JP6349452B1

JP6349452B1 - Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物

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Publication number: JP6349452B1
Application number: JP2017228920A
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Abstract

【課題】Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを含む、１年以上の長期にわたって保管しても安定なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物を提供する。【解決手段】Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有する乾燥組成物、好ましくは凍結乾燥物とする。二糖類の好ましい例は、ラクトースである。また好ましくは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕあたりの二糖類の含有量は０．５〜５０ｍｇである。【選択図】なし

Description

本発明はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含む乾燥組成物に関する。

Ｌ−グルタミン酸は、「うま味」成分の一つして知られており、ナトリウム塩であるＬ−グルタミン酸ナトリウムはうま味調味料の主成分として用いられている。また、Ｌ−グルタミン酸は、動物の体内でグルタミン酸受容体を介しての神経伝達を行う興奮性の神経伝達物質としても機能している。そのため、Ｌ−グルタミン酸を検出・定量することは食品や生化学の分野において非常に重要である。

本出願人は、１９８３年にアミノ酸の酸素吸収酵素の探索研究によって、Streptomyces属の菌の一種がＬ−グルタミン酸特異的に作用する酵素Ｌ−グルタミン酸オキシターゼを産生することを見いだし（非特許文献１）、研究用試薬として製品化に成功している。さらに本酵素を用いて、Ｌ−グルタミン酸を簡単に測定できる方法を開発し、Ｌ−グルタミン酸測定キットとして市販している（非特許文献２及び３）。また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを酸素電極に固定化したL-グルタミン酸センサーを発表している（非特許文献４）。これらの商品開発と研究によって、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを用いる比色測定キットとバイオセンサが広く使われるようになり、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼは産業上きわめて高い価値をもつようになった。

キットやセンサーに用いられる原料酵素は、一般に乾燥組成物として流通していることが多い。その理由としては、製品が軽く体積が小さいため保管や輸送に適していること、微生物汚染による腐敗の心配がないこと、溶解時に溶解濃度や緩衝液の種類を使用目的に応じて自由に選択できること、溶液状態と比較してより安定であること、等の利点が挙げられる。

一方、酵素によっては、低濃度の溶液状態や、高濃度の補酵素の共存下等では活性が低下するという問題があり、酵素を安定化するための手段が検討されてきた。例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに、糖もしくは糖アルコールを添加する例（特許文献１）がある。特許文献１においては、１８種類の糖もしくは糖アルコールを添加した凍結乾燥品の安定性試験を実施しており、該凍結乾燥品を室温にて２週間放置した後の残存活性が８５％前後であった旨が記載されている。また、グルタミン酸脱水素酵素に、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下で、(1)α−ケトグルタール酸及び／又はＬ−グルタミン酸、及び／又は(2)糖、糖アルコール、アミノ酸又はその塩、及び有機酸又はその塩からなる群から選ばれた１種あるいは２種以上の化合物を添加する例（特許文献２）、乳酸オキシダーゼに、糖類、糖アルコール類、アミノ酸類、オリゴペプチド類、タンパク質類よりなる群から選ばれるいずれか１つ以上の化合物及び／又は界面活性剤を添加する例（特許文献３）、コレステロールオキシダーゼに、ウシ血清アルブミン及び糖類及びアミノ酸からなる群から選択された少なくとも１種を添加する例（特許文献４）等が知られている。

特開昭57-118790号公報特開昭56-035985号公報特開2011-120500号公報特開平08-187095号公報

Agric. Biol. Chem., 47（6）；1323,1983 Agric. Biol. Chem., 48（1）；181,1984 日本醤油研究所雑誌、13（1）；8,1987 Third European Congress on Biotechnology, Vol I, P705, 1984

しかし、目的とする酵素と安定化剤の組合せによりどれほどの安定化効果が得られるかを事前に予測することは難しく、安定化剤の探索は、経験則的に行われているのが実情である。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼにおいても、これまでに凍結乾燥品が流通していたものの、安定化剤として添加される化合物については検討がなされておらず、安定化剤としてどの化合物が最適であるかは明らかとなっていなかった。

したがって、本発明の課題は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び安定化剤を含む、安定性の高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物を提供することである。また、産業上用いるためには、当該組成物は１年以上の長期にわたって保管しても安定に、例えば保管前に比較して９０％以上の、活性を有することが要求される。

本発明者らは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物の保存安定性を向上させるべく、種々の物質を検討した。鋭意検討した結果、糖アルコールと多糖類は安定化剤として求める水準に達しなかった一方で、二糖類は非常に優れた保存安定性向上能をもつことから、安定化剤として二糖類が最も適していることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。

本発明は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及びラクトースを含有することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ凍結乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及びラクトースを含有することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ凍結乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕあたりの二糖類の含有量が、０．５〜５０ｍｇである、上記のいずれかの、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物、又はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ凍結乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有し、−２０℃の冷凍条件下で１年間保管された後のＭＢＴＨ法によって測定される活性値が保管前の９５％以上であることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及びラクトースを含有し、−２０℃の冷凍条件下で１年間保管された後のＭＢＴＨ法によって測定される活性値が保管前の９５％以上であることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物に関するものである。

また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物から水分を除去し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有する乾燥組成物とすることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの保存安定性の向上方法に関するものである。

本発明の乾燥組成物は、３７℃で２週間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上でありうる。あるいは、−２０℃で４週間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上でありうる。あるいは、−２０℃で１年間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上でありうる。あるいは、−２０℃で５年間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上でありうる。あるいは、−２０℃で８年間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上でありうる。

本発明により、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの乾燥組成物、特に凍結乾燥製品の取扱い性を向上させることができる。

−２０℃条件下にて保管した、ラクトース含有Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ凍結乾燥組成物の活性値の推移を示したものである。

本発明は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物に関する。

［乾燥組成物］
（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ）
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼは、次の反応を触媒する酵素である。
Ｌ−グルタミン酸＋Ｏ₂＋Ｈ₂Ｏ→α−ケトグルタル酸＋Ｈ₂Ｏ₂＋ＮＨ₃
本発明に用いるＬ−グルタミン酸オキシダーゼは、目的の活性を十分に有する限り特に限定されず、種々のＬ−グルタミン酸オキシダーゼを用いることができる。好ましい例は、特公昭６１−２６３５７号に開示されているStreptomyces sp.X-119-6（ＡＣＴＴ３９３４３）に由来するＬ−グルタミン酸オキシダーゼである。

（二糖類）
本発明者の検討によると、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥物は、二糖類を含有することにより、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの活性を保存期間中も安定に維持することができる。このような効果を奏するために本発明に用いる二糖類の例としては、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソトレハロース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ネオラクトース、ガラクトスクロース、シラビオース、ルチノース、ルチヌロース、ビシアノース、キシロビオース、プリメベロース等が挙げられる。上記二糖類の中でも、酵素反応に影響を与えず、比較的低温で、かつＬ−グルタミン酸オキシダーゼが安定なｐＨにおいて溶解性が優れるもの、例えばスクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、イソマルトースが好ましく、ラクトース、マルトースがより好ましく、ラクトースがさらに好ましい。二糖類としては、複数の二糖類を混合したものを用いてもよい。

（他の成分）
本発明の乾燥組成物は、上記Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類のほか、他の添加剤、例えば賦形剤、緩衝剤、溶解補助剤、保存剤、防腐剤等を１種又は２種以上を含有してもよい。

本発明の乾燥組成物はＬ−グルタミン酸オキシダーゼの活性安定化のために配合される二糖類の他に、他の賦形剤を含有してもよい。二糖類以外の賦形剤の例としては、グルコース、マルチトール、マンニトール、リボース、キシロース、ガラクトース、ソルビトール、マルトトリオース、フルクトース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、フィコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド等が挙げられる。乾燥組成物はまた、緩衝剤として、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を含有してもよい。

（含有量）
本発明の乾燥組成物に含有されるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの量は、０．１〜６０質量％が好ましく、１〜３０質量％がより好ましく、５〜１５質量％がさらに好ましい。

また本発明の乾燥組成物に含有される二糖類の量は、１〜９５質量％が好ましい。また、１０〜８０質量％がより好ましく、５０〜７５質量％がさらに好ましい。この範囲であれば、十分な安定性効果が得られ、また乾燥組成物の性状が良好だからである。

乾燥組成物に含有される二糖類の量は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕに対し、０．１０〜１５０ｍｇとすることができる。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼをより長期間安定化できるとの観点からは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕに対し、０．５０ｍｇ以上であることが好ましく、１．０ｍｇ以上であることがより好ましく、１．６ｍｇ以上であることがより好ましい。また乾燥組成物に含有される二糖類の量は、二糖類は吸湿性であるため、組成物の乾燥状態を良好に保つとの観点からは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕに対し、５０ｍｇ以下であることが好ましく、３０ｍｇ以下であることがより好ましく、１５ｍｇ以下であることがさらに好ましい。

（乾燥組成物）
本出願においてＬ−グルタミン酸オキシダーゼを含む組成物に関し、「乾燥組成物」というときは、少なくともＬ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とが溶解されている溶液を乾燥することにより得られる乾燥状態の組成物をいい、二糖類を含まない乾燥状態のＬ−グルタミン酸オキシダーゼと、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを含まない乾燥状態の二糖類とが単に混合されたものではない。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物は、「（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類との）溶液の乾燥組成物」と換言することができる。

本発明の乾燥組成物は、スプレードライ乾燥組成物であってもよく、凍結乾燥組成物であってもよい。

なお、「乾燥組成物」又は「（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類との）溶液の乾燥組成物」の特徴を、組成物の構造又は特性により直接特定することは不可能である。第一に、乾燥組成物を調製するに際しては、二糖類とともに溶解された状態のＬ−グルタミン酸オキシダーゼの溶液から溶媒が除かれるが、その際にはＬ−グルタミン酸オキシダーゼ分子の周囲及び立体構造の内部には、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼより低分子である二糖類が結合した状態になると考えられる。このような状態を、別々に調製された乾燥状態のＬ−グルタミン酸オキシダーゼと乾燥状態の二糖類とを単に混合した状態とを区別して明確に特定する表現は存在しない。またそのような状態を、機器分析することにより特定することは、本願出願時における当業者における一般的な技術水準からして、不可能であるといえる。

（組成物の特徴、その他）
本発明者の検討によると、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼは二糖類と共に乾燥物とすることにより、長期に保存された場合であっても、活性が維持されうる。したがって、本願により、別の態様として、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有し、活性が安定化されていることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物が提供される。活性が安定化されているとは、３７℃で２週間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上であることをいう。あるいは、−２０℃で４週間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上であることをいう。あるいは、−２０℃で１年間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上であることをいう。あるいは、−２０℃で５年間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上であることをいう。あるいは、−２０℃で８年間保管された後の活性値が、保管前の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上であることをいう。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの酵素活性は、後述するように、酸素電極法、及びＭＢＴＨ法によって測定することができるが、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの安定化の程度を表す際は、特に記載した場合を除き、ＭＢＴＨ法による測定値に基づく。

本発明者の検討によると、二糖類によるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの安定化効果は、多糖類や糖アルコールより大きい。具体的には、多糖類であるデキストランは、タンパク質の凍結乾燥の際の安定化剤として比較的よく用いられているが、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物において用いた場合、所定の条件での保存後の残存活性率が８３．１％となり、既存の糖を用いた糖質関連酵素の安定化法と同程度であり、この安定化の程度は、試験した範囲では、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼに対するデキストランの量を変えても、改善されなかった。また、糖アルコールであるマンニトールをＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物において用いた場合は、所定の条件での保存後の活性値が半減し、安定化効果は得られなかった。

前掲特許文献１においては、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの安定化のために、糖又は糖アルコールを添加することを提案するが、１８種類の糖又は糖アルコールそれぞれを添加した凍結乾燥品の室温で２週間保存した後の活性値は８５％前後であった。また前掲特許文献１の記載からは、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対して用いた中で目的の効果が比較的高いのは、糖アルコール（具体的には、ソルビトール、マンニトール、及びイノシトール）であると理解される。このようなβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する安定化傾向と、本願によって開示される二糖類によるＬ−グルタミン酸オキシダーゼに対する安定化傾向は異なっているといえる。したがって、二糖類による、特にラクトースによるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの安定化効果は、従来技術から予想することは極めて困難な、本願によって初めて開示される効果であるといえる。

［乾燥組成物の製造方法］
本発明の乾燥組成物は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む、水性組成物を得る工程、及び得られた水性組成物から水分を除去し、乾燥組成物を得る工程を含む製造方法により、製造することができる。

（水性組成物を得る工程）

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物は、添加の順序は特に限定されないが、例えば、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを含む液に二糖類を添加することによって調製することができる。水性組成物とは、水性溶媒（例えば水）に成分を含有させた液状の組成物をいう。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼは、公知の方法により、例えば、非特許文献１あるいはＷＯ２００１／０７９５０３に記載された方法により、製造することができる。生産宿主は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを保有する野生株でもよく、大腸菌、放線菌等の生産に適した宿主を外来のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ遺伝子により形質転換した菌体であってもよい。また、発現ベクターを利用した効率的な生産や、融合タンパク質等を結合させての生産も可能である。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ生産菌体の培養条件は、炭素源、窒素源、通気条件、撹拌条件等、特に限定されない。用いる宿主に適した培養条件を用いればよい。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを得るために、必要に応じて膜分離や遠心分離を用いた菌体回収、超音波処理やフレンチプレス処理、リゾチーム処理等による菌体破砕、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノール等の溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理等を組み合わせた単離精製を行うことも可能である。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物は、緩衝剤を含むことにより、ｐＨが調製されていてもよい。緩衝剤としては、ｐＨ５．５〜９．０の範囲で緩衝能を有するものであれば好適に用いることができる。また緩衝剤としては、続く乾燥工程で成分が揮発しないものであることが好ましい。このような緩衝剤の例として、ホウ酸、トリス塩酸、及びリン酸カリウム等の緩衝剤、並びにＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。また、フタル酸、マレイン酸、グルタル酸等のようなジカルボン酸をベースとした緩衝剤も挙げることができる。これらのうち１種のみを適用してもよいし、２種以上を用いてもよい。さらには上記以外を含む１種以上の複合組成であってもよい。また、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤、及び、又は、界面活性剤を含んでいてもよい。これらは、種々の市販の試薬を用いて調製することができる。

好ましい態様においては、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物はリン酸カリウムにより緩衝される。そのｐＨは６．５〜８．０が好ましく、７．０〜７．８がより好ましい。緩衝液の濃度は、続く乾燥工程において濃縮されることによるタンパク質の安定性への影響を避け、また凍結乾燥を行う際には凍結溶液の臨界温度低下を避けるとの観点からは、比較的低濃度であることが好ましい。例えば、１００ｍＭ以下であり、より好ましくは５０ｍＭ以下である。緩衝液の濃度の下限は、緩衝能を有する限り特に限定されないが、例えば５ｍＭ以上であり、好ましくは１０ｍＭ以上である。また、このような濃度の緩衝液を用いたとき、乾燥組成物中の緩衝液成分の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜８０質量％の範囲である。

水性組成物におけるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの含有量は、１ｍＬあたりの酵素活性として１０〜５００Ｕ／ｍＬが好ましく、２５〜３００Ｕ／ｍＬがより好ましい。この範囲であれば、乾燥工程での回収率が高く、また得られた乾燥組成物が取り扱いやすい形状になるからである。さらにこの範囲であれば、タンパク質の高次構造を保持しつつ、効率的に乾燥できるからである。

水性組成物における二糖類の含有量は、目的の乾燥組成物においてＬ−グルタミン酸オキシダーゼの安定化効果を発揮できる限り、適宜とすることができる。例えば、水性組成物における二糖類の濃度は、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬとすることができる。得られる乾燥組成物の取り扱い性が良好であるとの観点からは、３〜２５ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、５〜１５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物の調製は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが安定である温度において行うことができる。そのような温度は、例えば２〜４０℃であるが、環境温度において行うこともできる。得られた水性組成物は、速やかに次の乾燥工程に供することが好ましい。

（乾燥工程）
得られた水性組成物は次いで、水分を除去し、乾燥組成物を得る工程に供される。水分除去は、公知の方法に従って行えばよい。例えば、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物から有機溶媒を用いて含有成分を析出させ、乾燥粉末とする方法、水性組成物を噴霧し、熱風を当てて乾燥させるスプレードライ法、水性組成物を凍結し、減圧下で乾燥する凍結乾燥法等が挙げられるが、これらに限定されない。熱による変性の影響を受けにくく、得られる乾燥組成物の水への溶解性が良好である等の点からは、凍結乾燥法が好ましい。

凍結乾燥を行う場合、前の工程から得られた水性組成物は凍結されるが、凍結のための温度は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼが安定であれば、適宜とすることができ、例えば−９０〜−１０℃である。

乾燥、又は凍結乾燥のための設備は従来のものを用いることができ、また条件は従来の酵素製剤を調製する際の条件を適宜応用することができる。凍結乾燥の場合、特に限定されないが、例えば、真空度は１〜２００Ｐａとすることができ、５〜１３０Ｐａとすることが好ましく、また乾燥温度は２０〜６０℃とすることができる。

［用途、その他］

（酵素活性の測定方法）
本発明のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物におけるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの酵素活性（至適条件下、３０℃で毎分１μｍｏｌの基質を変化させることができる量が１Ｕと定義される。）は、酸素電極法、及びＭＢＴＨ法によって測定することができる。

酸素電極法とは、酵素活性不明の検体酵素液をＬ−グルタミン酸基質溶液に加え、溶液中の酸素濃度変化を測定し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの反応による酸素消費速度を算出することで、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの酵素活性を測定する方法である。

ＭＢＴＨ法とは、以下に記載する手順によって、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩一水和物（ＭＢＴＨ）を用いるα−ケト酸を測定する方法である。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの反応生成物であるα−ケトグルタル酸を、このＭＢＴＨ法により測定することにより、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ活性を測定することができる。

（１）０．７ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．４、０．１ｍＬの３００Ｕ／ｍＬカタラーゼ、０．１ｍＬの１００ｍＭＬ−グルタミン酸ナトリウム標準溶液を混合し、反応液Ａとする。
（２）反応液Ａ０．９ｍＬを３０℃、５分加熱したのちに、酵素活性不明の検体酵素液を０．１ｍＬ添加し、反応を開始する。
（３）被験酵素液を加えてから、３０℃で正確に２０分間反応させた後、０．１ｍＬの２５％ＴＣＡを加えて反応停止する。
（４）反応停止液に１．９ｍＬの１．０Ｍ酢酸バッファーｐＨ５．０及び０．８ｍＬの０．１％ＭＢＴＨ水溶液を添加し、５０℃で３０分間反応させる。
（５）当該溶液を室温で２０分間放置した後、水を対照としてゼロ補正した分光光度計（シングルビーム）で、ＯＤ３１６ｎｍを測定する。
（６）別途、標準α−ケトグルタル酸溶液１．０ｍｌを用いて、上記（３）〜（４）の方法で検量線を作成する。

対照として、被験酵素液の替わりに２０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．４を０．１ｍＬ添加して、（１）〜（５）と同様に反応した液のＯＤ３１６ｎｍを引いた差分により、３０℃で２０分間に生成したα−ケトグルタル酸の量を求めることができる。

（用途）
本発明により得られたＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物は、Ｌ−グルタミン酸測定キット、及びＬ−グルタミン酸オキシダーゼを測定するための酵素センサーにおいて、有効に使用することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本願発明が実施例に限定されないことは明らかである。

［実施例１：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの安定化効果を有する化合物の探索］
非特許文献１に記載の方法によって取得したＬ−グルタミン酸オキシダーゼの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．４溶液を、１ｍＬあたりのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ酵素活性量が４００Ｕ／ｍＬとなるように調整した。当該酵素液へ、二糖類であるラクトース、多糖類であるデキストラン４０、及び糖アルコールであるマンニトールを同緩衝液で溶解した各２０ｍｇ／ｍＬ溶液を加え、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの活性量を２００Ｕ／ｍＬ、各安定化剤の最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとした。これを凍結乾燥用バイアルビンへ１ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行った。サンプルは、各濃度５本ずつ調製した。

この凍結乾燥品を３７℃で２週間保管した後に、水で溶解して推定１００Ｕ／ｍＬになるように調整した。さらに、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．４で希釈して推定１０Ｕ／ｍＬとし、これを酸素電極法によって活性を測定した。

試験の結果は表１のようになった。なお酵素の相対活性値の比較対象は、全条件の凍結乾燥後−４０℃保管サンプルの平均活性値である。凍結乾燥後−４０℃保管サンプルの平均活性値は９．３３（Ｕ／ｍＬ）であり、添加化合物間で活性値及びばらつきに差は見られなかった。

ラクトースを添加した組成物においては活性の低下が見られず、きわめて良好な安定性を示した。また同様の安定性を、凍結乾燥前の水性組成物におけるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの活性量１００〜３００Ｕ／ｍＬ、ラクトースの最終濃度を５〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲で確認した。

一方、デキストラン４０を添加した組成物に関しては、残存活性率が８３．１％となり、既存の糖を用いた糖質関連酵素の安定化法と同程度の安定性であった。凍結乾燥前の水性組成物におけるＬ−グルタミン酸オキシダーゼの活性量１００〜３００Ｕ／ｍＬ、デキストラン４０の最終濃度を５〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲で確認したが、その値を超える残存活性率は得られなかった。

マンニトールを添加した組成物においては、試験後の活性値が半減しており、組成物が不安定であることが分かった。

いずれの凍結乾燥品においても、取扱い性に関しては良好であり、産業上利用するにあたり障害となるような性状は観察されなかった。

［実施例２：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ長期安定性試験］
取得したＬ−グルタミン酸オキシダーゼの、長期安定性を試験した。
前掲ＷＯ２００１／０７９５０３号に記載の方法によって取得したＬ-グルタミン酸オキシダーゼの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．４溶液を、１ｍＬあたりのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ酵素活性量が２５Ｕ／ｍＬ、ラクトース濃度が７ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。当該希釈液を凍結乾燥用バイアルビンへ１ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行った。当該凍結乾燥品を−２０℃にて保管し、最大８年７か月までの長期安定化試験を実施した。各酵素活性は、ＭＢＴＨ法によって測定した。

長期安定性試験の結果は図１及び表２のようになった。取得された組成物は、驚くべきことに常に保管前の９７％以上の活性を有しており、８年の長期保管後においても保管前の９９％の活性を保持していた。

本発明のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物は、従来報告されたことのないほど顕著な安定性を示し、取扱いに優れる。本発明により、取扱い性、安定性が向上したＬ−グルタミン酸オキシダーゼ組成物が提供される。

Claims

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕあたりの二糖類の含有量が、０．５〜５０ｍｇであることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物。
凍結乾燥物である、請求項１に記載のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物。
二糖類がラクトースである、請求項１又は２に記載のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物。
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕあたりの二糖類の含有量が、１．６〜１５ｍｇである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の乾燥組成物。
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕあたりの二糖類の含有量が、０．５〜５０ｍｇであり、−２０℃の冷凍条件下で1年間保管された後のＭＢＴＨ法によって測定される活性値が保管前の９５％以上であることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物。
二糖類がラクトースである、請求項５に記載のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物。
下記の工程を含む、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ乾燥組成物の製造方法：
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含み、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１００Ｕあたりの二糖類の含有量が、０．５〜５０ｍｇである水性組成物を得る工程、及び
得られた水性組成物から水分を除去し、乾燥組成物を得る工程。
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼと二糖類とを含む水性組成物から水分を除去し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及び二糖類を含有する乾燥組成物とすることを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの保存安定性の向上方法。