WO2008069020A1

WO2008069020A1 - タンパク質の溶解性改善方法、タンパク質含有水溶液の溶状を安定化する方法、及び、組成物

Info

Publication number: WO2008069020A1
Application number: PCT/JP2007/072459
Authority: WO
Inventors: Masao Kitabayashi; Yoshiaki Nishiya; Masahiro Sasaki; Hideyuki Yamada
Original assignee: Toyo Boseki Kabushiki Kaisha; Seiren Co., Ltd.
Priority date: 2006-12-06
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2008-06-12

Abstract

　本発明は、新規なタンパク質の溶解性改善方法、タンパク質含有水溶液の溶状を安定化する方法、及び、組成物に関する。

Description

明細書

タンパク質の溶解性改善方法タンパク質含有水溶液の溶状を安定化する方法、及び、組成物

技術分野

[0001] 本発明は、新規なタンパク質の溶解性改善方法、タンパク質含有水溶液の溶状を安定化する方法、及び、組成物に関する。

背景技術

[0002] タンパク質を実用化するに際し、その水に対する溶解性の低さが欠点となるケースが少なからず見受けられる。タンパク質を構成するアミノ酸には、トリブトファンやフエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、ノリンなどの疎水性アミノ酸が含まれており、タンパク質の分子表面にこれらのアミノ酸が存在すると、タンパク質自身の疎水性を高めることとなり、水溶液中で保存時に水溶性が低下して、濁りの発生が見られることがある。水溶性が極めて低い実用的タンパク質の例としては、乳タンパク質であるカゼイン、植物貯蔵タンパク質である小麦ダルテン及びその成分であるグリアジン、硬タンパク質であるコラーゲンなどがある。これらのタンパク質の利用のため、水溶性を高める方法が種々試みられてきた (例えば、特許文献 1、 2、 3、 4、 5参照）。

[0003] しかしながら、これまで行われてきた方法は、目的タンパク質を酸やアルカリでの処理、熱処理、或いは酵素的または化学的に加水分解することによる低分子量化などに供するものであり、タンパク質本来の構造を維持するのが困難な条件を伴っていた。また、糖ゃコハク酸などの化合物によりタンパク質表面を化学的、物理的に修飾し、水溶性を高める方法も試みられており、成果をあげている。しかし、修飾を伴う方法は目的タンパク質の表面状態を変えるため、該タンパク質の特性を変化させることになる。更に、修飾処理を伴う方法も、熱処理や酸 ·アルカリ処理ほどではないにしても目的タンパク質が変性する危険を伴う。なにより、修飾を伴う方法は操作が煩雑で、手間がかかる。

[0004] 一方、不溶性タンパク質の可溶化技術は、研究分野においても重要な要素技術のひとつである。特に、遺伝子操作技術によるタンパク質の生産では、宿主生物が本来生産しないタンパク質、すなわち異種タンパク質を発現させると、本来のコンフオメーシヨンをとれずに疎水性の高いタンパク質として凝集、不溶化し、いわゆるインクノレ一ジョンボディとなる。このインクルージョンボディを正常なタンパク質とするには、まず可溶化する必要があり、尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤を用いて一旦変性させ、その後で正常なタンパク質に再構成させるとレ、う煩雑な操作が必要となる。変性を伴わない温和な可溶化方法が確立できれば、異種タンパク質の高生産技術が大きく飛躍すると考えられる。

[0005] このような状況から、水溶性が低!/、タンパク質の溶解性を改善する方法として、目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法が強く望まれてレ、た。

[0006] また、水溶性の低いタンパク質は、その水溶液での保存中に濁りを発生することがあり、目的タンパク質含有水溶液をピペット操作により小分注する際に、チップ先端に目詰まりを起こすことがある。例えば、目的タンパク質含有水溶液を一定量ずつ滴下して、生体成分分析用のセンサチップを作製する際に、試薬滴下量にバラツキが生じた場合、分析結果に誤差を生じる危険性がある。そこで、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法の開発が望まれていた。

[0007] 特許文献 1：特開平 11 18687号公報

特許文献 2：特開平 6— 73089号公報

特許文献 3：特開 2004 - 113182号公報

特許文献 4 :特開 2003— 250460号公報

特許文献 5：特開平 7— 258292号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 目的タンパク質の溶解性を改善する方法、および/または、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法として、従来法である該タンパク質の酸 ·アルカリ処理、熱処理、或いは加水分解での低分子量化、タンパク質変性剤の使用などは、タンパク質本来の構造を維持できないという問題がある。また、タンパク質表面の化学的'物理的修飾による溶解性改善方法は、該タンパク質の特性を変化させてしまう、該タンノク質が変性する危険を伴う、操作が煩雑で手間力 Sかかるという課題が考えられる。

[0009] 本発明が解決しょうとする課題は、水溶性が低いタンパク質の溶解性を改善する方法であって、従来法と異なり目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法と、それによつて溶解性が改善された組成物を提供することにある。

[0010] あるいは、本発明が解決しょうとする課題は、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法であって、従来法と異なり目的タンパク質の構造変化や変性を伴わない温和な条件で実施可能であり、且つ、従来よりも簡便な方法と、それによつて濁り発生が抑制された組成物を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を目的タンパク質と水溶液中に共存させることにより、目的タンパク質の水溶性を効果的に改善できることを見出した。

[0012] また、本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、セリシンおよび

/またはその加水分解物もしくはその同等物を目的タンパク質と水溶液中に共存させることにより、目的タンパク質を含有する水溶液の濁り発生を効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

[0013] すなわち、本発明は以下のようなものである。

[1]目的のタンパク質の水溶性を高めるため、該タンパク質を、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物の存在下で水性溶媒に溶解して水溶液を調製する工程を含むことを特徴とする溶解性改善方法。

[2]セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を、水溶液中に終濃度 1〜20%含有させることを特徴とする、 [1]記載の溶解性改善方法。

[3]セリシンおよび/またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである、 [1]または [2]記載の溶解性改善方法。

[4]セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである、 [1]または [2] 記載の溶解性改善方法。

[5]目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質から選ばれたものである、 [1]〜 [4]の!/、ずれか記載の溶解性改善方法。

[6]目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存した溶解性改善組成物。

[ 7]セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物が、水溶液中に終濃度 1〜20%含有することを特徴とする、 [6]記載の溶解性改善組成物。

[8]セリシンおよび/またはその加水分解物力 S、繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである、 [6]または [7]記載の溶解性改善組成物。

[9]セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである、 [6]または [7] 記載の溶解性改善組成物。

[10]目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質から選ばれたものである [6]〜 [9]の!/、ずれか記載の溶解性改善組成物。

[11] [6]〜 [9]の!/、ずれか記載の溶解性改善組成物を含む診断用キット。

[12] [6]〜 [9]の!/、ずれか記載の溶解性改善組成物を含むバイオセンサー。

[13]目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。

[14]目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンを共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。

[15]セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を、水溶液中に終濃度 0. 01〜； 10% (w/v)含有させることを特徴とする、 [13]または [14]記載の濁り抑制方法。

[16]セリシンおよび/またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、 [13]〜[； 15]の!/、ずれか記載の濁り抑制方法。

[17]セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、 [13]〜[； 15]のいずれか記載の濁り抑制方法。

[18]セリンを、水溶液中に終濃度 0. 01〜； 10% (w/v)含有させることを特徴とする、 [14]〜[； 17]のいずれか記載の濁り抑制方法。

[19]目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、 [13]〜[； 18]の!/、ずれか記載の濁り抑制方法。

[20]糖タンパク質力 S、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、 [19]記載の濁り抑制方法。

[21]目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。

[22]目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンが水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。

[23]セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物力 S、水溶液中に終濃度 0. 01〜； !％(w/v)含有することを特徴とする、 [21]または [22]記載の濁り抑制組成物。

[24]セリシンおよび/またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、 [2；！]〜 [23]の!/、ずれか記載の濁り抑制組成物。

[25]セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、 [2；！]〜 [23]の!/、ずれか記載の濁り抑制組成物。

[26]セリンを、水溶液中に終濃度 0. 01〜； 10% (w/v)含有させることを特徴とする、 [22]〜 [25]の!/、ずれか記載の濁り抑制組成物。

[27]目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、 [2；！]〜 [26]の!/、ずれか記載の濁り抑制組成物。

[28]糖タンパク質力 S、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、 [27]記載の濁り抑制組成物。

[29] [2；！]〜 [28]の!/、ずれか記載の濁り抑制組成物を含む診断用キット。

[30] [2；！]〜 [28]の!/、ずれか記載の濁り抑制組成物を含むバイオセンサー。発明の効果 [0014] 本発明によれば、セリシンゃセリシン加水分解物またはその同等物を用いることにより、目的タンパク質の水溶性を向上させ、これらタンパク質、およびタンパク質を用 V、た組成物の用途を拡大させることが可能となる。

[0015] また、本発明によれば、セリシンやその加水分解物またはその同等物を用いることにより、目的タンパク質を含有する水溶液の濁り発生を抑制することができ、これらタンパク質、およびタンパク質を用いた組成物の用途を拡大させることが可能となる。図面の簡単な説明

[0016] [図 1]各種水溶液中の 1 %カゼインの溶解性を示す。

[図 2]各種水溶液中の 0. 1 %カゼインの溶解性を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下に本発明を詳細に説明する。

本発明のタンパク質溶解性改善方法、および/または、タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法に用いるセリシンは、繭糸や生糸から抽出される天然状態のものを用いても良いし、その加水分解物を用いても良ぐその同等物であっても良い。本発明の実施例においては、セリシン加水分解物を用いている。

[0018] タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法に関して、我々は、先の検討においてセリン添加により、目的タンパク質溶液の熱安定性および粉末安定性が向上することを見出している。そこで、本検討では、予めセリンを含有させた条件で検討している。また、現在、 BSAは目的タンパク質を安定化する効果が高いタンパク質性の賦形剤として汎用されている。実際、データは未収載である力 BSAが存在しない条件下で、目的タンパク質を凍結乾燥処理すると活性値として 50%前後の回収率しか得られていない。そこで、本検討では、セリンと BSAを含む組成物をコントロールとして、これよりも濁り抑制効果の高いタンパク質性賦形剤をスクリーニングすることにより、本発明に至っている。

[0019] セリシンは、国際公開第 2002/086133号パンフレットに開示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、 38アミノ酸からなる機能性ペプチドの繰り返し配列で構成されており、加水分解物とは、該機能性ペプチドを含む天然物由来セリシンの酸ゃァルカリによる加水分解されたものなどをいう。また、同等物とは、少なくとも 1以上の機能性ペプチドを含むように化学合成されたものや、遺伝子工学的手法により、微生物などで製造されるものをいう。さらに、これらにおいては、本発明の安定化作用を損なわない範囲内で、あるいはその特性を改善する目的で、天然型アミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の欠失、置換、揷入、付加されたものであっても良い。

[0020] 本発明の目的タンパク質の溶解性を改善する方法は、タンパク質 (ペプチドを含む )の溶解性改善を、同じくタンパク質であるセリシンやその加水分解物、その同等物を用いて行うという簡易な手法である。セリシン加水分解物を保湿剤、抗酸化剤として利用したり、界面活性剤として脂質の乳化安定性改善に利用する研究については既に報告が存在するが（特開平 11— 276876号公報）、本発明は、タンパク質をタンパク質で溶かすとレ、う従来には無レ、発想に基づレ、て!/、る。

[0021] 本発明のタンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法は、タンパク質 (ぺプチドを含む）水溶液の濁りの発生の抑制を、同じくタンパク質であるセリシンやその加水分解物、その同等物を用いて行うという簡易な手法である。セリシン加水分解物を保湿剤、抗酸化剤として利用したり、界面活性剤として脂質の乳化安定性改善に利用する研究については既に報告が存在するが（特開平 11 276876号公報）、本発明は、可溶化した目的タンパク質が析出する現象を別のタンパク質が抑制するという従来には無レ、発想に基づレ、て!/、る。

[0022] 本発明に用いるセリシンやその加水分解物、その同等物は、国際公開第 2002/0 86133号パンフレットに開示される公知の方法に従って得ることができる。

[0023] 本発明の溶解性改善方法の対象となるタンパク質は特に限定されるものではない、例えば、食品に利用されるタンパク質、医薬品として利用されるタンパク質、酵素、抗体、抗原など、またはそれらを含有する組成物などが挙げられる。

[0024] タンパク質の種類も特に限定されるものではな!/、が、一部例を挙げると、カゼインなどの乳タンパク質、小麦ダルテンや大豆蛋白などの植物貯蔵タンパク質、コラーゲンなどの硬タンパク質などが挙げられる。

[0025] これらのタンパク質は、他の物質と混合された液状組成物などであってもよい。このような組成物は、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されて、例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、液状体外診断薬、チップ状またはスリット状に加工した体外診断薬、酵素センサーや酵素電極、医薬品、食品および飲料など、種々の形態をとること力 Sできる。従って、本発明により、上記組成物を含む診断用キットおよび上記組成物を含むバイオセンサーが提供される。

[0026] タンパク質含有水溶液の濁り発生を抑制する方法に関して、タンパク質の種類も特に限定されるものではないが、一部例を挙げると、乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質などが挙げられる。「乳タンパク質」は、乳汁に含まれるタンパク質をいい、カゼイン、乳漿タンパク質などが例としてあげられる。「植物貯蔵タンパク質」は植物体にエネルギー源などとして貯えられるタンパク質をいい、小麦グノレテン、大豆蛋白などが例としてあげられる。「硬タンパク質」は、通常の塩水溶液などには溶けないタンパク質をいい、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フイブ口イン、レシリンなどが例として挙げられる。「糖タンパク質」は、糖とタンパク質からなる物質をいう。また、天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質、すなわち、例えば、糸状菌タンパク質などの糖タンパク質を原核生物などを宿主として組換え生産した際に本来の糖の修飾を受けていないタンパク質なども挙げられる。

[0027] 本発明にお!/、て水溶液とは、水性溶媒中にタンパク質を含有する溶液を!/、う。水性溶媒としては水を使用することができる力本発明においては、水溶液の pH緩衝作用、タンパク質の安定化などの目的で、さらに他の物質を混合しても良い。例えば水溶液は、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、 PIPES, MES、 TES、 MOPS, HEPESなどの Good緩衝液の状態であって良く、この様な水溶液中に硫安、燐安、食塩、塩化カリウムなどの塩類を含んでいても良い。また、エタノールやメタノール、プロパノールなどのアルコール類、グリセロールゃェチレングリコールなどのポリオール類、アルキルダルコシド、ポリエチレングリコールァルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステルなどの界面活性剤を添加しても良レ、。必要に応じて、ペニシリン系、セフエム系、アミノ配糖体系、マイクロライド系、テトラサイクリン系、ニュー'キノロン系等の抗生物質、アジ化物、 1 , l '—Methylen— bis [3 — ( 1— hydroxymethyl― 2 , 4— dioximidazolidin— 5— yl)— urea]、 2— Methv 1— 3 (2H)—isothiazolone— hydrochloride 5― Bromo— 5— nitro― 1 , 3— di oxane、 2― Hydroxypyridine— N— oxide 2— Chloroacetamideなどの防腐剤を添加しても良い。

[0028] 本発明のタンパク質溶解性改善方法に用いるセリシンゃセリシン加水分解物またはその同等物の、水溶液中における濃度は、特に限定されないが、好ましくは終濃度；!〜 20% (w/v)含有させると良い。さらに好ましくは、終濃度;!〜 10% (w/v)含有させると良い。

[0029] 本発明のタンパク質水溶液の濁り抑制方法に用いるセリシンやその加水分解物またはその同等物の、水溶液中における濃度は、特に限定されないが、好ましくは終濃度 0. 01 % (w/v)以上であり、 0. 01〜； 10% (w/v)含有させると良い。さらに好ましくは、終濃度 0. ；!〜 1 % (w/v)含有させると良い。

実施例

[0030] 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。実施例中、濃度の単位を示す％は％( / ）である。

[0031] (実施例 1)

カゼイン（メルク製： Hammerstein Grade)を、 1〜10%のセリシン加水分解物（東洋紡績製: NPS— 301)を含有する水溶液で 1 %または 0. 1 %となるよう懸濁し、溶解性を目視確認した。

[0032] (比較例 1)

実施例 1におレ、てセリシン加水分解物を添加しな!/、蒸留水、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン（シグマ製 FractionV)；!〜 5%を含有する水溶液を調製し、実施例 1と同様の条件でカゼインを 1 %または 0. 1 %となるよう懸濁し、溶解性を目視確認した。

溶解性の目視確認結果を、図 1および図 2に示す。このように、カゼインの溶解性がセリシンにより向上することが示された。

[0033] (実施例 2)

カゼインを、 1 %のセリシン加水分解物を含有する水溶液で 0. 1 %または1 %となるよう懸濁し、懸濁液の濁度（OD600nm)を測定し、溶解性の指標とした。 [0034] (比較例 2)

実施例 2にお!/、てセリシン加水分解物を添加しな!/、蒸留水、又はセリシン加水分解物の替わりに牛血清アルブミン 1 %を含有する水溶液を調製し、実施例 2と同様の条件でカゼインを 0. 1 %または 1 %となるよう懸濁し、懸濁液の濁度（OD600nm)を測定した。

表 1に示す通り、濁度の減少からカゼインの溶解性がセリシンにより向上することが示された。

[0035] [表 1]

O D 6 0 0

水溶液 0 . 1 %カゼイン 1 ⁰/もカゼィン

蒸留水 0 . 0 8 9 1 . 4

1 %セリシン加水分解物 0 . 0 2 8 1 . 0

1 %牛血清アルブミン 0 . 0 7 5 1 . 5

*水溶液自身の O D 6 0 0をバックグラウンドとして差し引いた値を示した。

[0036] (実施例 3)

カゼインを、 5 %のセリシン加水分解物を含有する水溶液で 1 %または 3 %となるよう懸濁し、懸濁液の濁度（OD660nm)を測定し、溶解性の指標とした。さらに、懸濁液を 25°Cで 1日間保存後、懸濁液の濁度（OD660nm)を測定し、溶解性の指標とした

[0037] (比較例 3)

実施例 3にお!/、てセリシン加水分解物を添加しな!/、蒸留水で、実施例 3と同様の条件でカゼインを 1 %または 3%となるよう懸濁し、懸濁液の濁度（OD660nm)を測定した。さらに、懸濁液を 25°Cで 1日間保存後、懸濁液の濁度（OD660nm)を測定した。

表 2に示す通り、濁度の減少からカゼインの溶解性がセリシンにより向上することが示された。保存により、溶解性はさらに向上した。

[0038] [表 2] O D 6 6 0

水溶液 1 %カゼイン 3 %カゼィン

0曰 1 曰 0 曰 1 曰蒸留水 1 . 0 0 . 9 8 1 . 9 1 . 9

5 %セリシン加水分解物 0 . 2 6 0 . 0 2 0 1 . 5 0 . 6 3

*水溶液自身の O D 6 6 0をバックグラウンドとして差し引いた値を示した。

[0039] (実施例 4)

実施例 2のカゼインの替わり 1二小麦グリアジン (和光純薬製）を用いた以外は、同様の実験を実施した。

[0040] (比較例 4)

比較例 2のカゼインの替わり 1二/ J、麦グリアジン用いた以外は、同様の実験を実施した。

表 3に示す通り、小麦ダリアジンの溶角針生がセ Lトンンにより向上することが示された。

[0041] [表 3]

O D 6 0 0

水溶液 0 . 1 %グリアジン

蒸留水 0 . 1 3

1 %セリシン加水分解物 0 . 0 0 6 5

[0042] 試験例 1： FAD依存型 GDH活性の測定方法

以下の実施例にお!/、て、 FAD依存型 GDHの活性測定は以下の条件で行う。

<試薬〉

50mM PIPES緩衝液 pH6. 5 (0. l %TritonX— 100を含む）

163mM PMS溶液

6. 8mM 2, 6—ジクロロフエノールインドフエノール（DCPIP)溶液

1M D—グルコース溶液

[0043] 上記 PIPES緩衝液 15· 6ml, DCPIP溶液 0· 2ml、 D—グルコース溶液 4mlを混合して反応試薬とする。

[0044] <測定条件 >

反応試薬 3mlを 37°Cで 5分間予備加温する。 GDH溶液 0. 1mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に 37°Cに制御された分光光度計で、 600nmの吸光度変化を 5 分記録し、直線部分から 1分間あたりの吸光度変化（A ODTEST)を測定する。盲検は GDH溶液の代わりに GDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に 1分間あたりの吸光度変化（ Δ ODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従って GD H活性を求める。ここで GDH活性における 1単位（U)とは、濃度 200mMの D—ダルコース存在下で 1分間に 1マイクロモルの DCPIPを還元する酵素量として定義してい

[0045] 活性（U/ml) =

{ - ( Δ ODTEST- Δ ODBLANK) X 3. O X希釈倍率 }/{ 16· 3 X 0. I X

1. 0}

[0046] なお、式中の 3. 0は反応試薬 +酵素溶液の液量 (ml)、 16. 3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数 (cm2/マイクロモル）、 0· 1は酵素溶液の液量 (ml) 、 1. 0はセルの光路長（cm)を示す。

[0047] 実施例 5：糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ組換え体標品の調製

ァスペルギルス.ォリゼの菌体より mRNAを調製し、 cDNAを合成した。配列番号 3 、 4に示す 2種類のオリゴ DNAを合成し、調製した cDNAを铸型として KOD— Plus ( 東洋紡績製）を用いてァスペルギルス'ォリゼの GDH (AOGDH)遺伝子を増幅した。 DNA断片を制限酵素 Ndel、 BamHIで処理し、 pBluescript (LacZの翻訳開始コドン atgに合わせ Ndel認識配列の atgを合わせる形で Ndelサイトを導入したもの） N del— BamHIサイトに揷入し、組換えプラスミド（pAOGDH)を構築した。

[0048] このプラスミドを、コンビテントハイ DH5 a (東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従!/、プラスミドを抽出し、 AOGDH遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号 1 )。 cDNA配列から推定されるアミノ酸残基は 593アミノ酸 (配列番号 2)であった。

[0049] 次に、このプラスミドを铸型に配列番号 5のオリゴ DNAにて、 Quick change Mult i部位特異的変異導入キット（Stratagene社）を用いて、 572位の Valを Cysにするァミノ酸置換を行なった。この遺伝子操作により得られたプラスミドを pAOGDH— VXと名づけた。 pAOGDH— VXをコンビテントハイ DH5 a (東洋紡績製）に導入した形質転換体を TB培地（2. 4%酵母エキス、 1. 2%ポリペプトン、 1. 25%リン酸 1水素 2 カリウム、 0. 23⁰/₀リン酸 2水素 1カリウム、 0. 4⁰/₀グリセローノレ、 50 g/mlアンピシリンナトリウム、 pH7. 0)にて 10L—ジャーフアーメンターを用いて培養温度 30°C、通気量 2L/分、攪拌回転速度 330rpmで 24時間培養した。

[0050] 培養菌体を遠心分離で集めた後、 50mMのリン酸バッファー（ρΗ5· 5)に 660nm での菌体濁度が約 50となるように懸濁し、 65MPaの圧力でホモジナイザー破砕を行つた。破砕液を遠心分離して得た上清に終濃度 9%となるようポリエチレンイミンを添加することで核酸等を沈殿させ、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニゥムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を 50mMのリン酸バッファー（ρΗ5· 5)に再溶解させた。そして G— 25セファロースカラムによるゲルろ過、 Octyl—セファロースカラムおよび Phenyl—セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に 25%飽和〜 0%の硫酸アンモニゥム濃度勾配をかけてピ一クフラクシヨンを抽出）を実施し、さらに G— 25セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニゥムを除去すると同時に、 10mMフタル酸バッファーに置換した AOG DH— VX組換え体標品を調製した。

[0051] 実施例 6： AOGDH— VX組換え体標品の粉末化

実施例 5で得られた組換え AOGDH— VX標品を濃縮して、 A280測定値が 20 (m g/ml)となるように調製した。次に、この濃縮標品に対して、タンパク質重量比で数 1 0%となるように賦形剤を添加した。例えば、 20%セリン、 60%BSAを含有する賦形剤では、 4mg/mlとなるようにセリンと 12mg/mlとなるように BSAを添加した。

[0052] 表 4に示す各種賦形剤の組合せで調製した溶液を、 0. 45 mのフィルターでろ過した後、凍結乾燥を実施した。なお、 BSA (ゥシ血清アルブミン）として ALBUMIN、 BOVINE FractionV (シグマ製）を用い、セリシン加水分解物として NEO PROTEI N SAVER (東洋紡製）を用いた。表中のセリシンとある記載はセリシン加水分解物を表している。凍結乾燥 (FDR)後得られた粉末酵素標品の活性を測定して、粉末量力も総活性量を計算したところ、いずれのサンプルにおいても、 FDR前後で 90%以上の活性回収率が確認できた。

[0053] 実施例 7：各種粉末標品の溶解性検討

実施例 6で得られた各サンプルの粉末標品を 5mg/mlの濃度になるように蒸留水で溶解した後、 30°Cの恒温室で保存して、各サンプル溶解液の濁りの発生状況を O D660nmの吸光度を指標に調査した。

[0054] BSAを単独で賦形剤とした時には、溶解直後に lOOmAbsを超える吸光度があり、セリンを添加することにより、初期吸光度の上昇を著しく抑制できることが明らかとなつた。一方、セリシン加水分解物を単独で添加した時には、溶解直後でも数 mAbsの吸光度に抑えることができた。結果を表 4に示す。

[0055] 以上の結果から、セリンおよび/またはセリシン加水分解物の存在によりタンパク質の可溶性が向上することが明らかとなった。

[0056] [表 4]

[0057] 実施例 8：各種粉末標品の濁り発生状況の検討

実施列 6と同じ要領にて、 20%セリン、 60%BSA、または、 20%セリン、 30%セリシン加水分解物を賦形剤とする 2種類の組換え AOGDH— VX粉末標品を調製した。各粉末標品サンプルを加湿処理、および/または、加速処理した後、各粉末サンプルの粉末安定性を調べた。なお、粉末安定性は、凍結乾燥直後の各粉末サンプルの活性値を 100%として、各処理後の活性値から、相対的な活性残存率を計算して指標とした。

[0058] 加湿処理と加速処理後の各サンプルの安定性を比較したところ、セリン、 BSAの組合せでは、約 70%程度の残存率であった力セリン、セリシン加水分解物の組合せにより、約 90%の残存率が得られた。

[0059] 次に、各処理を施した粉末サンプルを 5mg/mlとなるように蒸留水で溶解して、濁りの発生状況を調べたところ、セリン、セリシン加水分解物の組合せにより、セリン、 B S Aの組合せと比べて、濁りの発生を著しく抑制できることが明ら力、となった。結果を表 5に示す。 [0060] なお、セリシン加水分解物の濁りの抑制効果は、この粉末溶解濃度に限られたものではなぐ広い濃度範囲で認められている。

[0061] [表 5]

産業上の利用可能性

[0062] 本発明によれば、産業上有用なタンパク質の水溶性を向上させ、これらタンパク質を用いた組成物の用途を拡大することが可能となる。また、本発明によれば、産業上有用なタンパク質水溶液の濁り発生を抑制することができ、これらタンパク質を用いた組成物の用途を拡大することが可能となる。食品分野、医薬品分野など産業界に寄与することが大である。

配列表フリーテキスト

[0063] ¾i3Q ID N :3: i，he sequence or designed polynucleotide described in Bxample 丄 SEQ ID NO :4: The sequence of designed polynucleotide described in Example 1 SEQ ID NO :5: The sequence of designed polynucleotide described in Example 1

Claims

請求の範囲

[I] 目的のタンパク質の水溶性を高めるため、該タンパク質を、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物の存在下で水性溶媒に溶解して水溶液を調製する工程を含むことを特徴とする溶解性改善方法。

[2] セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を、水溶液中に終濃度

1〜20%含有させることを特徴とする、請求項 1記載の溶解性改善方法。

[3] セリシンおよび/またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである、請求項 1または 2記載の溶解性改善方法。

[4] セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである、請求項 1または 2記載の溶解性改善方法。

[5] 目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質から選ばれたものである、請求項 1〜4のいずれ力、 1項記載の溶解性改善方法。

[6] 目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存した溶解性改善組成物。

[7] セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物力 S、水溶液中に終濃度

1〜20%含有することを特徴とする、請求項 6記載の溶解性改善組成物。

[8] セリシンおよび/またはその加水分解物力繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものである、請求項 6または 7記載の溶解性改善組成物。

[9] セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものである、請求項 6または 7記載の溶解性改善組成物。

[10] 目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質から選ばれたものである、請求項 6〜9の!/、ずれか 1項記載の溶解性改善組成物。

[I I] 請求項 6〜9のいずれ力、 1項記載の溶解性改善組成物を含む診断用キット。

[12] 請求項 6〜9のいずれか 1項記載の溶解性改善組成物を含むバイオセンサー。

[13] 目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法

〇

[14] 目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンを共存させることを特徴とする、タンパク質水溶液の濁りの発生を抑制する方法。

[15] セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物を、水溶液中に終濃度 0. 01〜； 10% (w/v)含有させることを特徴とする、請求項 13または 14記載の濁り抑制方法。

[16] セリシンおよび/またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、請求項 13〜； 15のいずれ力、 1項記載の濁り抑制方法。

[17] セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、請求項 13〜； 15のいずれ力、 1項記載の濁り抑制方法。

[18] セリンを、水溶液中に終濃度 0. 01〜； 10% (w/v)含有させることを特徴とする、請求項 14〜； 17のいずれ力、 1項記載の濁り抑制方法。

[19] 目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、請求項 13〜； 18のいずれ力、 1項記載の濁り抑制方法。

[20] 糖タンパク質力天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、請求項 19記載の濁り抑制方法。

[21] 目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物が水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。

[22] 目的のタンパク質に加え、セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物とセリンが水溶液中に共存したことを特徴とする、濁り抑制組成物。

[23] セリシンおよび/またはその加水分解物もしくはその同等物力水溶液中に終濃度

0. 01〜； 1 % (w/v)含有することを特徴とする、請求項 21または 22記載の濁り抑制組成物。

[24] セリシンおよび/またはその加水分解物が繭糸又は生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、請求項 2；!〜 23のいずれ力、 1項記載の濁り抑制組成物。

[25] セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、請求項 2；!〜 23のいずれ力、 1項記載の濁り抑制組成物。

[26] セリンを、水溶液中に終濃度 0. 01〜； 10% (w/v)含有させることを特徴とする、請求項 22〜25のいずれ力、 1項記載の濁り抑制組成物。

[27] 目的のタンパク質力乳タンパク質、植物貯蔵タンパク質、硬タンパク質、糖タンパク質から選ばれたものであることを特徴とする、請求項 2；!〜 26のいずれ力、 1項記載の濁り抑制組成物。

[28] 糖タンパク質力天然型タンパク質がその表面で受ける修飾を受けていない組換え型タンパク質であることを特徴とする、請求項 27記載の濁り抑制組成物。

[29] 請求項 2；!〜 28のいずれ力、 1項記載の濁り抑制組成物を含む診断用キット。

[30] 請求項 2；!〜 28のいずれ力、 1項記載の濁り抑制組成物を含むバイオセンサー。