JP2008266212A - タンパク質含有水溶液の溶状を安定化する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法であって、従来法と異なり目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法と、それによって濁り発生が抑制された組成物を提供する。
【解決手段】
目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させる、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な、タンパク質水溶液の濁り抑制方法および組成物に関する。

タンパク質を実用化するに際し、その水に対する溶解性の低さが欠点となるケースが少なからず見受けられる。タンパク質を構成するアミノ酸には、トリプトファンやフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンなどの疎水性アミノ酸が含まれており、タンパク質の分子表面にこれらのアミノ酸が存在すると、タンパク質自身の疎水性を高めることとなり、水溶液中で保存時に水溶性が低下して、濁りの発生が見られることがある。水溶性が極めて低い実用的タンパク質の例としては、乳タンパク質であるカゼイン、植物貯蔵タンパク質である小麦グルテン及びその成分であるグリアジン、硬タンパク質であるコラーゲンなどがある。これらのタンパク質の利用のため、水溶性を高める方法が種々試みられてきた。（例えば、特許文献１，２，３，４，５参照）
特開平１１−１８６８７号公報 特開平６−７３０８９号公報 特開２００４−１１３１８２号公報 特開２００３−２５０４６０号公報 特開平７−２５８２９２号公報

しかしながら、これまで行われてきた方法は、目的タンパク質を酸やアルカリでの処理、熱処理、或いは酵素的または化学的に加水分解することによる低分子量化など、タンパク質本来の構造を維持するのが困難な条件を伴っていた。また、糖やコハク酸などの化合物によりタンパク質表面を化学的、物理的に修飾し、水溶性を高める方法も試みられており、成果をあげている。しかし、修飾を伴う方法は目的タンパク質の表面状態を変えるため、該タンパク質の特性を変化させることになる。更に、修飾処理を伴う方法も、熱処理や酸・アルカリ処理ほどではないにしても目的タンパク質が変性する危険を伴う。なにより、修飾を伴う方法は操作が煩雑で、手間がかかる。

一方、不溶性タンパク質の可溶化技術は、研究分野においても重要な要素技術のひとつである。特に、遺伝子操作技術によるタンパク質の生産では、宿主生物が本来生産しないタンパク質、すなわち異種タンパク質を発現させると、本来のコンフォメーションをとれずに疎水性の高いタンパク質として凝集、不溶化し、いわゆるインクルージョンボディとなる。このインクルージョンボディを正常なタンパク質とするには、まず可溶化する必要があり、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を用いて一旦変性させ、その後で正常なタンパク質に再構成させるという煩雑な操作が必要となる。変性を伴わない温和な可溶化方法が確立できれば、異種タンパク質の高生産技術が大きく飛躍すると考えられる。

このような状況から、水溶性が低いタンパク質の溶解性を改善する方法として、目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法が強く望まれていた。

タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法として、従来法である該タンパク質の酸・アルカリ処理、熱処理、或いは加水分解での低分子量化、タンパク質変性剤の使用などは、タンパク質本来の構造を維持できないという問題がある。また、タンパク質表面の化学的・物理的修飾による濁り抑制方法は、該タンパク質の特性を変化させてしまう、該タンパク質が変性する危険を伴う、操作が煩雑で手間がかかるという課題が考えられる。
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法であって、従来法と異なり目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法と、それによって濁り発生が抑制された組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を目的タンパク質と水溶液中に共存させることにより、目的タンパク質を含有する水溶液の濁り発生を効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のようなものである。
［項１］
目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させる、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
［項２］
目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」とセリンを共存させる、項１記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項３］
「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％含有させる、項１または２に記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項４］
「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメイン」を用いる項１〜３のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項５］
「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」がＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０から選択される項１〜４のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項６］
「ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質」を用いる項１〜５のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項７］
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いる項６に記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項８］
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いる項６に記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項９］
ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いる請求項６に記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項１０］
ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いる項１〜９のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項１１］
ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いる項１〜１０のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項１２］
ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いる項１〜１１のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項１３］
セリンを、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％含有させる、項２に記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項１４］
目的のタンパク質が、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものである、項１〜１３のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
［項１５］
糖タンパク質が、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質である、項１４記載の濁りの発生を抑制する。
［項１６］
「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を含有する、タンパク質水溶液の濁り発生抑制剤。
［項１７］
目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させる、タンパク質水溶液の濁りの発生が抑制された組成物を製造する方法。
［項１８］
目的のタンパク質と「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を含む、タンパク質水溶液の濁りの発生が抑制された組成物。
［項１９］
項１８に記載の組成物を含む診断用キット。
［項２０］
項１８に記載の組成物を含むバイオセンサー。

本発明によれば、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を用いることにより、目的タンパク質を含有する水溶液の濁り発生を抑制することができ、これらタンパク質、およびタンパク質を用いた組成物の用途を拡大させることが可能となる。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、タンパク質（ペプチドを含む）水溶液の濁り抑制を、同じくタンパク質であるＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質やその変異タンパク質、その同等物を用いて行うという簡易な手法である。本発明は、可溶化した目的タンパク質が析出する現象を別のタンパク質が抑制するという従来には無い発想に基づいている。

本発明は、分子シャペロンとして知られているＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０などから構成される、いわゆる「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」からＡＴＰａｓｅドメインを除去した「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を用いて、濁りの発生を抑制する方法、および、濁りの発生が抑制された組成物等に関する。

「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」としては、たとえば、大腸菌のヒートショックタンパク質の一種であるＨＳＰ７０（ＤｎａＫ）の基質結合ドメインが好適に用いられる。
このタンパク質は６３８アミノ酸から構成され、１〜３８５番目のアミノ酸より構成される「ＡＴＰａｓｅ（ＡＴＰ結合）ドメイン」と３８６〜６３８番目のアミノ酸より構成される「基質結合ドメイン」からなっている（図１）。
配列番号１にＤｎａＫのタンパク質の配列を示す。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）は、既にＮＭＲ解析で構造が明らかとなっており、２つの構造的な領域（ドメイン）、すなわちＮ末端側のβシート領域（ドメイン）とＣ末端側のαへリックス領域（ドメイン）からなっていることが分かっている。
また、配列のＮ末端側の親水／疎水率が０．５であり、Ｃ末端側では０．８９で、その差は０．３９と高い値を示すことが計算によって明らかにされた。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）が水溶液中のタンパク質の濁り抑制に際して有用なものである。

本発明では、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質からＡＴＰａｓｅドメインを除去したものが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質からＡＴＰａｓｅドメインを除去したものが用いられる。
あるいは、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＡＴＰａｓｅドメインを除去したＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインが用いられる。

本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に指定はないが、大腸菌のＤｎａＫ、酵母細胞質に存在する Ｓｓａ１ｐ、酵母ミトコンドリアに存在する Ｓｓｃ１ｐ、酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ、哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在する Ｂｉｐ、哺乳類ミトコンドリアに存在する ｍＨｓｐ７０ および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などから選択される。
ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部であり、上に列挙した以外のホモログにも同様の効果が期待できることは容易に予想可能である。

本発明においては、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したＤｎａＫタンパク質がより好ましい。また、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したＤｎａＫタンパク質であることが好ましい。特に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。

また、本発明においては、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いてもよい。
更に詳しくは、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質である。
また更に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質が使用される。

本発明に用いるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントは、本発明の効果を損なわない範囲内であればヒスチジンタグなどのタグを有していても良い。さらに、本発明の効果を損なわない範囲内であれば一般的に知られていないタグや、任意のアミノ酸配列を付加しても良い。

本タンパク質の発現方法は特に限定されないが、原核生物を用いて発現させる方法が好ましく、さらには、大腸菌を用いて発現させる方法がさらに好ましい。また、発現ベクターに関しても特に限定はされず、一般的に発現に使用されているものであればよい。

本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に限定はされないが、大腸菌のＤｎａＫ，酵母細胞質に存在するＳｓａ１ｐ，酵母ミトコンドリアに存在するＳｓｃ１ｐ，酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ，哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在するＢｉｐ，哺乳類ミトコンドリアに存在するｍＨｓｐ７０および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などが例示される。
ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部であり、上に列挙した以外のホモログであってもよい。

本発明に用いるＨＳＰ７０フラグメントはＡＴＰａｓｅドメインを除去されているのがよいが、場合によりＡＴＰａｓｅドメインの全領域が除去されていなくてもよい。
例えば、ＡＴＰａｓｅドメインは、ＤｎａＫではＣ末端側の１−３８３の領域を指し、そのＡＴＰａｓｅ活性を失う程度にＡＴＰａｓｅドメインの一部を除去していれば、本発明におけるＨＳＰ７０フラグメントに含まれる。例えば、ＤｎａＫにおいては３８４−６３８のフラグメントも使用することができる。

本発明の濁り抑制方法の対象となるタンパク質は特に限定されるものではないが、例えば、食品に利用されるタンパク質、医薬品として利用されるタンパク質、酵素、抗体、抗原など、またはそれらを含有する組成物などが挙げられる。
タンパク質の種類も特に限定されるものではないが、一部例を挙げると、カゼインなどの乳タンパク質、小麦グルテンや大豆蛋白などの植物貯蔵タンパク質、コラーゲンなどの硬タンパク質、などが挙げられる。また、例えば、糸状菌タンパク質などの糖タンパク質において、原核生物を宿主として組換え生産することにより糖の修飾を受けることができなくなった、天然型と同じ修飾を受けることができなくなったタンパク質なども挙げられる。

また、水溶性の低いタンパク質は、その水溶液での保存中に濁りを発生することがあり、目的タンパク質含有水溶液をピペット操作により小分注する際に、チップ先端に目詰まりを起こすことがある。例えば、目的タンパク質含有水溶液を一定量ずつ滴下して、生体成分分析用のセンサチップを作製する際に、試薬滴下量にバラツキが生じた場合、分析結果に誤差を生じる危険性がある。
本願発明は、このようなタンパク質の水溶液に好ましく適用することができる。例えば、グルコース測定用のセンサーに用いるグルコースデヒドロゲナーゼ、好ましくは、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・テレウスなどのアスペルギルス属由来のもの、あるいは、ＦＡＤを補酵素とする水溶性のグルコースデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。

これらのタンパク質水溶液は、他の物質と混合された液状組成物などであってもよい。このような組成物は、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工した体外診断薬、酵素センサー（バイオセンサー）や酵素電極、医薬品、食品および飲料など、種々の形態をとることができる。これらは、例えば診断用キットのように、使用時に便利なように予めキット化されたものであってもよい。

本願発明は、目的のタンパク質と「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を含む、タンパク質水溶液の濁りの発生が抑制された組成物を提供する。このような組成物は、目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させることにより製造することができる。
また、本願発明は、「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を含有する、タンパク質水溶液の濁り発生抑制剤を提供する。このような濁り発生抑制剤によって、目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させ、タンパク質水溶液の濁り発生を抑制することができる。

本発明においては、水溶液のｐＨ緩衝作用、タンパク質の安定化などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。例えば水溶液は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ，ＭＥＳ，ＴＥＳ，ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄ緩衝液の状態であって良く、フタル酸バッファーなどのようなジカルボン酸を用いた緩衝液でもよい。この様な水溶液中に硫安、燐安、食塩、塩化カリウムなどの塩類を含んでいても良い。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類、グリセロールやエチレングリコールなどのポリオール類、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどの界面活性剤を添加しても良い。必要に応じて、ペニシリン系、セフェム系、アミノ配糖体系、マイクロライド系、テトラサイクリン系、ニュー・キノロン系等の抗生物質、アジ化物、１，１‘−Ｍｅｔｈｙｌｅｎ−ｂｉｓ［３−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｄｉｏｘｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−ｕｒｅａ］，２−Ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，５−Ｂｒｏｍｏ−５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｄｉｏｘａｎｅ，２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ，２−Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅなどの防腐剤を添加しても良い。

本発明のタンパク質水溶液の濁り抑制方法に用いるＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質の、水溶液中における濃度は、特に限定されないが、好ましくは終濃度０．０１％以上であり、０．０１〜１０％含有させると良い。さらに好ましくは、終濃度０．１〜１％含有させると良い。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。

実施例１：タンパク質（ＡＯＧＤＨ―ＶＸ組換え体）標品の粉末化
後述の試験例２で得られた、組換えＡＯＧＤＨ（アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＧＤＨ）−ＶＸ標品を濃縮して、Ａ２８０測定値が２０（ｍｇ／ｍｌ）となるように調製した。次に、この濃縮標品に対して、タンパク質量比で数１０％となるように、表１の各欄に記載の賦形剤を添加した。例えば、２０％セリン，６０％ＢＳＡを含有する賦形剤では、４ｍｇ／ｍｌとなるようにセリンと１２ｍｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡを添加した。
表１に示す各種賦形剤の組合せで調製した溶液を、０．４５μｍのフィルターでろ過した後、凍結乾燥を実施した。なお、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）としてＡＬＢＵＭＩＮ，ＢＯＶＩＮＥ ＦｒａｃｔｉｏｎＶ（商標 シグマ製）を用い、また、本発明に使用するＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質としては、配列番号６記載のアミノ酸配列のうち４１９番目をメチオニンへ置換して、４１９〜６０７番目に相当するアミノ酸配列で構成されたものを使用した。
凍結乾燥（ＦＤＲ）後得られた粉末酵素標品の活性を後述の試験例１に示す方法により測定して、粉末量から総活性量を計算したところ、いずれのサンプルにおいても、ＦＤＲ前後で９０％以上の活性回収率が確認できた。

実施例２：各種粉末標品の溶解性検討
実施例１で得られた各サンプルの粉末標品を５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように蒸留水で溶解した後、３０℃の恒温室で保存して、各サンプル溶解液の濁りの発生状況をＯＤ６６０ｎｍの吸光度を指標に調査した。また、各サンプルの３０℃、３時間保存後の活性残存率を測定した。
６０％ＢＳＡを単独で賦形剤とした時には、溶解直後に１００ｍＡｂｓを超える吸光度があり、セリンを添加することにより、初期吸光度の上昇を著しく抑制できることが明らかとなった。
１０％の「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を単独で添加した時には、溶解直後では２００ｍＡｂｓ以上の吸光度であったが、２０％セリンを添加することにより、６０％ＢＳＡ使用時と比べてＯＤ６６０の上昇を抑えることができた。
また、３０％の「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」と２０％セリンを添加した時には、３０℃，３時間処理後のＯＤ６６０を約１／２に抑えることができた。
以上の結果から、「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」はＢＳＡ使用時と比べて、少ないタンパク量において可溶性を向上できることが明らかとなった。
なお、表１および表２では、「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を「本願発明」と表記する。

実施例３：各種粉末標品の濁り発生状況の検討
実施例１と同じ要領にて、２０％セリン，６０％ＢＳＡ、または、２０％セリン，２０％の「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を賦形剤とする２種類の組換えＡＯＧＤＨ―ＶＸ粉末標品を調製した。各粉末標品サンプルを加湿処理、および／または、加速処理した後、各粉末サンプルの粉末安定性を調べた。また、各サンプルの加湿および／または加速処理後の活性残存率を測定した。
ここで、加湿処理とは、温度２５℃，湿度７０％で６時間放置することを意味する。また、加速処理とは、３７℃，３日間放置することを意味する。
なお、粉末安定性は、凍結乾燥直後の各粉末サンプルの活性値を１００％として、各処理後の活性値から、相対的な活性残存率を計算して指標とした。
加湿＋加速処理後の各サンプルの安定性を比較したところ、セリン，ＢＳＡの組合せでは、約６８％程度の残存率であったが、セリン，「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」の組合せにより、約８９％の残存率が得られた。
次に、各処理を施した粉末サンプルを５ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水で溶解して、濁りの発生状況を調べたところ、セリン，「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」の組合せにより、セリン，ＢＳＡの組合せと比べて、濁りの発生を著しく抑制できることが明らかとなった。
例えば、２０％の「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」，２０％セリンを賦形剤とした粉末標品を、６０％ＢＳＡ，２０％セリンを賦形剤とした粉末標品と比較したところ、３０℃，４時間処理後の夫々のＯＤ６６０の測定値は、加湿処理後のもので約２．８倍、加速処理後のもので約５倍、加湿＋加速処理後のもので約１３．６倍低く抑えることが可能であった。
これらの結果から、「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」が目的タンパク質溶液の濁り発生を抑制する効果が極めて高いことが明らかとなった。
なお、「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」の濁りの抑制効果は、この粉末溶解濃度に限られたものではなく、広い濃度範囲で見ることができる。

表１および表２から、本願発明は、セリンとの組み合わせでさらに効果的であることがわかる。なお、セリンは、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％含有させることが好ましい。
ＢＳＡとの比較でも、セリンとの組み合わせで、本願発明のほうが６６０ｎｍの数値が低く、目視でも浮遊物の発生が見られなかった。また、本願発明は、添加量をＢＳＡの半分以下にしても６６０ｎｍの数値がＢＳＡより低い。このことにより、本願発明では賦形剤の添加量を減らすことができ、直接酵素反応に関わる部分以外の要因による不慮のトラブル発生を未然に防止することができる。

試験例１：ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性の測定方法
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。

＜測定条件＞
反応試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。

活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝

なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。

試験例２：糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体標品の調製
アスペルギルス・オリゼＴＩ株（土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。）の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３，４に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてアスペルギルス・オリゼＴＩ株のＧＤＨ（ＡＯＧＤＨ）遺伝子を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミド（ｐＡＯＧＤＨ）を構築した。
このプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号１）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号２）であった。
次に、このプラスミドを鋳型に配列番号５のオリゴＤＮＡにて、Ｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、５７２位のＶａｌをＣｙｓにするアミノ酸置換を行なった。この遺伝子操作により得られたプラスミドをｐＡＯＧＤＨ−ＶＸと名づけた。ｐＡＯＧＤＨ−ＶＸをコンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）に導入した形質転換体をＴＢ培地（２．４％酵母エキス、１．２％ポリペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて培養温度３０℃、通気量２Ｌ／分、攪拌回転速度３３０ｒｐｍで２４時間培養した。
培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に６６０ｎｍでの菌体濁度が約５０となるように懸濁し、６５ＭＰａの圧力でホモジナイザー破砕を行った。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度９％となるようポリエチレンイミンを添加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去すると同時に、１０ｍＭフタル酸バッファーに置換したＡＯＧＤＨ―ＶＸ組換え体標品を調製した。

本発明によれば、産業上有用なタンパク質水溶液の濁り発生を抑制することができ、これらタンパク質を用いた組成物の用途を拡大することが可能となる。食品分野、医薬品分野など産業界に寄与することが大である。

大腸菌ＤｎａＫタンパク質の概要を示す。

Claims (20)

1. 目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させる、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。
2. 目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」とセリンを共存させる、請求項１記載の濁りの発生を抑制する方法。
3. 「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％含有させる、請求項１または２に記載の濁りの発生を抑制する方法。
4. 「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメイン」を用いる請求項１〜３のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
5. 「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」がＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０から選択される請求項１〜４のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
6. 「ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質」を用いる請求項１〜５のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
7. ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いる請求項６に記載の濁りの発生を抑制する方法。
8. ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いる請求項６に記載の濁りの発生を抑制する方法。
9. ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いる請求項６に記載の濁りの発生を抑制する方法。
10. ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いる請求項１〜９のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
11. ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いる請求項１〜１０のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
12. ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いる請求項１〜１１のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
13. セリンを、水溶液中に終濃度０．０１〜１０％含有させる、請求項２に記載の濁りの発生を抑制する方法。
14. 目的のタンパク質が、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものである、請求項１〜１３のいずれかに記載の濁りの発生を抑制する方法。
15. 糖タンパク質が、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質である、請求項１４記載の濁りの発生を抑制する。
16. 「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を含有する、タンパク質水溶液の濁り発生抑制剤。
17. 目的のタンパク質に「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を共存させる、タンパク質水溶液の濁りの発生が抑制された組成物を製造する方法。
18. 目的のタンパク質と「ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を含む、タンパク質水溶液の濁りの発生が抑制された組成物。
19. 請求項１８に記載の組成物を含む診断用キット。
20. 請求項１８に記載の組成物を含むバイオセンサー。
    

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