JP2005272690A - 生体適合性をもつ多孔質体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】環境や生体に対する安全性が高く、実用に耐え得る強度を有し、機能性材料として好適に用いることが可能な新規多孔質体を提供する。
【解決手段】平均分子量が３００００〜４０００００であるセリシンからなり、５０％圧縮後の回復率が１０〜１００％であり、好ましくは細孔径が０．１〜１０００μｍであり、空孔率が７０〜９９％である多孔質体。
【選択図】なし

Description

本発明は生体適合性をもつ多孔質体およびその製造方法に関する。より詳しくは、環境や生体に対する安全性が高く、かつ実用に耐え得る強度を有するセリシンの多孔質体、およびその製造方法に関するものである。

蚕から吐き出される繭糸は、結晶性の高いフィブロインと、非結晶性のセリシンという２種類の蛋白質から構成され、セリシンは２本のフィブロインを取り囲むように膠着して存在している。このうち、精練によってセリシンを取り除いた、フィブロインを主体とする繊維が、いわゆる絹糸であり、従来、セリシンは、何ら価値のないものとして破棄されてきた。

しかしながら、近年、セリシンが保湿性、抗酸化作用、細胞保護作用、蛋白質保護作用などの性質を有し、生体適合性に優れた材料であることが明らかになるに従い、セリシンを医用材料や化粧用材料など機能性材料として利用しようとする試みがさかんに行われるようになった。

例えば特許文献１には、セリシンをホルムアルデヒドと熱反応型水溶性ウレタン樹脂で架橋薄膜化した架橋高分子分離膜が記載されている。特許文献２には、セリシンなどの蛋白質とアクリロニトリルを乳化重合させた蛋白質含有合成高分子材料、および、セリシンなどの蛋白質と水溶性エポキシ系化合物と架橋剤を互いに結合・架橋させて三次元網状構造とした蛋白質含有合成高分子材料が記載されている。特許文献３には、セリシンとポリビニルアルコールとのブレンド物を、架橋剤により架橋不溶化した高分子含水ゲルが記載されている。特許文献４には、セリシンとポリビニルアルコール系の水溶性樹脂からなる、溶融熱成形可能な複合樹脂が記載されている。

しかしながら、これらはいずれも、合成高分子材料を用いてセリシンを難溶化あるいは不溶化したり、合成高分子材料にわずかながらのセリシンの性質を付与したりするものであり、環境や生体に対する安全性が十分でなく、機能性材料、特に医用材料として用いるには限界があった。

これに対し、例えば特許文献５には、絹蛋白質とコラーゲンの混合水性溶液または混合水性分散液を蒸発乾燥し、固化して得られる絹蛋白質／コラーゲン複合体が記載されている。特許文献６には、絹蛋白質水溶液を不活性雰囲気条件で乾燥して得られる絹蛋白質キャストフィルムが記載されている。そして、絹蛋白質はセリシンおよびフィブロインの少なくともいずれかであると説明されている。

これらは確かに、前述の安全性の問題を一見克服するものであるが、特許文献５に言及すれば、市場にあるコラーゲンの多くは牛皮革に由来するものであり、狂牛病などの問題が取り沙汰される昨今、その使用が控えられる傾向にある。さらに、特許文献５および特許文献６において絹蛋白質は、実質上、フィブロイン単独、あるいはフィブロインとセリシンの混合物であり、絹蛋白質としてセリシンを単独で用いても、実用に耐え得る強度を有する複合体、あるいはキャストフィルムを得ることはできなかった。

またセリシンの粉末を取得する等の目的でセリシンを凍結乾燥処理等に供することも行われている。しかしセリシン単独を多孔質体の骨格構成成分として用いて実用に耐える構造安定性をもつ多孔質体とする試みは未だなされていない。

特開平３−２８４３３７号公報 特開平６−８０７４１号公報 特開２００１−１０６７９４号公報 特開２００２−２０１３６３号公報 特開平１１−２２８８３７号公報 特開２００３−１９２８０７号公報

本発明はこのような現状に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、環境や生体に対する安全性が高く、かつ実用に耐え得る強度を有し、機能性材料として好適に用いることが可能なセリシンの多孔質体、およびその製造方法を提供することである。

すなわち、本発明は、第１に多孔質体の骨格構成成分が平均分子量が３００００〜４０００００であるセリシンからなり、５０％圧縮後の回復率が１０〜１００％であることを特徴とする多孔質体である。
本発明の多孔質体は、細孔径が０．１〜１０００μｍであることが好ましく、また空孔率が７０〜９９％であることが好ましい。
本発明の多孔質体は必要に応じ機能性物質を固定化した状態で存在させることができる。
本発明は、第２に、平均分子量が３００００〜４０００００であるセリシンを含む水溶液をゲル化後、凍結し、次いで融解させることを特徴とする、多孔質体の製造方法である。

本発明によれば、環境や生体に対して悪影響を及ぼす虞のある化合物を用いることなく、基本的にはセリシン単独から、実用に耐え得る強度を有する多孔質体を提供することができる。また、この多孔質体に機能性物質を含有させることにより、多孔質体に新たな機能性を付与することができるとともに、含有させた機能性物質を物理的に安定化して固定することができ、しかも凍結などのストレスにより起こり得る機能性物質の失活を抑制することができる。本発明により提供される多孔質体は、医用材料や化粧用材料、食品材料、環境適合材料などの機能性材料、具体的には、再生医工学素材や細胞マトリックス、バイオセンサー、バイオリアクター、保湿材、保温材、微生物固定担体、医薬品の貼付剤、土壌改良剤などとして、好適に用いることができる。

以下、本発明について詳細に説明する。
多孔質体を構成するセリシンの平均分子量は、３００００〜４０００００であることが要求される。平均分子量が３００００未満であると、実用的強度を有するセリシン多孔質体を構成することができない。平均分子量が４０００００を越えると水に溶け難く操作性が悪い。より好ましい平均分子量は４００００〜２０００００であり、さらに好ましくは６００００〜１０００００である。なお、本発明におけるセリシンの分子量あるいは平均分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した値である。本発明において用いられるセリシンは、分子量が３００００〜４０００００のセリシンが７０〜１００％を占めることが好ましく、より好ましくは９５〜１００％、さらに好ましくは９９〜１００％である。またセリシンの純度は、９０〜１００％であることが好ましく、より好ましくは９５〜１００％、さらに好ましく９９〜１００％である。ここで、純度とは、分離精製して得られるセリシン水溶液に含まれる固形分、あるいは乾燥して得られる固形分に占めるセリシンの割合をいう。これら固形分は、フィブロインなどの蛋白質やアミノ酸、糖、脂質、核酸、色素などの繭あるいは蚕由来成分の他、塩などの不純物をわずかに含むものである。

本発明において用いられるセリシンは、平均分子量が３００００〜４０００００である限り、天然物由来のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、いずれのものであっても包含される。したがって、セリシンは化学合成されたものであっても、または遺伝子工学的手段により得られたものであってもよいが、本発明においてセリシンは、天然物由来のものであることが好ましい。天然物由来であると、生体への安全性が高く、また比較的容易に調製できるため、有利である。また、本発明においてセリシンという場合、セリシン蛋白質そのものの他に、該蛋白質の加水分解物をも包含するものとする。

本発明の好ましい態様によれば、セリシンは、蚕が吐出する繭糸、または生糸から溶媒によって抽出したもの、あるいは物理的に剥離したものが用いられる。あるいは、蚕体内より取り出した絹糸腺内のセリシンを用いることも可能である。なおここで繭とは蚕繭のことをいい、また生糸とは蚕繭を温湯に浸して蚕繭から繰り出して得られる繭糸のことである。

本発明において用いられる蚕としては、人間に飼育されて生育する家蚕、自然環境の中で生育する野蚕のいずれも使用可能であり、特別な種類に限定されない。繭は蛹が入っている状態のもの、または繭の一部を切開して蛹を取り出した状態のもの、もしくは粉砕処理したもの、また生糸についても製糸したもの、織り、編みなどにより布帛化したもの、縫製したもの、もしくは粉砕処理したものなどいずれも使用可能である。

上記材料からセリシンを得るための抽出溶媒としては、水、尿素水溶液、含水アルコールなどの親水性溶媒が挙げられる。例えば、家蚕繭をその１０〜３０倍量の水で煮沸処理することにより、セリシンを水中に溶出させる。このとき、必要に応じて電気分解した水や、酸、アルカリまたは酵素を併用してセリシンを部分加水分解させてもよい。さらに、加圧下で処理してもよい。前述のように、本発明において用いられるセリシンの平均分子量は３００００〜４０００００であることが要求され、このようなセリシンを効率よく抽出するには、アルカリなどを含まない熱水にて抽出することが好ましい。熱水抽出によれば、セリシンを比較的高分子量のままで抽出することができ、また、その抽出液はアルカリなどを含まないため、分画、脱塩などの操作は特に不要であり、夾雑物を除去した後は、必要に応じて濃縮後、そのままセリシン水溶液として、後述する多孔質体の製造に供することができる。

セリシンを含む抽出液から夾雑物を除去するには、ろ過、遠心分離など公知の方法を採用することができる。

さらに、必要に応じて、得られた抽出液を分離精製する。ここで用いられる分離精製法は、特に限定されるものではなく、例えば塩析、有機溶媒沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、逆浸透、限外ろ過、超遠心分離、電気透析などの公知の方法を単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。さらに、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより乾燥してもよい。これらの工程の条件を調節することにより平均分子量３００００〜４０００００のセリシンが取得される。

本発明の多孔質体の製造において用いられるセリシン水溶液は、上記抽出液、あるいはその分離精製物であることができる。また、乾燥して得られる固体セリシンを、水に溶解して調製したものであってもよい。後述するように、セリシン水溶液は、ゲル化特性を満足して調製される限り、ある温度以下になるとゲル化するため、セリシン水溶液が液体としての性状を保つには、それを上まわる温度に維持しなければならない。ただし、たとえゲル化しても、加温により容易に液体としての性状を回復することができる。なお、ゲル化温度は、セリシンの分子量や濃度によって大きく異なるため、一概に特定することはできない。

本発明の多孔質体は、上記セリシン水溶液から、セリシンを多孔質状に析出させて得られる構造体であって、５０％圧縮後の回復率は１０〜１００％であることを特徴とするものである。５０％圧縮後の回復率が１０％未満であると、強度に乏しく実用に耐えることができない。より好ましい回復率は２０〜１００％である。

本発明の多孔質体の細孔径は、０．１〜１００００μｍの範囲であることができ、実用的強度を有する限り、そのいずれも機能性材料として使用可能であるが、好ましくは細孔径０．１〜１０００μｍの多孔質体である。細孔径が０．１μｍ未満であると十分な通水性が得られない。細孔径が１０００μｍを越えると機能性物質を安定に固定できなくなる。より好ましい細孔径は１〜５００μｍである。

本発明の多孔質体の空孔率は、１〜９９．５％の範囲であることができ、実用的強度を有する限り、そのいずれも機能性材料として使用可能であるが、好ましくは空孔率７０〜９９％の多孔質体である。空孔率が７０％未満であると十分な通水性が得られない。空孔率が９９％を越えると実用的強度を得ることができない。より好ましい空孔率は８５〜９８％である。

なお、本発明でいう多孔質体の空孔率とは、多孔質体を水に浸漬し、細孔部に水を最大限保持させた状態の多孔質体の重量（Ａ）と、５０℃で６時間乾燥させた後の多孔質体の重量（Ｂ）を測定し、次式により算出したものである。
空孔率（％）＝［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００

本発明の多孔質体は、水への溶解性が低いため、細孔部に水を保持させた状態で使用することが可能である。多孔質体の水分保持量は、用途に応じて適宜設定すればよい。

次に、本発明の多孔質体の製造方法について説明する。
本発明の多孔質体は、平均分子量が３００００〜４０００００であるセリシンを含む水溶液から、セリシンを多孔質状に析出させることにより製造することができる。好ましい態様によれば、セリシン水溶液をゲル化後、凍結し、次いで融解させる方法によることができる。

この方法において特徴的であるのは、セリシン水溶液を、一旦ゲル化し、しかる後に、凍結、融解させることである。セリシン水溶液をゲル化工程を経ることなく、凍結、融解して得られる多孔質体は、非常に脆く、その構造を維持することができない。得られる多孔質体の細孔径や空孔率の前記した好ましい範囲への制御は、セリシン水溶液の濃度や、ゲル化時の空気量、セリシンゲル中の気泡サイズ、凍結時の冷却速度などを制御することにより、行うことができる。

セリシン水溶液のゲル化は、目的とする形状の多孔質体を得るに適当な容器中、セリシン水溶液を冷却および／または濃縮し、ゲル化温度以下に維持することにより達成される。このとき、セリシン水溶液を予め０．５〜２０重量％の濃度に調整しておくと、セリシン水溶液を冷却するだけでゲル化させることができ、効率的である。セリシン濃度が０．５重量％未満であると、０℃まで冷却してもゲル化せず、セリシン水溶液がそのまま凍結してしまい、目的とする多孔質体を析出させることができない。また、セリシン濃度が２０重量％を越えると、高温でゲル化するため操作性が悪く、目的とする形状に制御し難い。より好ましいセリシン濃度は、１〜１０重量％である。目的とする形状は特に制限されず、シート状、円柱形、立方体、球形など用途に応じた適宜の形状を選択可能である。

また、セリシン水溶液を濃縮することにより、ゲル化温度を上昇させることができるため、これによってセリシン水溶液をゲル化させることもできる。セリシン水溶液を濃縮する方法としては、限外濾過膜や、エバポレーターを用いた方法などを挙げることができる。
セリシン水溶液のゲル化に要する時間は、セリシン水溶液が十分にゲル化する時間であり、セリシン水溶液の濃度や液量、容器の形状や材質、冷却温度や冷却方法（空気中、冷媒中など）などによって異なる。例えば、熱水抽出により得られた５重量％のセリシン水溶液を、プラスチック容器中、室温（約２５℃）に放置して冷却しゲル化させる場合、直径１ｃｍ、高さ１０ｃｍの円柱形（約８ｃｍ^３）にセリシン水溶液をゲル化させるのに要する時間は０．５〜１時間であり、直径９ｃｍ、高さ１５ｃｍの円柱形（約９５４ｃｍ^３）では１〜２時間であり、短辺１０ｃｍ、長辺１００ｃｍ、高さ１ｃｍのシート状（１０００ｃｍ^３）では０．５〜１時間であるが、それを越える時間放置しても、特段の問題は生じない。

次いで、セリシンゲルを０℃より低い温度に冷却し、凍結させる。冷却により、セリシンゲルに含まれる水が凍結し、氷の結晶が形成されるとともに、セリシンが多孔質状に析出する。このように析出した多孔質体が、実用的強度を有する理由は定かでないが、氷結晶の成長により、セリシンゲル中に存在するセリシン蛋白質が変性し、セリシン分子間に新たな結合が形成されるためと推定される。

凍結される温度（以下、凍結温度と称する）は特に限定されるものでなく、セリシンゲルが凍結する温度であればいかなる温度であっても構わないが、実用的には、通常のフリーザーを用いて−８０〜−３℃で凍結させるのがよい。通常のフリーザーで冷却可能な温度が−８０℃程度である。また、凍結温度が−３℃より高いと、凍結に長時間を要し、セリシン濃度が高いものでは凍結が起こらない。より好ましい凍結温度は−８０〜−３０℃である。
凍結の際には、ドライアイス−メチルアルコール、液体窒素など公知の冷却剤を用いてもよい。

セリシンゲルの凍結に要する時間は、セリシンゲル中の水が十分に凍結し、セリシンが析出する時間であればよく、セリシンゲルの濃度や容量、容器の形状や材質、冷却温度や冷却方法（空気中、冷媒中など）などによって異なる。例えば、プラスチック容器中、室温（約２５℃）でゲル化させたセリシンゲルを、−３０℃のフリーザー中に放置して冷却し凍結させる場合、直径１ｃｍ、高さ１０ｃｍの円柱形（約８ｃｍ^３）では０．５〜２時間を要し、直径９ｃｍ、高さ１５ｃｍの円柱形（約９５４ｃｍ^３）では３〜６時間を要し、短辺１０ｃｍ、長辺１００ｃｍ、高さ１ｃｍのシート状（１０００ｃｍ^３）では０．５〜２時間を要するが、それを越える時間放置しても、特段の問題は生じない。
凍結の際の冷却速度を制御することにより、前記したように、多孔質体の細孔径を調整することができる。例えば、液体窒素などを用いて急速冷却すると、−３０℃のフリーザーを用いて緩慢冷却した場合よりも細孔径の小さなセリシン多孔質体を得ることができる。

次いで、凍結させたセリシンゲル（この段階で、その内部にはセリシン骨格からなる多孔質体が、細孔部に氷結晶を保持した状態で析出している）を０℃以上に放置することにより、融解させる。融解させる温度（以下、融解温度と称する）は特に限定されるものではなく、凍結セリシンゲルが融解する温度であればいかなる温度であっても構わないが、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは４〜４０℃である。融解温度が０℃より低いと、融解に長時間を要し、セリシン濃度が低いものでは融解が起こらない。融解温度が８０℃を越えると、多孔質体は水に溶解してしまう。凍結させたセリシンゲルの融解に要する時間は、凍結セリシンゲル中の氷が十分に融解する時間であればよく、セリシンゲルの濃度や容量、容器の形状や材質、融解温度や融解方法（空気中、溶媒中など）などによって異なる。例えば、プラスチック容器中、−３０℃で凍結させたセリシンゲルを、室温（約２５℃）に放置して融解させる場合、直径１ｃｍ、高さ１０ｃｍの円柱形（約８ｃｍ^３）では１〜２時間を要し、直径９ｃｍ、高さ１５ｃｍの円柱形（約９５４ｃｍ^３）では６〜１２時間を要し、短辺１０ｃｍ、長辺１００ｃｍ、高さ１ｃｍのシート状（１０００ｃｍ^３）では１〜２時間を要するが、それを越える時間放置しても、特段の問題は生じない。

かくして、細孔部に多量の水を保持した状態の、多孔質体を得ることができる。この多孔質体を圧縮したり、あるいはタオルや吸水性物質を接触させたりすることにより、細孔部の水を除去することができる。前述の通り、多孔質体の水分保持量は、用途に応じて適宜設定すればよい。なお、水分保持量を適宜調整後、多孔質体を加熱し、溶解させることにより、濃縮されたセリシン水溶液を調製することができる。

多孔質体は乾燥により、あるいは、水分保持量が低くなるに従い、収縮し、空孔率が低下するとともに、柔軟性が損なわれる傾向にある。多孔質体中の水をメタノールやエタノールなどのアルコールで置換することにより乾燥による収縮を抑えることが可能であり、空孔率が高く、溶媒保持量の低い多孔質体が求められる場合は、このように処理することが好ましい。

このようにして得られる多孔質体の５０％圧縮後の回復率は、通常、１０〜１００％の範囲内にあり、前記条件を満足するものである。
本発明の多孔質体は、柔軟でありながらも、弾性に富み、堅く握りしめても、一時的には変形するが、圧力から解放されると形状を回復することができる。さらに、水への溶解性が低いなど、機能性材料として実用に耐え得る強度を有したものである。

また、多孔質体の細孔径や空孔率は、前記したように、セリシン水溶液の濃度やゲル化時の空気量、セリシンゲル中の気泡サイズ、凍結時の冷却速度などを制御することにより、調整することができるが、多孔質体析出後の圧縮や収縮による調整も可能である。

本発明の多孔質体は、各種機能性物質を物理的に安定化して固定することができる。機能性物質としては、例えば、抗体や酵素などのポリペプチド、核酸、多糖類、ビタミンなどの生体由来成分を挙げることができる。これらが２種類以上組み合わされていてもよい。
本発明の多孔質体は、凍結などのストレスにより起こり得る機能性物質の失活を抑制することができるため、例えば凍結感受性の高い酵素を固定させる場合にも有効である。

このような機能性物質は、セリシン水溶液を調製する際、セリシン水溶液に溶解あるいは分散させることにより、多孔質体に均一に固定させることができる。

さらに、本発明の多孔質体は、繊維や樹脂成形体などの構造体との複合体であることもできる。このような複合体は、構造体をセリシン水溶液に浸漬させた状態で、セリシンを析出させることにより、容易に調製することができる。複合体に機能性物質を固定させてもよいことは言うまでもない。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

蛹を除去した家蚕繭１００ｇをイオン交換水１リットルに浸漬し、オートクレーブを用いて１０５℃で３０分間加熱処理した。得られた抽出液をガラスフィルター（東洋濾紙（株）製、ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＧＡ−１００）でろ過して夾雑物を除去し、約１重量％のセリシン水溶液を得た。
なお、得られたセリシンの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した結果、平均分子量は約１０００００であった。

得られたセリシン水溶液１．０ｍｌをマイクロチューブ（１．５ｍｌ）に注ぎ、室温（約２５℃）で１時間静置してセリシン水溶液をゲル化させた後、−３０℃で１５時間静置してセリシンゲルを凍結させた。次いで室温で６時間静置して融解させ、マイクロチューブから取り出して、細孔部に水を保持した状態の、空孔率約９７％の多孔質体を得た。

得られた多孔質体をエタノールに浸漬し水を置換した後、乾燥し、電子顕微鏡で観察した結果、１０〜４００μｍ（平均孔径１１０μｍ）の細孔が形成されていた。電子顕微鏡写真を図１に示す。

また、細孔部に水を保持した状態の多孔質体について、溶解性（温度安定性、ｐＨ安定性）を評価した結果を表１および表２に示す。評価方法は次の通りである。

溶解性（温度安定性）
多孔質体をｐＨ７．０の５０ｍＭ燐酸緩衝液０．５ｍｌに浸漬して、４℃、２５℃、３７℃、５０℃、６０℃、８０℃の各温度で１時間静置した。浸漬液を０．４５μｍシリンジフィルター（旭テクノグラス（株）製）でろ過して夾雑物を除いた後、ＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ^ＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）により、浸漬液の蛋白質濃度を測定した。加熱により多孔質体を完全溶解させたときの蛋白質濃度を溶解率１００％として、多孔質体の溶解率を求めた。

溶解性（ｐＨ安定性）
多孔質体をｐＨ１．７、ｐＨ４．５の５０ｍＭ塩酸緩衝液０．５ｍｌに、また、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０の５０ｍＭ燐酸緩衝液０．５ｍｌにそれぞれ浸漬して、２５℃で１時間静置した。浸漬液を０．４５μｍシリンジフィルター（旭テクノガラス（株）製）でろ過して夾雑物を除いた後、ＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ^ＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）により、浸漬液の蛋白質濃度を測定した。加熱により多孔質体を完全溶解させたときの蛋白質濃度を溶解率１００％として、多孔質体の溶解率を求めた。

実施例１で得られた約１重量％のセリシン水溶液２５ｍｌをコニカル底プラスチックチューブ（５０ｍｌ）に注ぎ、これ以降は実施例１と同様にして、細孔部に水を保持した状態の多孔質体を得た。得られた多孔質体を絞って水分を減少させ、加熱して多孔質体を再溶解させた後、イオン交換水を加えて容量を１０ｍｌに調整し、セリシン濃度約２．５重量％の水溶液を得た。

このようにして得られた約２．５重量％のセリシン水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、細孔部に水を保持した状態の、空孔率約９５％の多孔質体を得た。
得られた多孔質体について、実施例１と同様にして、溶解性（温度安定性、ｐＨ安定性）を評価した結果を表１および表２に示す。

実施例１で得られた約１重量％のセリシン水溶液６４０ｍｌをビーカー（１リットル）に注ぎ、これ以降は実施例１と同様にして、細孔部に水を保持した状態の多孔質体を得た。得られた多孔質体を絞って水分を減少させ、加熱してセリシン多孔質体を再溶解させた後、イオン交換水を加えて液量を８０ｍｌに調整し、セリシン濃度約８重量％の水溶液を得た。さらに、これを希釈して、セリシン濃度約２重量％の水溶液４０ｍｌ、同じく約６重量％の水溶液４０ｍｌを得た。

このようにして得られた約２重量％、約６重量％、約８重量％のセリシン水溶液２５ｍｌをそれぞれコニカル底プラスチックチューブ（５０ｍｌ）に注ぎ、これ以降は実施例１と同様にして、細孔部に水を保持した状態の多孔質体を得た。多孔質体の空孔率は、それぞれ約９６％、約８９％、約８６％であった。
得られた多孔質体をエタノールに浸漬し、細孔部にエタノールを保持した状態の多孔質体について、５０％圧縮後の回復率を評価した結果を表３に示す。評価方法は次の通りである。

５０％圧縮後の回復率
半径２．４ｃｍ、高さ３．０ｃｍの円柱形の多孔質体を採取し、オートグラフを用いて、圧縮速度３０ｍｍ／ｍｉｎで高さ比５０％まで圧縮した後、同じ速度で徐圧する。徐圧後に多孔質体の高さを測定し（このときの高さをＨとする）、次式により回復率を求めた。
回復率（％）＝［（Ｈ−１．５）／１．５］×１００

比較例１
蛹を除去した家蚕繭１ｋｇを、０．２重量％炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ１１〜１２）５０リットルに浸漬し、９５℃で２時間加熱処理することにより、セリシンを加水分解させ、抽出した（以下、セリシン加水分解物を、単に、セリシンと称する場合もある）。得られた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターでろ液して夾雑物を除去した後、ろ液を逆浸透膜により脱塩し、約０．２重量％の無色透明セリシン水溶液を得た。次いで、この水溶液をエバポレーターを用いてセリシン濃度が約２重量％になるまで濃縮した後、凍結乾燥処理を行って、セリシン加水分解物の粉体１００ｇを得た。なお、得られたセリシン加水分解物の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した結果、平均分子量は約２００００であった。

このセリシン粉体をイオン交換水に溶解して、２０重量％のセリシン水溶液を得た。セリシン水溶液１．０ｍｌをマイクロチューブ（１．５ｍｌ）に注ぎ、室温（約２５℃）で１時間静置したところ、セリシン水溶液のゲル化は起こらなかった。その後、−３０℃で１５時間静置してセリシン水溶液を凍結させた。次いで室温で６時間静置して融解させたが、目的とする多孔質体の析出は認められなかった。

チロシナーゼを多孔質体に固定させた。
すなわち、実施例２で得られた約２.５重量％のセリシン水溶液１．０ｍｌに、マッシュルーム由来チロシナーゼ粉体（Ｓｉｇｍａ社製）１００ｕｎｉｔｓを混合したものを空カラム（２．５ｍｌ）に注ぎ、氷水中で１時間静置して混合水溶液をゲル化させた後、−３０℃で１５時間静置して混合ゲルを凍結させた。次いで４℃で６時間静置して融解させ、チロシナーゼ固定多孔質体が充填されたカラムを得た。得られたカラムを、ｐＨ７．０の５０ｍＭ燐酸緩衝液１０ｍｌで洗浄し、未固定のチロシナーゼを除去し、評価試験１、２に供した。

評価試験１
カラムに、基質として０．１重量％Ｄ−チロシン水溶液１.０ｍｌをカラム上部より添加し、室温（約２５℃）で１時間反応させた後、カラム上部より加圧して、カラム下部より反応液を回収した。
比較対照として、チロシナーゼ１００ｕｎｉｔｓをｐＨ７．０の５０ｍＭ燐酸緩衝液１．０ｍｌに溶解したものを、０．１重量％Ｄ−チロシン水溶液１．０ｍｌに添加し、室温で１時間反応させた。
チロシナーゼの活性は、生成したドーパキノンの量を４７５ｎｍにおける吸光度を測定することにより求めた。結果を表４に示す。

表３から明らかなように、本発明のセリシン多孔質体は、チロシナーゼを失活させることなく固定することができた。

評価試験２
カラムに、基質として０．１重量％Ｄ−チロシン水溶液１００ｍｌをカラム上部より流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで浸透させ、カラム下部より反応液を５ｍｌずつ回収した。酵素反応は室温（約２５℃）にて行った。
透過開始〜５ｍｌ、４５〜５０ｍｌ、９５〜１００ｍｌで回収された反応液各５ｍｌについて、評価試験１と同様にしてチロシナーゼの活性を求め、透過開始直後の活性を１００％として、活性維持率を求めた。結果を表５に示す。

表５から明らかなように、本発明の多孔質体は、基質溶液１００ｍｌ透過後も、９０％以上の活性を維持した状態でチロシナーゼを固定していた。

本発明の多孔質体の電子顕微鏡写真である。

Claims (5)

1. 多孔質体の骨格構成成分が平均分子量が３００００〜４０００００であるセリシンからなり、５０％圧縮後の回復率が１０〜１００％であることを特徴とする多孔質体。
2. 細孔径が０．１〜１０００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の多孔質体。
3. 空孔率が７０〜９９％であることを特徴とする請求項１または２に記載の多孔質体。
4. 機能性物質が固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の多孔質体。
5. 平均分子量が３００００〜４０００００であるセリシンを含む水溶液をゲル化後、凍結し、次いで融解させることを特徴とする多孔質体の製造方法。

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