JP2000513940A

JP2000513940A - 酵素の安定化のための方法および処方物

Info

Publication number: JP2000513940A
Application number: JP10504515A
Authority: JP
Inventors: ロシール，セレスエイ．デ; ラクルズ，ノーバートビー．デ; ケイ．ウィルコズ，リチャード
Original assignee: モレキュラーバイオロジーリソーシス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2000-10-24
Also published as: EP0910630A4; US5876992A; US6294365B1; AU3595897A; WO1998000530A1; AU732057B2; CA2259138A1; EP0910630A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、凍結よりも高い温度での保存のための、酵素の安定化のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、酵素または酵素の混合物に添加され、続いて凍結乾燥される場合に安定性を与える、処方された賦形剤の使用を含む。再構成すると、安定化された物質は、アッセイ、診断的または分子生物学的調査キット、および他の生物学的適用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】酵素の安定化のための方法および処方物発明の背景Ａ．発明の分野本発明は、凍結乾燥の間および後の両方で、生物学的に活性な物質、特に酵素の安定性を増強するために使用される生化学物質（biochemicals）の湿潤混合物の処方に関する。安定化剤の存在下での凍結乾燥による、この混合物からの水の除去は、室温で長期間にわたって室温で安定である凍結乾燥酵素をもたらす。本発明はまた、酵素を凍結乾燥するためのプロセスに有用な安定化剤の改善された組合せに関する。この組合せは、凍結よりも上の温度で保存される、増強された安定性の酵素を提供し得る。Ｂ．背景酵素は、水系においては室温で不安定であり、それゆえ代表的には凍結状態で、または−20℃（ある場合には−70℃）で、低い凝固点および低い蒸気圧を有する安定化剤（例えば、グリセロール）の存在下の液体のいずれかで、保存される。これらの保存条件下でさえも、融解および室温での取扱いの繰り返しは、活性の喪失を導き得る。酵素の安定化は、熱変性などを含む種々の理由で生じ得る不可逆的なタンパク質変性の防止を含む。折り畳まれていないかまたは変性したタンパク質は、変化した構造を有し、これは活性部位の配置に影響を及ぼし、そしてこれらを酵素的に不活性にする（Tsou，1993）。酵素活性の喪失を防止するための試みでは、多数の安定化方法が用いられている。安定化の方法は、４つの群に分類され得る：(1)賦形剤の添加；(2)有機溶媒の使用（化学的修飾）；(3)固定化（固相／可溶性相への結合）；および(4)タンパク質操作技術（GianfredaおよびScarfi，1991）。本明細書中に記載される安定化の方法は、可溶性賦形剤の使用を含む。賦形剤は、溶媒に所望の特性を与える不活性な物質である。このような賦形剤の例は、糖、グリセロール、ポリエチレングリコール、アミノ酸、および他の浸透質（osmolyte）を含む。特定の親水性賦形剤は、溶媒をより極性にすることにより、安定性を与える。溶媒の極性の増加は、タンパク質内から溶媒への疎水性アミノ酸部分の転移自由エネルギーの増加をもたらし、それにより、タンパク質が折り畳まれないのがより困難になる（AlonsoおよびDill，1991）。グリセロールは、低温（−20℃）での酵素の保存のために、酵素学者により用いられる通常の賦形剤である。なぜなら、50％グリセロール緩衝液中で凍結して保存されるいくつかの酵素は、それらのかなりの初期活性を数年間保持し得るからである。目的の酵素を安定化混合物と組み合わせることは、単独では、棚安定性を与えるに充分ではないかもしれない。タンパク質に長期間の安定性を与えるために使用されるプロセスの１つは、乾燥である。安定化処方物と組み合わせて使用される場合、乾燥は、非常に安定な産物を生じ得る。乾燥方法は、一般に２種類がある：(1)風乾および(2)凍結乾燥。風乾は、室温または上昇した温度の条件下で、大気圧で乾燥することを含む。凍結乾燥は、減圧下で水分子が凍結溶液から除去される乾燥プロセスである。凍結乾燥は、第１に、水溶液が凍結されること、好ましくは急速凍結されることを必要とする。溶液を急速凍結する手段の１つは、それを液体窒素中に浸漬することである。次いで、凍結サンプルに高減圧が適用され、これが氷点下温度での昇華または氷相の蒸発をもたらす（一次乾燥）。続いて、温度を徐々に上昇させることにより、残りの水分を除去し得る（二次乾燥）（FTS Systems，Inc.，B ulletin #1）。得られる凍結乾燥産物は、乾燥、結晶物質または粉末である。凍結乾燥された物質は、しばしば吸湿性である。つまり、これらは大気の水分を吸収し、そしてそれらの安定性を喪失する傾向がある。しかし、特定の添加剤の存在下では、吸湿性でない物質を生成することが可能である。凍結防止剤として炭水化物を用いる物質の安定化および保存は、Franksおよび Hatley（米国特許第5,098,893号）により記載されているが、乾燥プロセスは、ほぼ大気圧での室温または上昇した温度の条件を使用する。糖の使用は、ガラス質のマトリックスまたはゴム状の状態の形成を生じ、これは無水の場合、目的の物質を安定化する。Roserは、米国特許第4,891,319号および欧州特許出願WO 87/ 00196、WO 89/06542、WO 89/06976、EP 0 415 567 A2において、生物学的物質（例えば、タンパク質、ウイルス、および他の巨大分子）を、室温条件および大気圧の下で、炭水化物であるトレハロースの存在下で乾燥することにより、安定化するプロセスを記載する。二糖類であるトレハロースのような糖の安定化剤としての使用は、多糖類（Gu oweら，1987）を安定化するための凍結乾燥に関連して用いられている。凍結乾燥はまた、腫瘍壊死因子を、非イオン性界面活性剤および糖（例えば、トレハロース）の存在下で安定化するために用いられている（HayashiおよびKomiya，欧州特許出願GB 2 126 588 A）。凍結乾燥の間に糖で安定化されている酵素は、グルコース、ガラクトース、マルトース、スクロース、およびトレハロースで安定化されたホスホフルクトキナーゼ（Carpenterら，1987）、ならびにマンニトール、ラクトース、およびトレハロースで安定化されたアルカリホスファターゼ（ FordおよびDawson，1992）を含む。当該分野では依然として、酵素、特に分子生物学的適用に使用するための酵素を安定化する、新規でかつ良好な処方方法の必要性がある。多くの国での冷凍庫および冷蔵庫の利用可能性が制限されていることによってもまた、室温で安定である酵素を使用者にもたらす必要性が生じる。従って、本発明の目的は、室温で輸送し得、そして上昇した温度（または冷蔵温度［２〜８℃］でもしくは室温で）数ヶ月もしくは数年間保存し得、そして依然としてそれらの初期活性レベルの全てもしくはほとんどを保持し得る、安定化酵素を提供することである。本発明のさらなる目的は、診断キットおよび他の分子生物学的調査キットの一部として、種々の試験手順において使用し得る、特定の安定化酵素処方物を提供することである。これらの目的に従って、本発明は、凍結よりも上の温度で保存し得、そして使用の直前に再活性化し得る、安定化酵素を提供する。それゆえ、本発明は、１つの酵素または複数の酵素の組合せとともに用いられる場合に、酵素の凍結乾燥の前およびその間、または再構成の後に、酵素活性に有害に作用しない処方物を提供することに関する。本発明はさらに、１つの酵素または複数の酵素の組合せと組み合わせた場合に、酵素の凍結乾燥の前およびその間、または再構成の後に、酵素活性に有害に作用しない処方物を提供することに関する。本発明はさらに、１つの酵素または複数の酵素の組合せと組み合わせた場合に、凍結乾燥の後に、これまで可能であったよりも大きな安定性を与える処方物を提供することに関する。なお別の目的は、診断的または分子生物的調査試験に適用され得る、凍結乾燥した酵素混合物を提供することである。発明の要旨本発明は、タンパク質の安定化のための賦形剤の処方物（安定化処方物）に関する。タンパク質は、酵素または酵素的に活性な酵素のフラグメントを含むがこれに限定されない。処方物は、キャリアタンパク質、１以上の糖、１以上の二糖類、１以上の二糖類誘導体、必要に応じて１以上の糖重合体、および／または分枝糖重合体を含む。処方物は、水性であるかまたは実質的に水を含まない（乾燥処方物）かのいずれかであり得る。乾燥処方物は、使用前に水相に再構成され得る。好ましい処方物は、糖であるトレハロースおよびマルチトール、糖重合体であるデキストランを、キャリアタンパク質、好ましくはアルブミン、より好ましくはウシ血清アルブミン（BSA）とともに緩衝溶液中に含む。BSAも糖も、単独では、長期の保存に必要とされる熱安定性を与えない。処方物は、目的の酵素の個々の活性に干渉しないし、これらの酵素を利用する、機能的な複数酵素（multi-en zyme）プロセスに干渉もしない。水溶液中で再構成すると、混合物は、個々の酵素活性および複数の機能的活性の両方を保持する。本発明は、安定化された物質を、生物学的適用（例えば、診断的または分子生物学的調査キットの製造）および当業者に明らかである他の適用またはプロセスにおいて用いるための方法を提供する。より詳細には、本発明は、凍結温度よりも上で保存するために酵素または他の生物学的物質を安定化するための改善された方法に関する。この方法は、酵素または生物学的物質を、安定化処方物と、（凍結乾燥状熊または水性状態のいずれかで）組み合わせる工程、その後の凍結工程、および凍結混合物の凍結乾燥工程を含み、この処方物は、キャリアタンパク質、１以上の糖、１以上の二糖類、１以上の二糖類誘導体、必要に応じて１以上の糖重合体、および緩衝液を含む。本発明で有用なキャリアタンパク質は、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）およびゼラチンを含むがこれらに限定されない。本発明で有用な例示的な二糖類は、トレハロース、スクロースなどを含むがこれらに限定されない。本発明で有用な例示的な二糖類誘導体は、マルチトール、特に二糖類アルコールを含むがこれらに限定されない。本発明で有用な例示的な類重合体は、デキストランを含む。本発明で有用な緩衝液は、Tris緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、およびこれらの組合せを含む。本発明の好ましい実施態様は、凍結温度よりも上での乾燥相での室温保存のために酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを安定化するための方法に関する。この方法は、酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを、キャリアタンパク質（代表的には約１mg/mlから約15mg/ml）、約３％w/v〜約15％w/vの１以上の二糖類、約０％ w/v〜約10％ w/vの１以上の二糖類誘導体、約０％w/v〜約10 ％ w/vの単糖重合体、および適合性の緩衝液を組合せて含む安定化処方物と組み合わせる工程；この混合物を凍結する工程；およびこの凍結混合物を、実質的に水を含まなくなるまで凍結乾燥する工程から構成される。本発明の好ましいキャリアタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。安定化混合物中でのウシ血清アルブミンの好ましい濃度は、約３mg/mlである。本方法の二糖類および二糖類誘導体は、好ましくは、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体（例えば、Ficoll^TM）からなる群より選択される。本発明の方法での使用のために好ましい二糖類は、トレハロースである。好ましくは、トレハロースは、約６％ w/v〜約10％ w/vで存在する。本発明の方法での使用のために好ましい二糖類誘導体は、マルチトールである。好ましくは、マルチトールは、約３％ w/v〜約10％ w/vで存在する。本発明の方法での使用のために好ましい単糖重合体は、好ましくは約2.0％ w/v〜約10％ w/vで存在する、デキストランである。好ましいデキストランは、Dextran T-500である。本発明の実施のために好ましい緩衝液は、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0. 51mMジチオトレイトール、0.66mM EDTA，1.28mM Mg-アセテート、および0.03％メラーゼ、AMV-逆転写酵素、RNase H、室温で不安定であることが公知の他の酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。本発明によりさらに意図されるのは、酵素または酵素的に活性なそのフラグメントの安定化混合物であり、この安定化混合物は、本発明の方法により生成される。本発明はまた、酵素、およびタンパク質を含むがこれらに限定されない他の生物学的物質の安定化のために有用な処方物に関し、この処方物は、キャリアタンパク質、１以上の糖、および１以上の二糖類または二糖類誘導体を含む。本発明の別の局面は、１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントの、実質的に水を含まず、そして安定化された処方物を生成する際に使用するための混合物に関する。この混合物は、水相の添加により所定の容積になった場合に、以下を含む：キャリアタンパク質；約３％（w/v）〜約15％（w/v）の１以上の二糖類；約１％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の二糖類誘導体；約０％（w/v ）〜約10％（w/v）の糖重合体；および適合性の緩衝液。凍結温度よりも上での乾燥相での保存のために、１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを安定化するために有用な好ましい水性処方物は、キャリアタンパク質（約１mg/ml〜約15mg/ml）、約３％ w/v〜約15％ w/vの１以上の二糖類、約１％w/v〜約10％ w/vの１以上の二糖類誘導体、約０％ w/v〜約10％ w/vの１以上の単糖重合体、および適合性の緩衝液、そして必要に応じて、スクロースの分枝重合体を、組合せて含む。改善された処方物の好ましいキャリアタンパク質はウシ血清アルブミンであり、そしてその好ましい濃度は約３mg/mlである。処方物の二糖類および二糖類誘導体は、好ましくは、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、および分枝スクロース重合体（例えば、Ficoll^TM）からなる群より選択される。本発明の処方物での使用のために好ましい二糖類は、トレハロースである。好ましくは、トレハロースは、約６％ w/v〜約10％ w/vで存在する。本発明の処方物での使用のために好ましい二糖類誘導体は、マルチトールである。好ましくは、マルチトールは、約３％ w/v〜約10％ w/vで存在する。本発明の処方物に使用するために好ましい単糖重合体は、好ましくは約2.0％ w/v〜約10％ w/vで存在する、デキストランである。本発明の実施のために好ましい緩衝液は、本質的に、2. 92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl( pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mMジチオトレイトール、0.66mM EDTA， 1. り安定化される酵素は、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-逆転写酵素、RNase H、室温で不安定であることが公知の他の酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。本発明はまた、生物学的物質、特に酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを安定化するための水性処方物に関する。この処方物は、キャリアタンパク質（約１mg/ml〜約15mg/ml）、約３％ w/v〜約15％ w/vの１以上の二糖類、約１％ w/v〜約10％ w/vの１以上の二糖類誘導体、約０％ w/v〜約10％ w/vの単糖重合体、および適合性の緩衝液、そして必要に応じて、スクロースの分枝重合体を組合せることにより生成される。処方物の好ましいキャリアタンパク質はウシ血清アルブミンであり、そしてその好ましい濃度は約３mg/mlである。処方物の二糖類および二糖類誘導体は、好ましくは、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、および分枝スクロース重合体（例えば、Ficoll^TM）からなる群より選択される。本発明の処方物での使用のために好ましい二糖類は、トレハロースである。好ましくは、トレハロースは、約６％ w/v〜約10％ w/vで存在する。本発明の処方物での使用のために好ましい二糖類誘導体は、マルチトールである。好ましくは、マルチトールは、約３％ w/v〜約10％ w/vで存在する。本発明の処方物での使用のために好ましい単糖重合体は、好ましくは約2.0％ w/v〜約10％ w/vで存在する、デキストランである。本発明の実施のために好ましい緩衝液は、本質的に、2.92mMリン酸カリウム (pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM N aCl、19.2mM KCl、0.51mMジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテ本発明の水性処方物は、凍結および凍結乾燥されて、実質的に水を含まない（乾燥した）処方物を提供し得る。この処方物は、水相に再構成された場合に、酵素または酵素的に活性なそのフラグメントと混合され得、この混合物は凍結および凍結乾燥されて、酵素または酵素的に活性なそのフラグメントの安定化混合物を提供する。本発明によりまた意図されるのは、本発明の方法に従って調製される、生物学的物質、好ましくは酵素または酵素的に活性な酵素のフラグメントの安定化混合物、ならびに水性安定化処方物および実質的に水を含まない安定化処方物の両方である。図面の簡単な説明図１は、BSAおよび種々の糖添加剤および緩衝液とともに凍結乾燥した３つの素結合ゲルアッセイ（ELGA）ゲルの写真である。図２は、標準的な50％グリセロール湿潤酵素混合物と比較した場合の、マルチトール、BSA、デキストラン、およびトレハロースとともに凍結乾燥した３つの ELGAゲルの写真である。図３は、−20℃、４℃、22℃、37℃、50℃、または65℃で１週間インキュベーレハロースとともに凍結乾燥した３つの酵素の混合物の安定性を示す、ELGAゲルの写真である。図４は、標準的な酵素混合物と比較した場合の、−20℃、４℃、22℃、37℃、ル、BSA、デキストラン、およびトレハロースとともに凍結乾燥した３つの酵素の混合物の安定性を示す、ELGAゲルの写真である。発明の詳細な説明以下は、生物学的物質を安定化するために有用な水性の安定化処方物および乾燥した安定化処方物、ならびにこの処方物を調製するための方法を記載する。本発明の処方物を用いて生物学的物質を安定化するための方法もまた開示される。さらに、安定化混合物の使用を含む方法およびキットが記載される。従って、議論を以下に詳述するように、本発明はいくつかの局面を有する。以下の方法を、本研究を通して使用した。Ｉ．凍結乾燥のための酵素の調製潜在的な安定化賦形剤を研究するために使用された精製酵素は、T7 RNAポリメラーゼ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルスー逆転写酵素（AMV-RT）、およびRNase H （Molecular Biology Resources，Milwaukee，WI）であった。これらの酵素を、 50％グリセロール保存緩衝液中で−20℃または−70℃で保存した。なぜなら、グリセロールは、保存温度のより近くまでタンパク質の凝固点を低下させるからである。凍結乾燥の前に、グリセロールを除去することが必要であった。なぜなら、これは吸湿剤として作用し、そして酵素調製物は凍結乾燥しないからである。各酵素は、個々に、以下に記載される通りに、超遠心分離によりグリセロール除去（deglycerolized）され、グリセロールを含まないその適切な保存緩衝液中に入れられた。 MA）を用いて緩衝液交換方法により、小規模で試験した。T7 RNAポリメラーゼおよびAMV-逆転写酵素（AMV-RT）の分子量は、それぞれ、約107,000および160,0酵素の緩衝液交換のために必要とされた。RNase Hの分子量は17,600kDであり、換のために必要とされた。非特異的結合を低減させた（Amicon Co．Technical Note）。これは、滅菌水（1 000μＬ）中１mg/mLのBSAを各コンセントレーターに添加し、そしてラバーアダプ中で5000×ｇで遠心分離することにより行なった。各サンプルレザーバーを、汚染を最小にするために、濃縮の間、パラフィンで覆った。BSAは、T7 RNAポリメラーゼまたはRNase Hの活性回収の際には有意な効果を有さない。しかし、AMV-R T活性は、グリセロール除去の際に、いくつかの供給源からのBSAに感受性である。AMV-RTグリセロール除去のために好ましいBSA調製物は、アセチル化BSA（Mole cular Biology Resources，Milwaukee，WI）である。各コンセントレーターに、1000μＬの適切な非グリセロール含有滅菌濾過保存緩衝液を添加し、そしてデッドボリューム（25〜50μｌ）に到達するまで、コンセントレーターを遠心分離した。T7 RNAポリメラーゼをグリセロール除去するために使用した緩衝液は、20mMリン酸カリウム（pH7.5）、100mM NaCl、１mMジチオトレイトール、１mM EDTA、および100μｇ/ml BSAであった。AMV-RTをグリセロール除去するために使用した緩衝液は、20mM Tris-HCl（pH8.3）、２mMジチオトレイトール、および40mM KClであった。AMV-RTに対する緩衝液は、その標準的な保存緩衝液（200mMリン酸カリウム（pH7.2）、２mMジチオトレイトール、および0.2％（v/v）Triton X-100）とは異なっていた。Trisベース緩衝液を、続いての乾燥に用いた。なぜなら、リン酸緩衝液の使用は活性回復に最適ではなかったからである。RNase Hのグリセロール除去を、20mM Tris-HCl（pH7.5）、300mM K Cl、0.1mMジチオトレイトール、20mM Mg-アセテート、７mM EDTA、および200μ ｇ/ml BSAからなる緩衝液を用いて達成した。酵素をグリセロール除去するために、（グリセロール中の）適切な容積の酵素を、各コンセントレーター中に添加した。グリセロール除去された量を、最終的な凍結乾燥に必要とされるユニット数により決定した。一般的に、グリセロール緩衝液中の50〜150μＬの量の酵素が、調製されたコンセントレーターに添加された。グリセロールを含まない適切な緩衝液を添加して、最初の酵素容積の約10 倍の容積（計1.5mlまで）を得て、そしてフィルターを破壊しないように注意しながら、ピペッティングによって２相を完全に混合した。非グリセロール緩衝液での酵素の過剰希釈を避けることが重要である。なぜなら、これは、活性の喪失に寄与し得るからである。各コンセントレーターを、SA-600ローター中で、5000 ×ｇで約45分間遠心分離した。このプロセスを２回くり返した。グリセロール除去した酵素を、濾過ユニットを保持カップ（retentate cup）に取り付け、そしてアセンブリーをSA-600ローター中で1000×ｇで２分間回転させることにより回収した。各回転物からの濾液を捨てた。保持物（retentate）の最終容積を、ピペッティングにより決定した。グリセロール除去した各個々の酵素調製物の活性の慎重な測定を行って、回収を決定した。個々の酵素活性アッセイを、標準的な手順に従って行なった。T7 RNAポリメラーゼを、Davanlooら（1984）により記載されるプロトコルの改変版を用いてアッセイした。反応混合物（50μｌ）は、40mM Tris-HCl、pH7.9（23℃）、8mM MgCl₂ 、５mM DTT、４mMスペルミジン-(HCl)₃、各々0.4mMのCTP、GTP、ATP、pH7.0、0 .4mM［α³³Ｐ］UTP、pH7.0、25μCi/ml、2.5μｇ T7 DNA、および５μｌの希釈した酵素を含んでいた。コントロールの目的で、T7 RNAポリメラーゼの充分に特徴付けられたストックを、２〜20ユニット／反応物の範囲で同時にアッセイした。２つの反応を、ネガティブコントロールとして、酵素を有さずに行なった。反応を、45μｌの反応混合物への５μｌの酵素の添加により開始した。37℃にて10分間のインキュベーションの後、50μｌの酵母RNA共沈物（0.1Ｍ酢酸ナトリウム中10mg/ml、pH5.0）を添加し、続いて１mlの10％トリクロロ酢酸（TCA）を添加することにより、反応を終了させた。次いで、サンプルを氷上に少なくとも 10分間置き、沈降させた。次いで混合物をガラス繊維フィルターディスクで濾過し、そして５％ TCA／２％ピロリン酸ナトリウムで洗浄し、次いで試薬グレードの100％冷エタノール（Mallinkrodt，Paris，KY）で洗浄した。充分な乾燥の後に、ディスクを、５mlのシンチレーション液を有するバイアル中に入れ、そしてシンチレーションカウンターによりカウントして酸で沈降可能なカウントを決定した。１ユニットの活性は、37℃にて60分間で１nmolのUTPを酸不溶性形態に取り込むために必要とされる酵素の量として定義される。 AMV-逆転写酵素アッセイは、Houtsら（1979）により記載されたプロトコルの改変版であった。この開示は、本明細書中に参考として援用される。反応物（50 μｌ）は、50mM Tris-HCl、pH8.3（23℃）、6mM MgCl₂、40mM KCl、1mM DTT、0. 2mMポリＡ・（dT）₁₂ _〜18（20:1）、0.5mM[³H]TTP、pH7.0、10μCi/ml、および5 μｌの希釈した酵素を含んでいた。コントロールの目的で、AMV-RTの充分に特徴付けられた標準的ストックを、0.1〜１ユニット／反応物の範囲で同時にアッセイした。２つの反応を、ネガティブコントロールとして、酵素を有さずに行なった。 45μｌ反応混合物（より少ない酵素）をプレインキュベートし、そして５μｌのAMV-逆転写酵素の添加により反応を開始した。37℃にて10分間のインキュベーションの後、ガラスフィルター四角（１×１cm）上に40μｌをスポットすることにより、反応を終了させた。この四角に、10％冷トリクロロ酢酸（TCA）／２％ピロリン酸のビーカー中に入れ、そして少なくとも10分間旋回させた。四角を、５％TCA/２％ピロリン酸で各５分間、氷上で旋回しながら洗浄した。試薬グレードの冷100％エタノール（Mallinkrodt）で１分間の最終洗浄の後に、フィルター四角を加熱ランプ下で充分に乾燥させた。乾燥したフィルターを、最低２時間の浸漬後、５mlのシンチレーション液中でカウントした。１ユニットの活性は、37 ℃にて10分間で、１nmolの総dTTPを酸不溶物中に取り込むために必要とされる酵素の量として定義される。 RNase Hアッセイは、HillenbrandおよびStaudenbauer(1982)により記載されたプロトコルに従った。この開示は、本明細書中に参考として援用される。反応物（25μｌ）は、20mM HEPES-KOH、pH8.0（23℃）、10mM MgCl₂、50mM KCl、１mM DTT、0.24mM[α³²Ｐ]ポリＡ・（dT）（1:2）、pH7.0、15μCi/ml、および４μｌの希釈した酵素を含んでいた。コントロールの目的で、RNase Hの充分に特徴付けられた標準的ストックを、0.05〜0.5ユニット／反応物の範囲で同時にアッセイした。２つの反応を、ネガティブコントロールとして、酵素を有さずに行なった。 25μｌ反応混合物（より少ない酵素）を調製し、そして４μｌのRNase Hの添加により反応を開始した。37℃にて20分間のインキュベーションの後、25μｌの冷酵母RNA共沈物（0.1Ｍ酢酸ナトリウム中10mg/ml、pH5.0）を添加し、続いて20 0μｌの10％トリクロロ酢酸（TCA）を添加することにより、反応を終了させた。サンプルを氷上に少なくとも10分間置いた。混合物を、Eppendorf微量遠心管（B rinkmann Instruments，Westburg，NY）中で16,000×ｇで７分間遠心分離し、そして200μｌの上清液を取り出し、そして５mlのシンチレーション液中でカウントした。１ユニットの活性は、37℃にて20分間で、［α³²Ｐ］ポリ(A)・ポリ(dT) から１nmolの酸可溶性リボヌクレオチドを生成するために必要とされる酵素の量として定義される。一旦、グリセロール除去酵素の活性が決定されたら、サンプルを、凍結乾燥のり、核酸配列に基づく増幅（Compton，1991;Kievits，1991;Malek，米国特許第5 ,130,238号および同第5,409,818号（これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される）に開示される通り）は、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-RT、およ Teknika（Boxtel，The Netherlands）の登録商標である。V-1 RNAの初期のインビトロ検出のためにリボ核酸を選択的に増幅する（Kievits ら，1991）。反応を、わずかな改変を加えてKievitsらに記載されたように行った。標的、ヌクレオチド、プライマー、および酵素を混合して１反応物あたり10 修正された20μｌ形式）は、40mM Tris-HCl、pH8.5、12mM MgCl₂、30mM KCl、５ mM DTT、15％ジメチルスルホキシド（DMSO）、各々１mMのdATP、dGTP、dCTP、dT TP、0.5mM rITP、1.5mM rGTP、ならびに２mM rATP、rCTP、およびrUTPを含んでいた。正方向プライマー（5’AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCAAA 3'[配列番号１]）および逆方向プライマー（5’AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TCA 3'[配列番号２]）を、１反応物あたり0. 2μＭの最終濃度で添加した。反応を、２μｌ（25μｌ形式）または５μｌ（20 μｌ形式）の酵素混合物の添加により開始した。この酵素混合物は、２ユニットのAMV-RT、180ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.6ユニットのRNase Hからなる。次いで、反応混合物を、41℃にて1.5時間インキュベートし、そしてチューブを氷上に置くことにより停止させた。反応産物を、同位体を用いない酵素結合ゲルアッセイ（ELGA）（van der Vlie t，1993、この開示は、本明細書中に参考として援用される）により定性的に検出した。この手順では、反応産物を、西洋ワサビペルオキシダーゼ連結オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ、Pharmacia Phast-System（Pharmaci a Biotech，Inc.，Piscataway，NJ）を用いて12.5％均質未変性ポリアクリルアミドゲルに流し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼの基質であるテトラ-メチルベンジジンを用いて検出する。RNA産物を含むサンプルは、迅速に決定され得る。なぜなら、ハイブリダイズしたRNA-プローブのバンドは、区別的に、遊離のオリゴヌクレオチドプローブよりもゆっくりと流れるからである。ゲルを流れた産物の希釈は、さらなる性質決定を可能にする。 III．酵素活性の安定化のための添加剤の試験酵素と共に使用するための安定化剤の探索では、多数の化学物質を試験した。けるそれらの使用にも干渉しない添加剤について試験した。個々の糖（５〜30％の最終濃度）を個々の酵素または酵素の混合物に添加することにより、添加剤の調査を行なった。安定化混合物をまた、凍結乾燥酵素混合物での使用について試験した。この処方物は、ウシ血清アルブミン、マルチトール、トレハロース、デキストラン、およびユニバーサル緩衝液の溶液を含む。 IV．酵素の凍結乾燥凍結乾燥のための酵素を調製するために、安定化添加剤の均質プレ混合物を作製した。次いで、グリセロール除去した個々の酵素（第Ｉ節を参照のこと）を、ニバーサル緩衝液」（2.92mMリン酸カリウム（pH7.2）、4.14mMリン酸カリウム（pH7.5）、1.28mM Tris-HCl（pH7.5）、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mMジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Triton X の条件を最適化した。この緩衝液を凍結乾燥混合物に添加して、容易な操作のために適切なレベルに容積を合わせた。凍結乾燥の最初の工程は、２つの方法の一方による、液体窒素中でのサンプルの急速冷凍である。凍結の第一の方法は、処方物のアリコートをプラスチック試験管中にピペッティングすること、次いで、この管を液体窒素の容器の中に５分間浸漬することを含んでいた。一旦サンプルが凍結したら、管を液体窒素から取り出し、そして管に合わせそしてドライアイス上にセットした冷却ブロック中に入れた。次いで、ブロックを予め冷却した減圧容器中に入れ、そして閉鎖された容器をドライアイスのベットの上にセットした。他の凍結方法は、凍結球の形成を含んでいた。処方物の球を、アリコートをピペッターから直接液体窒素中に滴下し、そしてそれらを５分間凍結させることにより作製した。次いで、予め冷却したトレーに球を直接入れ、次いでこれを容器に挿入し、閉鎖し、そしてドライアイスのベッド上にセットした。減圧を20〜50ミリトルの範囲で容器に適用し、そして凍結乾燥を24時間進行させた。第１相を、一晩生じさせ、次いで、フラスコをドライアイスから取り出し、そして室温にて２〜４時間さらに乾燥させることにより、二次的な昇華を生じさせた。フラスコへの減圧を解放し、続いて窒素ガスで充填することにより、サンプルを収集した。凍結乾燥サンプルを含む管をチャンバーから取り出し、そしてキャップをした。乾燥した球を含むトレーを取り出し、そして球を個々の管に入れた。サンプルを、適切な温度で、乾燥させて保存した。理想的には、サンプルは、乾燥した白色粉末として現れる。凍結乾燥サンプル中の残りの水を、複雑な酸化還元滴定により水分含量を測定するKarl Fischer電量分析技術を用いて分析した。代表的には、グリセロールの非存在下での乾燥プロセスは、最初の水の97％より多くを除去した。Ｖ．酵素活性の回復についての試験凍結乾燥サンプル（上記の第IV節を参照のこと）を、50％グリセロールまたは滅菌水のいずれかの添加により再構成した。各々の個々の酵素活性の回復についての最初の試験を、上記の第Ｉ節に記載されるアッセイ手順に従って行った。活活性の回復率を、−20℃で保存した標準的な湿潤処方物に対して決定した。一旦、各々の個々に凍結乾燥された酵素調製物（すなわち、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-RT、およびRNase H）が回復した活性を有することが確立されたら、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-RT、およびRNaseHを組合せ、そして種々の添加剤の存在下で酵素混合物として凍結乾燥した。再構成した酵素混合物を、各個々の酵素活 VI．凍結乾燥酵素での安定性試験安定性試験を、以下の２相で行なった：1)凍結乾燥される混合物に対する添加剤の迅速評価、および2)第１相で行なった観察に基づく見込みを示した添加剤の組合せでのフルスケールの加速分解研究。長期の低温保存の作用をシミュレートするために、凍結乾燥酵素混合物のサンプルを、−20℃〜65℃の保存温度に短期間曝露した。凍結乾燥したサンプルを、即座の使用の前に、50％グリセロールまたは滅菌水いずれかの添加により再構成した。再構成したサンプルを４℃で保存し、次いでて試験した。安定性研究を、最初に、各個々の酵素について行った。一旦、処方された添加剤を伴う凍結乾燥により各酵素が安定化され得ることが決定されたら、３つの酵素の混合物中の１つの湿潤酵素をこの酵素で置換する。再構成した乾燥酵素での湿潤酵素の置換を、最初に、１回に１つの酵素で、次いで１回に２つの酵素で、そして最終的に３つ全ての乾燥酵素で行った。乾燥した３つの酵素の混合物における各個々の酵素を活性についてアッセイしたが、保持された活性についての最実施例１〜４は、これらの酵素を含む溶液が、安定化剤の処方物に取り込まれ、続いて凍結乾燥を通して安定にされたプロセスを例示する。目的の３つの酵素の棚安定性の研究での第１段階として、実施例１は、本発明者らが湿潤酵素混合物安定化剤の凍結乾燥混合物を処方する能力を示す。実施例２は、再構成により凍結乾燥酵素混合物に回復した活性を与える、安定化混合物の能力を例示する。実施例３は、−20℃、４℃、22℃、37℃、50℃、および65℃の保存温度で１週間の凍結乾燥酵素混合物で設定した、短期間の安定性試験である。実施例４は、−20℃、４℃、22℃、37℃、および50℃の保存温度で３ヶ月間の凍結乾燥酵素混合物で設定した、長期間の安定性実験を詳述する。実施例１安定化処方物の調製凍結よりも上の温度での酵素または生物学的産物の貯蔵寿命を延長させる、改善された安定化処方物（および安定化するための方法）を見出すために研究を行った。 BSAおよび糖添加剤と組み合わせた個々の酵素の凍結乾燥実験を、上記の様に行った。試験した種々の還元糖および非還元糖は、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、コーンシロップ固体、およびFico であった。試験した緩衝液は、20〜50mMリン酸カリウム（pH7.4）、50mM HEPES （pH7.5）、および上記のユニバーサル緩衝液であった。表１は、ELGAゲルで最強のシグナルを示した、使用された添加剤の種々の組合せを示す（図１を参照のこと）。凍結乾燥混合物は、３つのグリセロール除去した酵素、6.7％（w/v）の最終濃度までのトレハロース、20％（v/v）の容積までのユニバーサル緩衝液、および表１に列挙した添加剤からなっていた。酵素は、２ユニットのAMV-RT、180ユニ式）の比で、総酵素容積が総混合物容積の約34％であるように添加した。添加剤を、凍結乾燥の前に安定化酵素混合物中に見出される最終濃度で列挙する。BSA および糖は重量／容積で添加され、一方緩衝液は、容積／容積で添加される。表１混合物添加剤１ 3mg/ml BSA/3％マルチトール/6.7％トレハロース/15mM HEPES pH7.5 ２ 3mg/ml BSA/3％マルチトール/10％トレハロース/15mM KPi pH7.4 ３ 3mg/ml BSA/3％マルチトール/10％トレハロース/15mM HEPES pH7.5 ４ 3mg/ml BSA/7.5％マルチトール/6.7％トレハロース/ユニバーサル緩衝液５ 3mg/ml BSA/3％マルチトール/6.7％トレハロース/ユニバーサル緩衝液６ 3mg/ml BSA/10.5％マルチトール/6.7％トレハロース/ユニバーサル緩衝液７ 3mg/ml BSA/7.5％ソルビトール/6.7％トレハロース/6mM KPI pH7.4 上に示す７つの組合せの凍結乾燥酵素混合物からの希釈していない反応産物および希釈した反応産物を、図１のレーン１〜14に示す。混合物３〜６（レーン５〜12）は、最強のシグナルを示す。それゆえ、最良の結果を与える添加剤は、二糖類誘導体マルチトール（３〜10.5％）およびBSA（3mg/ml最終濃度）と組み合わせた、二糖類トレハロース（６〜10％）であった。これらおよび他の結果から、最適の緩衝液は、ユニバーサル緩衝液であると決定された（図１を参照のこと）。この処方物は、それらの初期活性レベルを依然として保持した酵素の凍結乾燥混合物中に取り込まれ得た。実施例２３つの酵素の混合物を、BSA、マルチトール、トレハロース、デキストラン、およびユニバーサル緩衝液の安定化処方物を用いて作製した。グリセロール除去した酵素を、１反応物（20μｌ反応形式に調整する）あたり、1.6ユニットのAMV -RT、144ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.48ユニットのRNase Hの比で、総酵素容積を総混合物容積の約15％として添加した。BSAを3mg/ml（w/v）の最終濃度で、マルチトールを10.5％（w/v）の最終濃度で、トレハロースを10％（w /v）の最終濃度で、Dextran T-500を2.4％の最終濃度で、そしてユニバーサル緩衝液を容積まで添加した。湿潤酵素混合物は、１反応物あたり2.5μｇBSAを伴って、２ユニットのAMV-RT、180ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.6ユニットのRNase Hからなっていた。グリセロール除去した混合物を急速凍結し、そして凍結乾燥した。再構成後、これは、１反応物あたり、10³、10²、および10¹の投入分子の標的RNAを増幅する、湿潤酵素混合物と同じ能力を示した（図２を参照のこと）。レーン１は、標的を含まない（NT）、つまりネガティブコントロールである。レーン２は、10¹標的分子の投入で最強のシグナルを与えた反応物の検出物、つまりゲルコントロールである。レーン３〜６は、10³標的分子投入を用いる、複製反応物である。レーン７〜10は、10²標的分子投入を用いる、複製反応物である。レーン11〜14は、４つの反応物のうち３つで最強のシグナルを示10¹コピーのHIV-1 RNAの投入が、ポジティブな反応結果を検出する、50％の確率を生じると予測されることに留意されたい。）評価を、ELGAゲル上のバンド強度を得点付けすることにより、定性的に行なった。それゆえ、この酵素混合物がった。これらの知見の結果、続いての安定性実験の全ては、この凍結乾燥試行からのサンプルおよび10²投入コピーのHIV-1 RNAを用いた。実施例３ BSA、マルチトール、トレハロース、デキストラン、およびユニバーサル緩衝液の存在下で凍結乾燥した酵素混合物で安定性試験を行った。混合物中の酵素の比は、1.6ユニットのAMV-RT、144ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.48ユニットのRNase Hの比であり、総酵素容積は総混合物容積の約15％であった。BSA を３mg/ml（w/v）の最終濃度で、マルチトールを10.5％（w/v）の最終濃度で、トレハロースを10％（w/v）の最終濃度で、Dextran T-500を2.4％の最終濃度で、そしてユニバーサル緩衝液を容積まで添加した。サンプルを、６つの温度で保存した：−20℃、４℃、22℃、37℃、50℃、または65℃。凍結乾燥した球を含む 12個のチューブを、これらの温度のそれぞれに置き、そして１週間のインキュベーションの後に評価のためにサンプルを取り出した。−20℃で保存した参照の湿潤酵素混合物は、１反応物あたり2.5μｇBSAを伴って、２ユニットのAMV-RT、180 ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.6ユニットのRNase Hからなっていた。３を参照のこと）が、シグナル強度は全ての２連の反応物で再現性があるわけではなかった。レーン１は、標的なし（NT）コントロールの反応産物を示す。レーン２は、10²標的投入で最強のシグナルを示した反応物のゲルコントロールである。レーン３〜４は、−20℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン５〜６は、４℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン７〜８は、22 ℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン９〜10は、37℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン11〜12は、50℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、そしてレーン13〜14は、65℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルである。湿潤酵素混合物を用いた２連の反応物は、レーン15〜16に示すように、さらなるポジティブ反応コントロールである。コントロール研究をまた行なった。この研究は、湿潤50％グリセロール酵素混合物が、50℃にて１日間、37℃ にて２日間、または22℃にて５日間の後に、10³投入分子の標的RNAを増幅する活性の全てを失ったことを示す（データは示さず）。実施例４酵素混合物を、BSA、マルチトール、トレハロース、デキストラン、およびユニバーサル緩衝液の存在下で凍結乾燥した。グリセロール除去された酵素を、１反応物あたり、1.6ユニットのAMV-RT、144ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.48ユニットのRNase Hの比で、総酵素容積を総混合物容積の約15％として添加した。BSAを３mg/ml（w/v）の最終濃度で、マルチトールを10.5％（w/v）の最終濃度で、トレハロースを10％（w/v）の最終濃度で、Dextran T-500を2.4％の最終濃度で、そしてユニバーサル緩衝液を容積まで添加した。湿潤標準酵素混合物は、１反応物あたり、1.6ユニットのAMV-RT、144ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および0.48ユニットのRNase Hからなっていた。サンプルを、５つの温度で保存した：−20℃、４℃、22℃、37℃、または50℃（65℃で２週間の保存後、NA ての温度で３ヶ月間保存したサンプル中で検出した（図４を参照のこと）。レーン１は、標的なし（NT）コントロールの反応産物を示す。レーン２は、10²分子の標的投入で強いシグナルを示した反応物のゲルコントロールである。レーン３〜４は、−20℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン５〜６は、４ ℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン７〜８は、22℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、レーン９〜10は、37℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルであり、そしてレーン11〜12は、50℃で保存した２連の凍結乾燥サンプルである。標準酵素混合物を用いた２連の反応物は、レーン13〜16に示すように、さらなるポジティブ反応コントロールである。本発明の安定化処方物はまた、種々の任意の酵素、酵素的に活性なそのフラグメント、または他の生物学的物質（例えば、熱不安定性のタンパク質、抗体、増殖因子、サイトカイン、レセプター、ペプチドホルモンなど）とともに使用されるように、酵素を含まない（水性または乾燥した）ストック安定化処方物として調製され得る。これらの全ては本発明により包含される。本発明は例示のために、そして特定の実施例および実施態様を参照して記載した。しかし、本出願は、当業者に明らかであり、かつ請求の範囲の精神および範囲から逸脱せずに当業者により行われ得る変更および置換をカバーすることを意図する。本明細書中に引用される全ての参考文献は、参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者デラクルズ，ノーバートビー. アメリカ合衆国ウィスコンシン 53226, ワウワトサ，ダブリュー．メイネックアベニュー 11118 (72)発明者ウィルコズ，リチャードケイ. アメリカ合衆国ウィスコンシン 53151, ニューバーリン，ビー．コーチライトドライブ 1715

Claims

【特許請求の範囲】１．凍結温度よりも上での乾燥相での保存のために１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを安定化するための改善された方法であって、該方法は、以下の工程： (i)酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを、キャリアタンパク質、約３％ w/v〜約15％ w/vの１以上の二糖類、約１％ w/v〜約10％ w/vの１以上の二糖類誘導体、約０％w/v〜約10％ w/vの１以上の糖重合体、および適合性の緩衝液を組合せて含む水性安定化溶液と組み合わせ、それにより混合物を生じる工程； (ii)工程(i)で得られた該混合物を凍結する工程；および (iii)工程(ii)で得られた該凍結混合物を、実質的に水を含まなくなるまで凍結乾燥して、それによって安定化酵素処方物が得られる工程、を包含する、方法。２．前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項１に記載の方法。３．ウシ血清アルブミンの濃度が、約３mg/mlである、請求項２に記載の方法。４．前記二糖類および二糖類誘導体が、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。５．前記二糖類が、トレハロースである、請求項４に記載の方法。６．トレハロースが、約６％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項５に記載の方法。７．前記二糖類誘導体が、マルチトールである、請求項４に記載の方法。８．マルチトールが、約３％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項７に記載の方法。９．前記糖重合体が、デキストランである、請求項１に記載の方法。１０．デキストランが、約２％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項９に記載の方法。１１．前記緩衝液が、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。１２．前記緩衝液が、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mM ジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Trit １３．前記酵素が、T7 RNAポリメラーセ、AMV-逆転写酵素、RNase H、室温で不安定であることが公知の他の酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。１４．凍結乾燥に適切な水性処方物を生成する際の使用のための混合物であって、以下： (i)キャリアタンパク質； (ii)約３％（w/v）〜約15％（w/v）の１以上の二糖類； (iii)約１％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の二糖類誘導体； (iv)約０％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の糖重合体；および (v)適合性の緩衝液、を含む、混合物。１５．前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項１４に記載の混合物。１６．ウシ血清アルブミンの濃度が、約3mg/mlである、請求項１５に記載の混合物。１７．前記二糖類および二糖類誘導体が、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体からなる群より選択される、請求項１４に記載の混合物。１８．前記二糖類が、トレハロースである、請求項１７に記載の混合物。１９．トレハロースが、約６％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項１８に記載の混合物。２０．前記二糖類誘導体が、マルチトールである、請求項１７に記載の混合物。２１．マルチトールが、約３％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項２０に記載の混合物。２２．前記糖重合体が、デキストランである、請求項１４に記載の混合物。２３．デキストランが、約２％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項２２に記載の混合物。２４．前記緩衝液が、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１４に記載の混合物。２５．前記緩衝液が、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mM ジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Trit ２６．前記酵素または酵素的に活性なそのフラグメントが、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-逆転写酵素、RNase H、室温で不安定であることが公知の他の酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１４に記載の混合物。２７．１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントの安定化混合物であって、以下の工程： (i)１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを、キャリアタンパク質、約１％(w/v)〜約10％(w/v)の１以上の二糖類誘導体、約３％(w/v)〜約15 ％(w/v)の1以上の二糖類、約０％〜約10％の１以上の単糖重合体、および適合性の緩衝液を組合せて含む水性安定化溶液と組み合わせ、それにより混合物を生じる工程； (ii)該混合物を凍結する工程；および (iii)該凍結混合物を、実質的に水を含まなくなるまで凍結乾燥して、それによって該１以上の酵素の安定化混合物が得られる工程、を包含する方法により生成される、安定化混合物。２８．前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項２７に記載の安定化混合物。２９．ウシ血清アルブミンの濃度が、約3mg/mlである、請求項２８に記載の安定化混合物。３０．前記二糖類および二糖類誘導体が、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体からなる群より選択される、請求項２７に記載の安定化混合物。３１．前記二糖類が、トレハロースである、請求項３０に記載の安定化混合物。３２．トレハロースが、約６％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項３１に記載の安定化混合物。３３．前記二糖類誘導体が、マルチトールである、請求項３０に記載の安定化混合物。３４．マルチトールが、約３％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項３３に記載の安定化混合物。３５．前記糖重合体が、デキストランである、請求項３０に記載の安定化混合物。３６．デキストランが、約２％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項３５に記載の安定化混合物。３７．前記緩衝液が、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２７に記載の安定化混合物。３８．前記緩衝液が、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mM ジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Trit ３９．前記酵素または酵素的に活性なそのフラグメントが、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-逆転写酵素、RNase H、室温で不安定であることが公知の他の酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２７に記載の安定化混合物。４０．凍結温度より上の乾燥相での保存のために、１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを安定化するために有用な水性処方物であって、該処方物が以下： (i)水相； (ii)キャリアタンパク質； (iii)約１％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の二糖類誘導体； (iv)約３％（w/v）〜約15％（w/v）の１以上の二糖類； (v)約０％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の単糖重合体；および (vi)適合性の緩衝液、を組み合わせて含む、水性処方物。４１．前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項４０に記載の処方物。４２．ウシ血清アルブミンの濃度が、約3mg/mlである、請求項４１に記載の処方物。４３．前記二糖類および二糖類誘導体が、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体からなる群より選択される、請求項４０に記載の処方物。４４．前記二糖類が、トレハロースである、請求項４３に記載の処方物。４５．トレハロースが、約６％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項４４に記載の処方物。４６．前記二糖類誘導体が、マルチトールである、請求項４３に記載の処方物。４７．マルチトールが、約３％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項４６に記載の処方物。４８．前記糖重合体が、デキストランである、請求項４０に記載の処方物。４９．デキストランが、約２％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項４８に記載の処方物。５０．前記緩衝液が、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４０に記載の処方物。５１．前記緩衝液が、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mM ジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Trit５２．１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメントを安定化するために有用な水性酵素処方物であって、水相と以下： (i)キャリアタンパク質； (ii)約１％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の二糖類誘導体； (iii)約３％（w/v）〜約15％（w/v）の１以上の二糖類； (iv)約０％〜約10％の１以上の単糖重合体； (v)適合性の緩衝液；および (vi)１以上の酵素または酵素的に活性なそのフラグメント、とを組み合わせる工程を含む方法によって生成される、処方物。５３．前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項５２に記載の処方物。５４．ウシ血清アルブミンの濃度が、約3mg/mlである、請求項５３に記載の処方物。５５．前記二糖類および二糖類誘導体が、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体からなる群より選択される、請求項５２に記載の処方物。５６．前記二糖類が、トレハロースである、請求項５５に記載の処方物。５７．トレハロースが、約６％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項５６に記載の処方物。５８．前記二糖類誘導体が、マルチトールである、請求項５５に記載の処方物。５９．マルチトールが、約３％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項５８に記載の処方物。６０．前記糖重合体が、デキストランである、請求項５２に記載の処方物。６１．デキストランが、約２％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項６０に記載の処方物。６２．前記緩衝液が、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５２に記載の処方物。６３．前記緩衝液が、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mM ジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Trit ６４．前記酵素または酵素的に活性なそのフラグメントが、T7 RNAポリメラーゼ、AMV-逆転写酵素、RNase H、室温で不安定であることが公知の他の酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５２に記載の処方物。６５．凍結温度よりも上の乾燥相での保存のための、１以上の酵素または酵素学的に活性なそのフラグメントの、実質的に水を含まず、そして安定化された処方物であって、以下の工程： (i)キャリアタンパク質、約１％（w/v）〜約10％（w/v）の１以上の二糖類誘導体、約３％（w/v）〜約15％（w/v）の１以上の二糖類、約０％〜約10％の１以上の単糖重合体、所定量の１以上の酵素または１以上の酵素的に活性なそのフラグメント、および適合性の緩衝液を水相中で組合わせ、それにより所定容積の溶液を得る工程； (ii)該溶液を凍結する工程；および (iii)該凍結溶液を、実質的に水を含まなくなるまで凍結乾燥して、それにより、実質的に水を含まず、そして安定化された処方物が得られる工程、を包含する方法により生成される、処方物。６６．前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項６５に記載の処方物。６７．ウシ血清アルブミンの濃度が、約３mg/mlである、請求項６６に記載の処方物。６８．前記二糖類および二糖類誘導体が、トレハロース、スクロース、マルチトール、マンニトール、コーンシロップ固体、ソルビトール、およびスクロースの分枝重合体からなる群より選択される、請求項６５に記載の処方物。６９．前記二糖類が、トレハロースである、請求項６８に記載の処方物。７０．トレハロースが、約６％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項６９に記載の処方物。７１．前記二糖類誘導体が、マルチトールである、請求項６８に記載の処方物。７２．マルチトールが、約３％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項７１に記載の処方物。７３．前記糖重合体が、デキストランである、請求項６８に記載の処方物。７４．デキストランが、約２％（w/v）〜約10％（w/v）で存在する、請求項７３に記載の処方物。７５．前記緩衝液が、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６５に記載の処方物。７６．前記緩衝液が、本質的に、2.92mMリン酸カリウム(pH7.2)、4.14mMリン酸カリウム(pH7.5)、1.28mM Tris-HCl(pH7.5)、20.7mM NaCl、19.2mM KCl、0.51mM ジチオトレイトール、0.66mM EDTA、1.28mM Mg-アセテート、および0.03％ Trit