerichteten antikörpers und trehalose enthält; eia kit, der diese zusammensetzung enthält.
GB8826429D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Univ Leeds Ind Service Ltd Enzyme stabilisation systems
GB8927365D0 (en) * 1989-12-04 1990-01-31 Ici Plc Reagent
IE64738B1 (en) * 1990-03-20 1995-09-06 Akzo Nv Stabilized gonadotropin containing preparations
AU2309692A (en) * 1991-07-03 1993-02-11 Cryolife, Inc. Method for stabilization of biomaterials
US5250429A (en) * 1991-09-20 1993-10-05 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Glassified restriction enzymes
EP0621774B1 (en) * 1992-01-21 1996-12-18 Sri International Improved process for preparing micronized polypeptide drugs
WO1994016107A1 (en) * 1993-01-12 1994-07-21 Thomas Jefferson University DNA SEQUENCING WITH Bst POLYMERASE
US5556771A (en) * 1995-02-10 1996-09-17 Gen-Probe Incorporated Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100984483B1 (ko) * 2007-03-19 2010-10-01 (주)바이오니아 순환적 역전사 방법
US8058007B2 (en) 2007-03-19 2011-11-15 Bioneer Corporation Cyclic reverse transcription method
WO2014137093A1 (ko) * 2013-03-04 2014-09-12 우송대학교 산학협력단 교차오염 억제용 ｕｄｇ를 함유한 중합효소연쇄반응액의 동결건조물

Also Published As

Publication number Publication date
EP0726310B1 (en) 2003-07-09
US5834254A (en) 1998-11-10
DE69628959T2 (de) 2004-05-13
AU4916796A (en) 1996-08-27
US5614387A (en) 1997-03-25
JP3282819B2 (ja) 2002-05-20
ATE244759T1 (de) 2003-07-15
WO1996024664A1 (en) 1996-08-15
AU699590B2 (en) 1998-12-10
ES2202387T3 (es) 2004-04-01
CA2210584A1 (en) 1996-08-15
US5556771A (en) 1996-09-17
DE69628959D1 (de) 2003-08-14
JPH10503383A (ja) 1998-03-31
EP0726310A1 (en) 1996-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR19980702110A (ko) 핵산 증폭을 위한 안정화된 효소 조성물
AU2002246125B2 (en) Process for preparing stabilized reaction mixtures which are partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures
US9631233B2 (en) Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase
EP1718743B1 (en) Anti-freeze protein enhanced nucleic acid amplification
EP2294222B1 (en) Freeze-dried compositions for pcr and rt-pcr
JP2000513940A (ja) 酵素の安定化のための方法および処方物
US20230227927A1 (en) Freeze-Dried Composition
JP3530534B2 (ja) Ｒｎａおよびｄｎａの保存を目的とする培養ヒト細胞の凍結乾燥
CA2970048C (en) Stable reaction mixtures for nucleic acid amplification
AU2010251184B2 (en) A dried and stabilized ready-to-use composition containing nucleic acid polymerization enzymes for molecular biology applications
WO2017184028A1 (en) Stabilized mixture of reagents for molecular diagnostics
WO1996015235A1 (fr) Composition de transcriptase inverse stable a la conservation
US12018302B2 (en) Glycerol-free formulations for reverse transcriptases
JP2015092870A (ja) 長期保存可能な核酸増幅試薬
JP2021518127A (ja) 高熱安定性を持つ修飾ヌクレオシドホスフェート
JP2008079506A (ja) ポリメラーゼ反応安定剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
NORF Unpaid initial registration fee